Viabilidade e segurança do transplante intratecal de células-tronco mesenquimais autólogas e alogênicas provenientes da medula óssea de cães (lupus canis familiaris)

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FMVZ

Transplante de medula óssea para suporte de células tronco hematopoiéticas em cães acometidos por linfoma

Lymphoma represents the most prevalent hematopoietic malignancy in small animal medicine. It is highly responsible to chemotherapy and therefore several protocols are used as therapeutic tools. For that reason, the bone marrow transplantation, enshrined in human medicine through initial trial in canine patients, has increasingly become the focus of studies in order to make it a reality also in veterinary medicine. First, the treatment with the chosen chemotherapy protocol is made. As complete remission of lymphoma is observed, it must be initiated the bone marrow harvesting. The obtained material is subjected to the processes of erythrocyte depletion, plasma depletion, cryoprotectants addition, total nuclear cells counting, hematopoietic progenitor quantification, analysis of cell viability and freezing. Following that, with radiotherapy or application of cyclophosphamide, the conditioning phase of the patient who is receiving the transplantation is carried out. The bags containing hematopoietic stem cells are then thawed and transplanted into the receptor organism. Support with hematopoietic stem cells allows the use of lethal doses of chemotherapy or radiotherapy and has been shown to considerably raise the disease remission time and survival rate of the canine patients

Papel reparador e imunomodulador das células-tronco mesenquimais (CTMs) deficientes de receptor para interferon-gamma (IFNy) em modelos renais agudos

A insuficiência renal aguda (IRA) é uma patologia que apresenta alta incidência na população e elevada morbimortalidade. Apesar de todos os avanços terapêuticos já obtidos, essas taxas ainda continuam elevadas. Uma possível alternativa, atualmente sugerida, seria o transplante de células-tronco. O processo regenerativo das células-tronco mesenquimais (CTMs) já foi demonstrado em diversos modelos experimentais e em alguns ensaios clínicos. O mecanismo de ação mais sugerido é a ação parácrina das CTMs na área lesada. Ainda, sabe-se que nesse ambiente, citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α e IFNγ, ativam as CTMs para seu papel reparador. O presente estudo busca analisar o papel do IFNγ na ativação das CTMs em modelos renais. As CTMs de animais nocautes para receptor de IFNγ (IFNγR KO) e de animais selvagens (controle/ C57/Bl6) foram isoladas do tecido adiposo. Essas células foram caracterizadas por imunofenotipagem e diferenciação em adipócitos e osteócitos. A lesão renal aguda foi obtida através do clampeamento dos pedículos renais de camundongos machos C57/Bl6, por 45 min. Após 4hs da lesão isquêmica, as CTMs IFNγR KO e CTMs controles foram administradas intraperitonealmente, e 24hs após a cirurgia os animais foram sacrificados. O tratamento com CTMs selvagens apresentou significativa redução dos níveis de uréia e creatinina sérica. No entanto, a redução desses níveis séricos com CTMs IFNγR KO foi menos intensa. Com relação à análise da resposta inflamatória do rim, os dados demonstram que a expressão de RNAm de IL-6 é maior nos animais tratados com CTMs IFNγR KO quando comparada ao tratamento com CTMs selvagens; porém, os dois tratamentos apresentam expressão reduzida em comparação aos animais não tratados. Já a expressão de RNAm de IL-10 é maior em animais tratados com CTMs em comparação aos não tratados... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Principais marcadores utilizados na avaliação da qualidade do sêmen de animais domésticos

Methods of semen cryopreservation allow changes in spermatic cells, such as damage in plasma and acrossomal membrane and modifications in mitochondrial function due to a disorder in the lipidic bilayer. For effective oocyte fertilization, spermatozoa require functional competent membranes, and intact organelles, acrosome and DNA. However, most laboratory methods used to evaluate semen quality are not highly correlated with fertilizing capacity. The discovery of a variety of fluorochromes and compounds conjugated to fluorescent probes has enabled an accurate assessment of the viability, integrity and function of spermatozoa. Among the most used probes that label the various compartments of the sperm cell there are the membrane impermeable fluorescent dyes to test the membrane integrity, as well as acylated dyes that pass the intact membrane. For the acrossomal integrity the most commonly used method is lectins labeled by a fluorescent probe. The acrosome reaction and spermatic capacitation is detected by the evaluation of membrane architecture and disorder of lipids in plasma membrane. Mitochondrial function can be determined using markers for their aerobic activity. The DNA status of spermatozoa has been determined using the metachromatic properties of Acridine Orange, and the DNA fragmentation can also be assessed by TUNEL assay. Finally, DNA condensation is analyzed using a single cell DNA gel electrophoresis assay that indicates DNA compactation. This monograph aims to compile the various tests used to detect damaged spermatozoa under cryopreservation methods, searching for improve the predictive value of semen analysis with the intention of a successful conception

Caracterização e infecção de células tronco mesenquimais e células semelhantes a neurônios, derivadas de cordão umbilical bovino pelo herpesvírus bovino Tipo 5 (BoHV-5)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Potencial evocado auditivo de tronco encefálico em equinos

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FMVZ

Avaliação do uso de Selante de Fibrina derivado do veneno de serpente como arcabouço biológico de células tronco mesenquimais na regeneração óssea do fêmur de ratos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Avaliação do selante de fibrina como arcabouço para células tronco em fígados cirróticos

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Avaliação da resposta inflamatória local após aplicação de células tronco mesenquimais alogênicas em tendão flexor digital superficial de equinos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Efeitos neuroprotetor e regenerativo do selante de fibrina derivado da peçonha de serpente combinado com células tronco mononucleares após reparo do nervo isquiático de ratos neonatos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Células-tronco na neurorrafia látero-terminal: estudo experimental em ratos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Células-tronco de membrana amniótica de cão como terapia alternativa para o tratamento de ceratoconjuntivite seca em cães

A Ceratoconjuntivite Seca (KCS Keratoconjunctivitis Sicca) é uma desordem imunomediada e resulta de alterações do componente aquoso do filme lacrimal e da deficiência dos componentes lipídicos e mucoso.Seu diagnóstico é baseado no Teste Lacrimal de Schirmer (TLS) e no Teste de Ruptura do Filme Lacrimal (TRFL) e tem como sinais clínicos: secreção mucopurulenta, hiperemia conjuntival, blefaroespasmos, fotofobia, incômodo, dor, vascularização, opacidade corneana e pigmentação, além de cegueira em casos avançados. O tratamento convencional consiste em aplicações diárias de Ciclosporina 0,2% ou Tacrolimus 0,03% (pomada ou colírio oftálmicos), que apesar de controlar a doença, são custosos, não curativos e exigem alto comprometimento da interação paciente-proprietário. A terapia celular usando células-tronco (CT) traz uma nova esperança para doenças sem tratamento efetivo. Neste trabalho utilizamos CT mesenquimais (CTM) obtidas a partir de membrana amniótica (CTMA) de cães obtidas a partir do descarte destes tecidos em campanhas de castrações em diferentes tempos gestacionais, sem formação tumoral quando submetidas ao teste tumorigênico durante 60 dias. Dois animais com KCS crônica foram tratados com duas injeções de CTMA com intervalo de 30 dias, sendo a primeira de 0,5x106 células e a segunda de 1x106 células em cada glândula. Na segunda semana após a terapia foi observado aumento da TLS sugerindo um benéficio da terapia que foi diminuindo com o passar das semanas. O TRFL oscilou durante os testes e não apresentou diferenças significativas. A terapia celular utilizando CTMA de cães melhorou a condição ocular nos dois casos em momentos e parâmetros variados, com repercussão na melhoria da superfície, mas não houve regressão do quadro clínico. Investigações futuras em estágios menos avançados da doença podem ajudar a elucidar os mecanismos pelos quais esse efeito foi obtido

Espermatogênese xenogênica pós-transplante de células tronco caninas no testículo de camundongos

As células tronco espermatogoniais (SSCs) são caracterizadas pela capacidade de autorrenovação, proliferação e transmissão das informações genéticas. Em caninos a primeira tentativa de xenotransplante não obteve o sucesso da produção de espermatozoides, no entanto, há evidências de que as células testiculares xenogênicas podem ser transplantadas no testículo do animal hospedeiro, e gerar espermatozoides viáveis do doador. Portanto, este estudo tem como objetivo realizar o xenotransplante das células germinativas caninas em camundongos imunosuprimidos, e com isto promover à produção de espermatozoides caninos viáveis, geneticamente modificados. E por meio desta técnica, analisar a eficiência da espermatogênese pós-transplante. Células germinativas testiculares foram caracterizadas, isoladas e cultivadas de cães pré-púberes, por meio de sistemas de cultura de enriquecimento e fatores de crescimento. As células foram transduzidas com um gene repórter GFP e LacZ, e por um vetor lentiviral para indentificar as SSCs nos testículos receptores. As SSCs transduzidas foram transplantadas nos testículos de camundongos (C57BL/6) tratados com Busulfan, após diferentes períodos os animais receptores foram eutanasiados e analisados. Aos 10 dias de cultivo as células germinativas adultas foram positivas para CD49f, CD117, e com 5 dias uma expressão semelhante de GFRA1 e DAZL, demonstrando a presença de SSCs e algumas células em meiose. Transplantamos 105 células e 20-43% das células transplantadas foram identificadas na membrana basal dos túbulos seminíferos do animal receptor. Portanto, o transplante das células germinativas caninas, mostrou que a purificação e o cultivo realizados são possíveis para obter SSCs caninas, as quais colonizaram os túbulos seminíferos dos camundongos imunodeficientes e mantiveram-se vivas na membrana basal por 90 dias após transplante, mesmo que estes animais tenham distância filogenética

Contribuição das células-tronco mesenquimais para as propriedades tumorigênicas de células de glioblastoma humano

Células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam tropismo a tumores, sendo importantes componentes do estroma tumoral. No cérebro, o nicho perivascular é uma importante fonte de CTM, as quais podem contribuir direta e/ou indiretamente para o desenvolvimento de tumores, embora os mecanismos envolvidos sejam pouco conhecidos. No presente trabalho, investigou-se a influência de CTM sobre a proliferação, capacidade invasiva e tumorigenicidade de células de Glioblastoma (GBM) humano. Sabe-se que CTM produzem TGFB1, uma citocina multifuncional envolvida em imunomodulação, proliferação, migração e transição epitelial-mesenquimal de células tumorais. Experimentos in vitro, realizados com meios condicionados de CTM de cordão umbilical humano com silenciamento permanente do gene TGFB1, demonstraram que o TGFB1 secretado por CTM é capaz de aumentar significativamente a proliferação e viabilidade de células de GBM humano da linhagem U87FP635. Esses resultados revelam uma importante ação parácrina dessa citocina regulatória, quando produzida por outros tipos celulares contidos no microambiente tumoral. Entretanto, sob condições experimentais que melhor mimetizam o microambiente tumoral, detectou-se que CTM também afetam o comportamento de células tumorais por um mecanismo alternativo, dependente de contato celular, mas independente dos níveis de TGFB1 secretados pelas CTM. Sob condições de cocultivo celular, envolvendo contato físico entre CTM e células de GBM U87FP635, detectou-se um aumento significativo na quantidade de células tumorais viáveis. Quando cultivadas na forma de esferoides tumorais, o contato com CTM aumentou a capacidade invasiva das células U87FP635. Finalmente, em modelo in vivo ectópico de GBM, células U87FP635 geraram tumores mais desenvolvidos quando coinjetadas com CTM. Esses efeitos pró-tumorigênicos foram observados tanto em contato com CTM controles, quanto com CTM contendo o gene TGFB1 permanentemente silenciado. Assim, esses achados indicam que CTM podem exercer efeitos pró-tumorigênicos por dois mecanismos alternativos e independentes: ação parácrina de TGFB1 secretado por CTM e ação mediada por contato célula-célula. Nas condições experimentais testadas, o mecanismo dependente de contato célula-célula demonstrou ser predominante. O estudo proteômico do secretoma dessas células identificou 126 proteínas diferencialmente expressas além de 10 proteínas exclusivamente detectadas em meios condicionados de cocultivos de CTM com células de GBM U87FP635. Cerca de 80% dessas proteínas exclusivamente secretadas pelo contato célula-célula são componentes de exossomos e estão envolvidas em proliferação celular e desenvolvimento tecidual. Esses resultados apontam uma interação dinâmica de comunicação entre CTM e células tumorais, e revelam algumas proteínas interessantes potencialmente envolvidas em uma ação pró-tumorigênica de CTM mediada por contato celular

Células-tronco localizadas na cinta placentária de carnívoros domésticos (Canis familiaris e Felis domesticus)

As células-tronco podem ser isoladas tanto de tecidos embrionários quanto de tecidos provenientes de um organismo adulto. Este projeto teve por objetivo caracterizar, descrever as células derivadas da região uterina e da cinta placentária junção materno/fetal da placenta de carnívoros domésticos (cães e gatos), e verificar a sua capacidade de pluripotência. Os úteros gestantes e não gestantes foram obtidos em campanhas de castrações e de controle populacional de cães e gatos, na cidade de Pirassununga/SP. Foram coletados 24 úteros gravídicos de animais hígidos, em diferentes idades gestacionais. O material foi dividido em três fases distintas da gestação, ou seja inicio que compreende de 8 a 20 dias de gestação; meio de 21 a 30 dias de gestação e final de 31 a 60 dias de gestação. O material foi coletado de fêmeas caninas e felinas, quatro úteros de cada fase, totalizando 12 úteros de cães e 12 de felinos. Coletamos também 8 úteros de fêmeas nulíparas (4 de cadelas e 4 de gatas) e 8 úteros com um mês pós parto (4 de cadelas e 4 de gatas). As amostras foram fixadas em paraformoldeido tamponado a 4% para a análise histológica e de imunohistoquimica. Para a padronização da imunohistoquimica inúmeros testes de marcação e diluição dos anticorpos utilizados nesta pesquisa foram realizados, todo protocolo aqui descrito foi padronizado pela primeira vez. Nas análises de imunohistoquimica avaliamos a expressão de marcadores associados a células-tronco pluripotentes Nanog, Oct4 e Sox2. Nas cadelas, as marcações foram positivas em todas as fases, gestacionais e não gestacionais. A detecção dessas proteínas nesta espécie ficaram padronizadas, destacando algumas diferenças quantitativas durante alguns períodos da gestação. Foi observado que o Oct4 na cadela, mostra uma diferença significativa (p=0,0064), entre as fases de início e meio da gestação e entra o início e a fase de termo. Quando comparados os resultados das análises imunohistoquimicas utilizando os três anticorpos entre si, nos três períodos gestacionais ficou evidente uma diferença (p=0,0005) somente relativa a proteína Nanog com Oct4. Nas gatas apenas foi possível padronizar o protocolo do Nanog e do Sox2, sendo a marcação feita com Oct4 negativa. Nesta espécie foi possível observar uma diferença da proteína Nanog (p=0,0006) quando comparada na fase inicial para a fase do meio e início da gestação para a fase termo. No que se refere as fêmeas nulíparas e fêmeas pós-parto destaca-se a ausência de diferenças quando comparados os anticorpos na fase pós parto tanto em cadelas quanto em gatas. Na fase nulípara foram observadas diferenças somente na cadela (p=0,0018) para os três anticorpos. Desta forma, a caracterização de células de origem placentária com característica de células tronco pode abrir um leque de possibilidades para obtenção destas células de forma mais ética, uma vez que este material é descartado na castrações. Foi possível a identificação das células que expressão proteínas pluripotentes em diferentes idades gestacionais, tanto na região de cinta placentária como no útero. Apesar de semelhantes, as espécies aqui estudadas apresentaram diferenças na realização do protocolo da imunihistoquímica. Pesquisas relacionadas com as células-tronco do endométrio vêm crescendo, principalmente porque estas células podem ser facilmente obtidas, a partir de fontes descartadas, sem entraves éticos. Desta forma tem o potencial de serem uma nova fonte para o desenvolvimento na terapêutica como terapia celular