Avaliação de atividades biológicas dos extratos de Rosmarinus officinalis L. (alecrim) e Thymus vulgaris L. (tomilho)

Pós-graduação em Biopatologia Bucal - ICT

Atividade antimicrobiana, anti-inflamatória, citotoxicidade e genotoxicidade do extrato glicólico de Betula pendula Roth (Bétula)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Leishmaniose visceral e o sistema nervoso central: inflamação nas infecções natural canina e experimental em camundongos: Guilherme Dias de Melo. -

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Ética da pesquisa em modelos animais

A utilização de animais em experimentos científicos é descrita desde o século V a.C. Avanços científicos na área da saúde são atribuídos a modelos animais. O status moral dos animais sempre foi debatido. OBJETIVOS: Este artigo visa à revisão histórica e resumo da legislação atual, para orientar pesquisadores ao utilizar modelos animais na pesquisa em otorrinolaringologia. MATERIAL E MÉTODOS: Pesquisa na base de dados Medline. RESULTADOS: no Brasil, por muitos anos não havia regulamentação para o uso de animais em experimentação. Eram seguidas normas de organizações nacionais e internacionais. Recentemente, foi sancionada a lei nº 11.794/08, que estabelece procedimentos para o uso científico de animais. Na otorrinolaringologia, os estudos com laringe utilizaram coelho, porco, cachorro, cobaias (Cavia porcellus) e camundongo; estudos para face coelho, rato e cachorro; rinoplastia com coelho; e orelha interna com ratos e cobaias (albinas). CONCLUSÕES: Os pesquisadores envolvidos em trabalhos científicos com animais devem conhecer os princípios da lei nº 11.794/08 e pesquisar quais animais são apropriados para cada subárea estudada seus modelos com maior aplicabilidade. Os otorrinolaringologistas, especialmente aqueles que se dedicam à pesquisa, necessitam estar sempre atentos para o respeito às regras éticas de utilização de animais em seus estudos.

Changes in CREB activation in the prefrontal cortex and hippocampus blunt ethanol-induced behavioral sensitization in adolescent mice

Drug dependence is a major health problem in adults and has been recognized as a significant problem in adolescents. We previously demonstrated that repeated treatment with a behaviorally sensitizing dose of ethanol in adult mice induced tolerance or no sensitization in adolescents and that repeated ethanol-treated adolescents expressed lower Fos and Egr-1 expression than adult mice in the prefrontal cortex (PFC). In the present work, we investigated the effects of acute and repeated ethanol administration on cyclic adenosine monophosphate (cAMP) response element-binding protein (CREB) DNA-binding activity using the electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and the phosphorylated CREB (pCREB)/CREB ratio using immunoblotting in both the PFC and hippocampus in adolescent and adult mice. Adult mice exhibited typical locomotor sensitization after 15 days of daily treatment with 2.0 g/kg ethanol, whereas adolescent mice did not exhibit sensitization. Overall, adolescent mice displayed lower CREB binding activity in the PFC compared with adult mice, whereas opposite effects were observed in the hippocampus. The present results indicate that ethanol exposure induces significant and differential neuroadaptive changes in CREB DNA-binding activity in the PFC and hippocampus in adolescent mice compared with adult mice. These differential molecular changes may contribute to the blunted ethanol-induced behavioral sensitization observed in adolescent mice.

Investigação da atividade apoptótica na abertura luminal dos ductos das glândulas salivares: análise comparativa entre modelo animal e humano

As glândulas salivares são estruturas essenciais para a manutenção da homeostase da cavidade oral pela síntese e secreção do fluido salivar. A disfunção ou perda permanente das glândulas salivares causadas por radioterapia, doenças inflamatórias ou desordens congênitas elevam principalmente o risco de infecções da mucosa oral e de estruturas dentárias, além de potencialmente prejudicar funções fisiológicas como fala, mastigação e paladar, diretamente interferindo na qualidade de vida dos indivíduos afetados. Os tratamentos atualmente disponíveis são apenas paliativos, ressaltando a necessidade de se compreender melhor os processos embriogênicos a fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas capazes de regenerar as glândulas salivares. O princípio da formação das glândulas salivares baseia-se na coordenação de diversos processos morfogenéticos, e este trabalho foca particularmente em investigar a formação do espaço luminal do sistema de ductos, uma vez que a adequada abertura dos lumens é um processo essencial para a secreção salivar. Relata-se que a remoção das células centrais dos cordões sólidos epiteliais por morte celular apoptótica é o principal mecanismo de abertura do espaço luminal dos futuros ductos glandulares em camundongos. Porém, pouco se sabe sobre o controle temporal da apoptose durante o desenvolvimento glandular e sobre seu comportamento em glândulas salivares humanas. Neste trabalho, o perfil de expressão de diversas proteínas envolvidas na cascata apoptótica em glândulas salivares fetais humanas foi analisado de acordo com cada estágio morfogenético por imunoistoquímica (Bax, Bak, Bad, Bid, Bcl-2, Bcl-x, Bcl-xL, caspase-3 clivada, caspases-6, -7 e -9, apaf-1, survivina e citocromo c). As análises semi-qualitativas resultaram em negatividade apenas para as proteínas Bcl-2, Bad, Bid e caspase-3 clivada em todas as fases de desenvolvimento. A expressão nuclear de Bax e Bak foi identificada em presumidos espaços luminais em estágios precoces, enquanto Bcl-xL foi o fator antiapoptótico da família Bcl-2 que exibiu expressão nuclear mais importante. Caspases-6, -7 e -9 foram positivas em todas as fases, e a ausência de caspase-3 clivada sugere caspase-7 como principal caspase efetora da apoptose em desenvolvimento de glândulas salivares humanas. Ambos os componentes do complexo apoptossomo foram positivos durante o desenvolvimento glandular, e o inibidor survivina demonstrou mais positividade nuclear em estágios mais avançados. Ao observar a expressão de reguladores apoptóticos durante o desenvolvimento glandular humano, foram realizados experimentos funcionais com culturas de tecido glandular de camundongos para avaliar o papel das caspases durante a formação desta estrutura. Inicialmente detectou-se a atividade apoptótica em glândulas salivares de camundongos albinos no centro dos cordões epiteliais primários a partir de estágios precoces de desenvolvimento através de TUNEL e caspase-3 clivada. A partir disso, foi realizada a inibição apoptótica funcional in vitro durante o mesmo período, que resultou em ductos significativamente mais amplos e em defeitos morfológicos importantes nas estruturas luminal e acinar. Este trabalho evidenciou portanto atividade apoptótica durante a formação de glândulas salivares humanas e de camundongo, expressando-se em fases mais precoces do que reportadas anteriormente. Além disso, a ausência de Bad e Bid indica que a via intrínseca está mais ativa que a extrínseca, e distintos perfis de expressão da maioria das moléculas sugere adicionais funções não-apoptóticas durante a morfogênese glandular.

Influência da reutilização na biocompatibilidade de materiais médico-hospitalares de uso único

A prática da reutilização de produtos médico-hospitalares de uso único vem sendo aplicada desde meados da década de setenta. A principal razão que tem contribuído para disseminação desta conduta pelas instituições hospitalares radicadas tanto nos países em desenvolvimento como naqueles considerados ricos, tem sido a aparente economia de custos. Apesar dos riscos relacionados com a prática da reutilização, como reações pirogênicas, danos ocasionados por bactérias consideradas patogênicas em pacientes imunologicamente comprometidos, danos na integridade fisica dos produtos, assim como aumento do período de permanência dos pacientes no hospital, têm despertado o interesse em avaliar aspectos fisicos e biológicos dos produtos médico-hospitalares reutilizados. Baseando-se nestas considerações foram aplicados desafios com esporos de Bacillus Subtilis varo niger ATCC 9372 e endotoxina bacteriana E. coli 055:B5. Os produtos desafiados foram cateteres intravenosos, torneira três vias e tubos de traqueostomia. A possível presença microbiana foi investigada após contaminação intencional dos esporos de B. Subtillis (107 ufc/unid.) com submissão das unidades contaminadas à limpeza e posterior esterilização, utilizando óxido de etileno/CFC na proporção 12:88. Os ciclos de reprocessamentos simulados de produtos médico-hospitalares consistiram de contaminação de cada unidade teste com carga microbiana, lavagem com detergente enzimático, secagem e esterilização. Ao término de cada ciclo de reprocessamento foram separadas unidades representativas para avaliação por contagem microbiana (pour plate), testes de esterilidade por inoculação direta e indireta, citotoxidade por cultura de células e microscopia eletrônica de varredura. A eficiência da esterilidade foi avaliada tanto por contagem microbiana como pelos testes de esterilidade, que resultaram em níveis microbianos de 103 ufc/unid. e detecção de contaminação até o 6° ciclo de reprocessamento nos cateteres intravenosos, tubos de traqueostomia e torneiras três vias. A segurança dos reprocessamentos dos produtos médico-hospitalares foi avaliada pela cultura de células de fibroblastos de camundongo (NCTC clone 929), as quais não apresentaram toxicidade. Entretanto, os resultados obtidos durante microscopia eletrônica de varredura comprovaram presença de carga microbiana após 10° ciclo de reprocessamento, assim como danos na superficie polimérica. Durante desafio com endotoxina bacteriana, que consistiu em contaminar as unidades com 200 UE, secagem e exposição ao ciclo de esterilização com óxido de etileno/CFC (12:88), verificou-se que após ciclos de reprocessamentos simulados, totalizando dez ciclos, foi possível detectar valores de recuperação de endotoxina em torno de 100%. Os cateteres-guia que foram adquiridos em instituição hospitalar após quatro reutilizações, apresentaram níveis de contaminação de 105 ufc/unid., assim como presença de bactérias consideradas patogênicas em pacientes comprometidos imunologicamente, já a detecção de endotoxina bacteriana nestes cateteres não foi considerada significativa. Logo, as avaliações aplicadas nas unidades submetidas aos ciclos de reprocessamentos simulados, assim como nos cateteres-guia reprocessados e reutilizados quatro vezes, refletiram a realidade de algumas instituições no âmbito nacional e internacional que praticam a reutilização de produtos médico-hospitalares de uso-único. Os resultados obtidos vêm enfatizar objeções quanto à prática da reutilização, considerando que a ausência de segurança pode ocasionar em danos ao paciente.

Caracterização do envolvimento do gene RECKna proliferação celular e progressão tumoral: inversa correlação com a expressão do oncogene c-myc

Este trabalho mostra o envolvimento do gene RECK no processo de progressão do ciclo celular. Foi verificado que a expressão endógena de RECK é modulada durante a progressão do ciclo celular. A superexpressão de RECK em fibroblastos normais de camundongo promove uma diminuição da capacidade proliferativa das células e um retardo da transição das fases G0/G1-S do ciclo celular. Além disso, os resultados sugerem que um dos possíveis mecanismos de ação de RECK, que promovem este processo, envolve a indução da expressão de um inibidor de CDK, especificamente de p21, e retardo da fosforilação de pRb. Os resultados indicam, ainda, que durante a progressão do ciclo celular a expressão do gene RECK apresenta uma correlação inversa com a expressão do proto-oncogene c-myc. Estes dados corroboram os dados da literatura que mostram RECK como um alvo para o produto de diversos oncogenes, como ras e c-myc. A caracterização da repressão de RECK por c-Myc mostrou que a mesma ocorre ao nível transcricional e que sítios Sp1, presentes no promotor de RECK, são essenciais para a ação de Myc. Dados adicionais sugerem que a repressão de RECK por c-Myc parece envolver mecanismos de desacetilação de histonas. A modulação da expressão de RECK também foi avaliada durante a progressão maligna de tumores do sistema nervoso central (especificamente, gliomas). Foi verificado que a expressão de RECK não é alterada com a progressão deste tipo de tumor. Porém, foi verificado que os pacientes que manifestaram um maior tempo de sobrevida apresentaram tumores com uma significativa maior expressão do gene RECK. Estes dados sugerem que RECK possa ser um possível marcador prognóstico. A caracterização da regulação da expressão de RECK, tanto em células normais como em diferentes tipos de tumores, assim como os alvos moleculares da sua ação, são pontos muito importantes para o entendimento dos mecanismos que controlam a proliferação celular e podem contribuir para o desenvolvimento de novas formas de terapia anti-tumoral.

Efeito de ligantes do receptor NOP no modelo animal de mania induzido por metilfenidato

Bipolar disorder is a chronic psychopathology that reaches from 1 to 4% of the world population. This mood disorder is characterized by cyclical mood changes, in which an individual alternates between states of depression and mania. Mania is described in the literature as an abnormal state of exacerbation of humor, in which the subject presents an expansive, euphoric behavior, but with increased irritability, psychomotor agitation and a feeling of invincibility, which will contribute to risks exposure. The treatment of this psychopathology is complex and it is not effective in all cases, and it evokes many side effects. In this respect, the system of Nociceptin/Orphanin FQ (N/OFQ) can be studied as a possible therapeutic target for the treatment of bipolar disorder, due to its modulatory role on monoaminergic systems and on mood. This study aims to investigate the effect of NOP receptor ligands in an animal model of mania induced by methylphenidate. To this aim, locomotor activity was assessed in an open field, in mice treated with methylphenidate (10 mg/kg, sc, 15 min). Valproate (300 mg / kg, ip, 30 min), standard treatment of mania, prevented methylphenidate-induced hyperlocomotion. The acute treatment with the antagonist of NOP receptor UFP-101 (1-10 nmol, icv, 5 min) per se did not affect the spontaneous locomotion of mice, but it was able of attenuating hyperlocomotion induced by methylphenidate. The acute treatment with N/OFQ (1 and 0.1 nmol, icv, 5 min) did not alter the distance moved, but when tested at a dose of 1 ηmol, N/OFQ slightly reduced methylphenidate-induced hiperlocomotion. In conclusion, the administration of UFP-101 and N/OFQ produced antimanic-like actions. Furthermore, these data suggest that the system of N/OFQ performs a complex modulation of voluntary movement, and consequently on dopaminergic neurotransmission.

Análise fitoquímica e avaliação das atividades anti-inflamatória, antipeçonhenta e citotóxica de extratos aquosos de Aspidosperma pyrifolium e Ipomoea asarifolia

Envenomation caused by venomous animals, mainly scorpions and snakes, are a serious matter of public health. Tityus serrulatus is considered the most venomous scorpion in South America because of the high level of toxicity of its venom. It is responsible for causing serious accidents, mainly with kids. The species Bothrops jararaca is a serpent that has in its venom a complex mixture of enzyme, peptides and other molecules. The toxins of the venom of B. jararaca induce local and systemic inflammatory responses. The treatment chosen to serious cases of envenomation is the intravenous administration of the specific antivenom. However, the treatment is not always accessible to those residents in rural areas, so that they use medicinal plant extracts as the treatment. In this context, aqueous extracts, fractions and isolated compounds of Aspidosperma pyrifolium (pereiro) and Ipomoea asarifolia (salsa, salsa-brava), used in popular medicine, were studied in this research to evaluate the anti-inflammatory activity in the peritonitis models induced by carrageenan and peritonitis induced by the venom of the T. serrulatus (VTs), and in the local oedema model and inflammatory infiltrate induced by the venom of the B. jararaca, administrated intravenously. The results of the assays of cytotoxicity, using the MTT, showed that the aqueous extracts from the plant species presented low toxicity to the cells that came from the fibroblast of the mouse embryo (3T3).The chemical analysis of the extracts by High Performance Liquid Chromatography revealed the presence of the rutin flavonoid, in A. pyrifoliu, and rutin, clorogenic acid and caffeic acid, in I. asarifolia. Concerning the pharmacological evaluation, the results showed that the pre-treatment using aqueous extracts and fractions reduced the total leukocyte migration to the abdominal cavity in the peritonitis model caused by the carrageenan and in the peritonitis model induced by the T. serulatus venom. Yet, these groups presented anti-oedematous activity, in the local oedema model caused by the venom of the B. jararaca, and reduced the inflammatory infiltrate to the muscle. The serum (anti-arachnid and anti-bothropic) specific to each venom acted inhibiting the inflammatory action of the venoms and were used as control. The compounds identified in the extracts were also tested and, similar to the plant extracts, showed meaningful anti-inflammatory effects, in the tested doses. Thus, these results are indicating the potential anti-inflammatory activity of the plants studied. This is the first research that evaluated the possible biological effects of the A. pyrifolium and I. asarifolia, showing the biological potential that these species have.

Efeitos da nicotina no complexo do septo medial na via septo hipocampal em camundongos anestesiados por Ketamina

Nicotine administration in humans and rodents enhances memory and attention, and also has a positive effect in Alzheimer's Disease. The Medial Septum / Diagonal Band of Broca complex (MS/DBB) – a main cholinergic system – massively projects to the hippocampus through the fimbria-fornix, and this pathway is called the septohippocampal pathway. It has been demonstrated that the MS/DBB acts directly on the local field potential (LFP) rhythmic organization of the hippocampus, especially in the rhythmogenesis of Theta (4-8Hz) – an oscillation intrinsically linked to hippocampus mnemonic function. In vitro experiments gave evidence that nicotine applied to the MS/DBB generates a local network Theta rhythm within the MS/DBB. Thus, the present study proposes to elucidate the function of nicotine in the MS/DBB on the septo-hippocampal pathway. In vivo experiments compared the effect of MS/DBB microinfusion of saline (n=5) and nicotine (n=8) on Ketamine/Xylazine anaesthetized mice. We observed power spectrum density in the Gamma range (35 to 55 Hz) increasing in both structures (Wilcoxon Rank-Sum test, p=0.038) but with no change in coherence between these structures in the same range (Wilcoxon Rank-Sum test, p=0.60). There was also a decrease in power of the ketamineinduced Delta oscillation (1 to 3 Hz). We also performed in vitro experiments on the effect of nicotine on membrane voltage and action potential. We patch-clamped 22 neurons in current-clamp mode; 12 neurons were responsive to nicotine, half of them increased firing rate and other 6 decreased, and they significantly differed in action potential threshold (-47.3±0.9 mV vs. -41±1.9 mV, respectively, p=0.007) and halfwidth time (1.6±0.08 ms vs. 2±0.12 ms, respectively, p=0.01). Furthermore, we performed another set of in vitro experiments concerning the connectivity of the three major neuronal populations of MS/DBB that use acetylcholine, GABA or glutamate as neurotransmitter. Paired patch-clamp recordings found that glutamatergic and GABAergic neurons realize intra-septal connections that produce sizable currents in MS/DBB postsynaptic neurons. The probability of connectivity between different neuronal populations gave rise to a MS/DBB topology that was implemented in a realistic model, which corroborates that the network is highly sensitive to the generation of Gamma rhythm. Together, the data available in the full set of experiments suggests that nicotine may act as a cognitive enhancer, by inducing gamma oscillation in the local circuitry of the MS/DBB.

Efeito do ácido ascórbico sobre a espermatogênese de camundongos com distrofia muscular de Duchenne

The objective was to evaluate spermatogenesis alterations caused by DMD and the effect of the treatment using ascorbic acid in preventing those injuries. Twenty four mice were used, 12 from the C57BL/10 lineage (non-dystrophic) and 12 from the C57BL/10Mdx (dystrophic). The sample was divided in six groups containing 4 animals each, as: C30 = 30 days control; D30 = Dystrophic with 30 days; C60 = 60 days control; D60 = Distrophic with 60 days; CS60 = 60 days control supplemented with ascorbic acid and DS60 = Dystrophic with 60 days supplemented with ascorbic acid. The ascorbic acid supplementation was given in the water, 0,005 mg/day. After euthanasia, the testicles (right and left) were collected, weighted and cross sectioned. The material was fixed in the Karnovsky solution for 24 hours, included in resin for histological studies (morphological and morphometric analyzes) submitted to ultrastructural analysis and immunohistochemistry for caspase-3. There was a significant increase in the tunica propria percentage in D30 compared to C30 and D60. The ultrastructural analysis showed mitochondrial apoptosis evidence of Sertoli cells that can reduce sperm efficiency in CS60 and DS60. A higher volume density of apoptotic cells postivas to Caspase-3 in C30 and D30 versus DS60 compared to CS60. There was severe hypertrophy of the Leydig cells between D30 and D60. However, with supplementation was observed reversal of this change in DS60. The ultrastructure of Leydig cells to early presence of lipid vesicles was observed in the group pre-pubertal dystrophic (D30). Thus, the DMD affect the organization of the seminiferous tubules and intertubule, however, the ascorbic acid supplementation used for the treatment of DMD has been just enough to reduce the hypertrophy of the Leydig cells.

Preparação e caracterização de biomateriais poliméricos para avaliação da viabilidade de uso como phantom biológico

The theoretical and experimental developments in the biomaterials area have been directly applied to different fields of Medicine (odontology, regenerative medicine and radiotherapy). These advances have focused both for diagnosing diseases such as for quantifying degrees of progression. From the perspective of these studies, biomaterials are being designed and manufactured for application in various areas of science, provided advances in diagnostic radiology, radiotherapy dosimetry and calibration of radiotherapy equipment. Develop a phantom from a biomaterial has become a great ally of medicine in the treat patients with oncological diseases, allowing better performance of the equipment in order to reduce damage to healthy tissue due to excessive exposure to radiation. This work used polymers: chitosan and gelatin, for making the polymeric structures and controlled for different types of production and processing, characterizing and evaluating the biopolymer by physical techniques (STL, SEM and DEI) and therefore analyze applicability as phantom mouse lung. It was possible to evaluate the morphology of biomaterials quantitatively by scanning electron microscopy associated with imaging technique. The relevance of this work focuses on developing a phantom from polymeric biomaterials that can act as phantom providing high image contrast when subjected to analysis. Thus, the choice of DEI technique is satisfactory since it is an imaging technique of X-ray high resolution. The images obtained by DEI have shown the details of the internal microstructure of the biomaterial produced which have ≈ 10 μm dimension. The phantoms had made density ranging from 0.08 a 0.13 g/cm3.

Clonagem e expressão do gene que codifica o inibidor de quimotripsina de Erythrina velutina WILLD. - caracterização e avaliação de seu potencial farmacológico

Proteinases are enzymes distributed widely founded in several organisms and perform many different functions, from maintaining homeostasis to the worsening of some diseases such as cancer, autoimmune diseases and infections. The proteins responsible of controlling the action of these enzymes are the inhibitors, that are classified based on their target proteases and are founded since simple organisms, such as bacteria, to higher organisms, such as larger plants and mammals. Plant proteinase inhibitors act by reducing or inactivating the activity of target proteases, thus, these proteins have been studied as potential tools in the treatment of diseases related to protease activities. In this context, an inhibitor of chymotrypsin from Erythrina velutina, called EvCI was previously purified and it was observed that this protein plays in vitro anticoagulant activity and anti-inflammatory activity in in vivo model. Aiming to reduce the environmental impact caused by the purification EvCI in high amounts and to facilitate the process of obtaining this protein, the recombinant chymotrypsin inhibitor from Eryhrina velutina was produced after cloning and expression in Escherichia coli. The bacteria were grown in LB medium and after induction of the expression this material was subjected to procedures for cell lysis and the product was applied on Nickel-affinity column. The proteins adsorbed were digested by thrombin and applied on Chymotrypsin-Sepharose affinity column, obtaining the purified inhibitor, named recEvCI. After electrophoresis, the recombinant inhibitor showed an approximately molecular mass of 17 kDa, and reduced the chymotrypsin and elastase activities in vitro. The recombinant inhibitor was sequenced and was found similar amino acids residues when compared to other inhibitors deposited in the database, with some modifications. recEvCI showed high stability under pH variations and reducing conditions, maintaining its activity around 80%. This protein increased the blood coagulation time in vitro by acting on the intrinsic pathway and did not show cytotoxicity against strains of mouse 3T3 fibroblasts and RAW 264.7 macrophages. recEvCI showed microbicide activity related to release of nitric oxide and consequently the activation of macrophages, futhermore having proinflammatory effects assessed by increased release of TNF-α. These results indicate that recEvCI can be biotechnologically used as a new tool in the control of coagulation-related diseases as well as can be an activating agent of the immune system in immunosuppressed individuals