Purificação parcial, por dois diferentes métodos cromatográficos, da lipase produzida por Rhizopus sp.

Lipases, especialmente as de origem microbiana, são largamente utilizadas em processos e na obtenção de produtos para as indústrias química, cosmética, farmacêutica e alimentícia. A produção de enzimas de elevada pureza é importante, principalmente, do ponto de vista do controle dos processos (ausência de interferentes), porém as etapas necessárias à purificação, em geral, provocam perdas na atividade das enzimas e aumentam seu custo final. O objetivo deste trabalho foi propor a melhor metodologia de purificação para a lipase de Rhizopus sp. através do teste de dois diferentes métodos cromatográficos (troca iônica e interação hidrofóbica) e, ainda verificar o melhor planejamento estatístico para caracterização bioquímica da mesma. Foi possível purificar parcialmente a lipase de Rhizopus sp. com o uso de coluna de DEAE Sepharose (troca aniônica) e de FENIL Sepharose (interação hidrofóbica). A primeira, embora mais seletiva para a enzima em questão, parece provocar redução de sua atividade. A presença de maiores concentrações de íons Na+1 na fração purificada por FENIL Sepharose parece contribuir para o aumento de atividade da lipase. Embora os resultados obtidos por análise multivariável para determinação das características bioquímicas da lipase sejam compatíveis com a análise univariável, aquele planejamento não foi considerado indicado no presente caso.

Extração de proteínas miofibrilares de carne bovina para elaboração de filmes comestíveis

A utilização de proteínas miofibrilares de carne na elaboração de filmes comestíveis implica, inicialmente, na obtenção desta macromolécula, uma vez que ela é indisponível comercialmente. Assim, os objetivos deste trabalho foram a obtenção e caracterização de proteínas miofibrilares de carne bovina, em escala de laboratório, e a elaboração e caracterização da microestrutura de filmes à base dessas proteínas. As proteínas miofibrilares foram extraídas do músculo Semitendinosus bovino, pós rigor mortis, empregando-se uma técnica de extração por centrifugação diferencial em solução tampão, com diferentes concentrações salinas, segundo metodologia de EISELE & BREKKE [13] modificada neste trabalho. As proteínas, assim obtidas, foram liofilizadas (PML) e analisadas para determinação do teor de proteínas, de lipídios, de sais minerais, de cinzas e da umidade. A composição de aminoácidos foi determinada por cromatografia de troca iônica e o perfil eletroforético foi determinado em gel de poliacrilamida. Alguns filmes foram elaborados com 1g de PML/100g de solução, 60g de glicerol/100g de proteínas e ácido acético glacial para ajuste do pH=2,8. A microestrutura desses filmes foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura. A PML, que apresentou teor de proteínas de 84,3%, foi composta de diversas frações de proteínas miofibrilares, com destaque para frações da miosina e da actina, segundo os resultados da eletroforese. Trabalhando-se a composição de aminoácidos, verificou-se que a maior contribuição energética das interações potenciais dos aminoácidos, foram as provenientes de ligações covalentes (58,3%), seguidas das interações iônicas (35,72%). A microestrutura do filme revelou uma estrutura pouco homogênea, porém coesa e densa e uma matriz protéica compacta e fina.

Produção de isomaltulose a partir da transformação enzimática da sacarose, utilizando-se Erwinia sp D12 imobilizada com alginato de cálcio

A glicosiltransferase de Erwinia sp D12 é capaz de converter a sacarose em isomaltulose (6-o-alfa-glicopiranosil D-frutofuranose), um açúcar alternativo que apresenta baixo potencial cariogênico, e que pode ser utilizado em chocolates, gomas de mascar e balas. A isomaltulose é também utilizada na produção de isomalte, uma mistura de açúcar álcool, de baixo valor calórico e baixo potencial cariogênico. No estudo da influência dos componentes do meio de cultivo, na produção de glicosiltransferase, em frascos agitados, foi obtido maior atividade da enzima (12,8 unidades de atividade/mL do meio de cultura) em meio de cultura A constituído de melaço 12% (p/v) de sólidos solúveis totais, peptona 4% (p/v) e extrato de carne 0,4% (p/v). No estudo do efeito do tempo e da temperatura na fermentação da linhagem de Erwinia sp D12, em fermentador New Brunswick de 3L, contendo meio de cultura A, foi obtida maior atividade de glicosiltransferase (15,6 unidades de atividade/ mL de meio de cultura) na fase exponencial de crescimento após 8 horas de fermentação a 30ºC. Na produção de isomaltulose a partir da sacarose utilizando-se células de Erwinia sp D12 imobilizadas em alginato de cálcio, estudou-se o efeito da temperatura (25 - 35ºC) e da concentração de substrato (12,5 - 60% p/v). Foi obtido um rendimento em torno de 50% de isomaltulose, com soluções de sacarose entre 20-30% (p/v) a 35ºC. Concentrações em excesso de sacarose (ao redor de 40% p/v) afetaram a atividade da célula imobilizada, diminuindo a conversão de sacarose em isomaltulose. O xarope de isomaltulose foi purificado através de cromatografia de troca iônica e o eluato cristalizado por abaixamento de temperatura. Os cristais apresentaram 91,39% de isomaltulose.

Influência do sistema de libertação na permeação de uma molécula hidrofílica

Diferentes estratégias têm sido usadas para aumentar a eficácia e a segurança não só de medicamentos tópicos e transdérmicos, mas também de produtos cosméticos. Avanços na tecnologia de encapsulação levaram ao desenvolvimento de polímeros biodegradáveis multifuncionais invocando capacidades promotoras de permeação, permitindo uma libertação controlada de fármacos ou com propriedades protectoras. O objectivo deste estudo foi aplicar um polímero de origem natural – o alginato- na encapsulação de uma molécula hidrofilica modelo- a cafeína. Este permeante modelo foi encapsulado em três sistemas diferentes de alginato - macrosferas secas, hidratadas e microparticulas de cálcio-alginato. Adicionalmente, a cafeína também foi incorporada em três formulações passivas - uma solução aquosa, um gel de Carbopol© e um creme O/A. Foram feitos estudos de difusão in vitro com células de Franz, utilizando membranas de polidimetilsiloxano como modelo da epiderme humana. Quantidades equivalentes das diferentes formulações de cafeína foram colocadas no compartimento dador das células de Franz. Foram recolhidas amostras do compartimento receptor a cada 2 horas, durante 8 horas. Os vários fluxos em estado estacionário foram calculados. Os fluxos mais elevados foram obtidos a partir do creme O/A e as macrosferas secas de alginato. A libertação mais lenta de cafeína foi observada quando esta foi encapsulada em macrosferas hidratadas e nas microsferas. Estes diferentes perfis de permeação podem ser explicados pela natureza porosa destes últimos e por um mecanismo de troca iónica. Estes resultados são indicativos de que esta tecnologia pode ser usada com sucesso na modulação da biodisponibilidade de moléculas para administração transcutânea. Os polímeros de alginato parecem particularmente adequados à utilização na libertação controlada de fármacos com elevada potência farmacológica e estreitas janelas terapêuticas. Por outro lado, a sua aplicabilidade também poderá ser estendida a ingredientes cosméticos que, por razões de segurança, devem estar limitados às camadas mais superficiais da pele.

Produção e caracterização de membranas catiônicas para eletrodiálise com polímeros convencionais e polianilina dopada com diferentes ácidos orgânicos

Neste estudo foram realizadas diferentes misturas entre polímeros convencionais (poliestireno de alto impacto e poliuretano) e polianilina, com o objetivo de produzir membranas para eletrodiálise. As membranas foram caracterizadas através da quantidade de água absorvida, capacidade de troca iônica, espectroscopia FTIR e Raman, análise termogravimétrica e análise dinâmico mecânica. A estabilidade química em meio ácido, alcalino e fortemente oxidante também foi avaliada para escolher qual o meio mais apropriado para executar as eletrodiálises. Através de microscopia eletrônica de varredura foi observado a morfologia das membranas, onde pode-se ver a incorporação da polianilina na matriz polimérica. Foram feitos ensaios de eletrodiálise usando as membranas produzidas e foram realizados ensaios para a determinação dos números de transporte para o zinco em meio ácido e alcalino através de algumas membranas para avaliar a seletividade das membranas a cátions e ânions. Após ser comprovado a seletividade à cátions, foram determinados o número de transporte e a extração percentual para todas as membranas. Os resultados foram comparados com os resultados obtidos para a membrana comercial Nafion 450, sendo encontrado uma permeabilidade a zinco através das membranas produzidas similar à permeabilidade da membrana comercial Nafion 450.

Polimorfismos de inserção/deleção do gene da ECA e K121Q do gene PC-1 em pacientes com Diabete Mellito tipo 1 normoalbuminúricos : estudo com 10 anos de acompanhamento

O objetivo deste estudo foi analisar o papel do polimorfismo de I/D do gene da Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) e o polimorfismo K121Q da PC-1 nas modificações das taxas de filtração glomerular (TFG), excreção urinária de albumina (EUA) e pressão arterial em uma coorte de pacientes diabéticos tipo 1 normoalbuminúricos (EUA<20μg/min) em um estudo com seguimento de 10,2 ± 2,0anos (6,5 a 13,3 anos). A EUA (imunoturbidimetria), TFG (técnica da injeção única de 51Cr-EDTA), HbA1c (cromatografia de troca iônica) e pressão arterial foram medidas no início do estudo e a intervalos de 1,7 ± 0,6 anos. O polimorfismo I/D e K121Q foram determinados através da PCR e restrição enzimática. Onze pacientes apresentaram o genótipo II, 13 o ID e 6 apresentaram o genótipo DD. Pacientes com o alelo D (ID/DD) desenvolveram mais freqüentemente hipertensão arterial e retinopatia diabética. Os 3 pacientes do estudo que desenvolveram nefropatia diabética apresentaram o alelo D. Nos pacientes ID/DD (n=19) ocorreu maior redução da TFG quando comparados com os pacientes II (n=11) (-0,39 ± 0,29 vs – 0,12 ± 0,37 ml/min/mês; P=0,035). A presença do alelo D, em análise de regressão múltipla linear (R2=0,15; F=4,92; P=0,035) foi o único fator associado à redução da TFG (-0,29 ± 0,34 ml/min/mês; P<0,05). Já o aumento da EUA (log EUA = 0,0275 ± 0,042 μg/min/mês; P=0,002) foi associado somente aos níveis iniciais de EUA (R2=0,17; F=5,72; P=0,024). Um aumento significativo (P<0,05) no desenvolvimento de hipertensão arterial e de novos casos de retinopatia diabética foi observado somente nos pacientes com os genótipos ID/DD. Vinte e dois pacientes apresentaram genótipo KK, 7 KQ e 1 apresentou genótipo QQ. Pacientes com os genótipos KQ/QQ apresentaram um aumento significativo (P=0,045) de novos casos de retinopatia diabética. Em conclusão a presença do alelo D nesta amostra de pacientes DM tipo 1 normoalbuminúricos e normotensos está associada com aumento na proporção de complicações microvasculares e hipertensão arterial.

Modificação estrutural de bentonitas nacionais : caracterização e estudos de adsorção

São apresentados os aspectos teóricos, práticos e bibliográficos envolvidos no desenvolvimento da tese de doutorado intitulada Modificação estrutural de bentonitas nacionais: caracterização e estudos de adsorção. O trabalho consistiu no desenvolvimento de um material adsorvente a partir de bentonitas, do tipo montmorilonitas, modificadas estruturalmente com o objetivo de aumentar sua capacidade de adsorção de poluentes, orgânicos e inorgânicos. O estudo visa incrementar o valor agregado deste recurso mineral e insere-se na área de tratamento de efluentes líquidos usando adsorventes não tradicionais, eficientes e de baixo custo em substituição ao carvão ativado ou às resinas de troca iônica. Foram estudadas as propriedades físicas e químicas; distribuição de tamanho de partículas, área superficial, potenciais eletrocinéticos, capacidade de troca catiônica, composição mineralógica, morfologia superficial e espaçamento basal, bem como as propriedades adsorptivas dos argilominerais não tratados e modificados, não modificadas e pilarizadas respectivamente. Também são discutidos os mecanismos de adsorção envolvidos e o desenvolvimento de um reator contínuo (adsorção em flocos) e de separação sólido/líquido. As modificações estruturais dos argilominerais foram realizadas via homoionização com cloreto de cálcio e posterior intercalação com compostos orgânicos com ação quelante de metais. A FENAN, bentonita obtida pela intercalação com Orto Fenantrolina (OF), foi a que apresentou melhor viabilidade técnica em termos de adsorção, adsorção/dessorção, floculação e de acumulação de poluentes na forma floculada e não floculada. Adicionalmente os estudos de reversibilidade da intercalação revelaram a alta estabilidade da OF na FENAN, em soluções fortemente ácidas, onde aproximadamente 90% da OF permanece ligada à superfície da argila. A quantidade de OF adsorvida na forma de unidades micelares foi de 112 mg por grama de bentonita a pH 8,5 ± 0,5. A caracterização das bentonitas, via difração de Raios X, análise térmica, microscopia eletrônica de varredura e por microscopia de força atômica, revelou que as FENAN possuem um comportamento estrutural muito estável ao longo da seqüência de adsorção/dessorção e que após a adsorção de poluentes inorgânicos, o quelato metálico formado apresenta alta estabilidade dentro da estrutura da organobentonita. A capacidade de acumulação alcançada nas FENAN foi de 110 mg de Cu/g de bentonita, valor superior à de diversos materiais adsorventes alternativos propostos em outros trabalhos similares. Os estudos de acumulação das FENAN floculadas – FENANFLOC, indicaram que a presença de floculante, na quantidade utilizada, não afeta significativamente a capacidade de remoção das bentonitas modificadas. Este comportamento apresentado, permitiu o desenvolvimento do Reator Expandido de Flocos Adsorventes (REFA), cujas características e parâmetros operacionais são discutidos em detalhe. Finalmente, os resultados são discutidos em termos dos fenômenos interfaciais envolvidos e dos potenciais práticos deste novo adsorvente e da nova técnica de adsorção em flocos no REFA.

Purificação e caracterização da bacteriocina cereína 8A, produzida por uma linhagem de Bacillus cereus

Foi estudada uma bacteriocina produzida por uma linhagem de B. cereus 8A, isolado de solo da região Sul do Brasil. Na primeira etapa de estudo determinaram-se as condições básicas de produção de bacteriocina com amplo espectro de ação denominada de Cereína 8A. Observou-se que durante a fase estacionária ocorre o máximo da sua produção, iniciando sua síntese no final da fase exponencial. As condições de maior produção foram a 30º C, agitação e contínua e numa faixa de pH de 7,0-8,5. A bacteriocina bruta inibiu várias bactérias indicadoras, como Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens e Bacillus cereus. O teste de termoestabilidade mostrou a perda de atividade quando submetida a uma temperatura a partir de 87º C. Verificou-se a resistência da bacteriocina bruta frente à tripsina e papaína, mas não frente à proteinase K e pronase E. B. cereus e L. monocytogenes foram utilizadas como bactérias indicadoras para a determinação do modo de ação, após a determinação da dose bactericida de 200 UA mL-1 e 400 UA mL-1 respectivamente. A Cereína 8A demonstrou uma ação inibidora em culturas de Escherichia coli e Salmonella Enteritidis, quando tratadas com EDTA. A atividade esporicida foi observada contra esporos de B. cereus após tratamento com 400 UA ml -1. A análise da biomassa de L. monocytogenes e B. cereus após tratamento com a Cereína 8A, através da espectrofotometria de infravermelho determinou alteração no perfil, correspondente à fração dos ácidos graxos da membrana celular bacteriana. A substância peptídica foi separada por meio da precipitação com sulfato de amônio, extração com 1-butanol e aplicação em coluna de cromatografia por troca iônica tipo Q-Sepharose. A Cereína 8A purificada mostrou maior sensibilidade a proteases e ao calor e um peso molecular de aproximadamente 26 kDa. O espectro ultravioleta foi típico de um polipeptídeo e o espectro de infravermelho indica presença de grupamentos NH, acil e ligações peptídicas na sua estrutura. Uma hipótese do mecanismo de ação seria a desestruturação da membrana celular pela abertura de poros.

Decomposição de NO em cobre suportado sobre zeólitas

No presente trabalho visou-se o estudo da eliminação dos compostos de nitrogênio, NOx, usando a decomposição direta sobre catalisadores de cobre suportado em zeólitas (ZSM-5, MCM-22 e Seta). Os catalisadores foram preparados pelo método de troca iônica com o meio básico obtendose catalisadores com teores de cobre variando entre 0,21% a 3,3% em peso. Os mesmo foram caracterizados através de análise química pela técnica absorção atômica (AA), área superficial (SET), isotermas de adsorção de nitrogênio, difração de Raios-X (DRX) e redução a temperatura programada (TPR). Os testes de atividade catalítica foram realizados através da reação de decomposição do NO em um reator tubular com leito fixo e fluxo contínuo. A mistura reacional era composta por 500 ppm de NO em hélio. Os produtos da reação foram analisados por espectrometria de infravermelho com transformada de fourier (do inglês, Fourier Transformed Infrared, FTIR), usando célula de gás. As medidas de absorção atômica permitiram calcular um nível de troca em relação a CU2+variando entre 7 e 46% nos catalisadores CuZSM-5, CuMCM-22 e CuSeta. As análises de DRX e das isotermas de adsorção de nitrogênio mostraram que a incorporação de cobre não alterou de forma significativa as estruturas das zeólitas. A análise de redução a temperatura programa (TPR) apresentou duas espécias de cobre presente nos catalisadores, Cu2+e Cu+ Na reação de decomposição dos compostos de nitrogênio, a atividade e a seletividade dos catalisadores é influenciada pela temperatura e pela acessibilidade do metal nas cavidades e nos poros das zeólitas. A partir dos testes de atividade catalítica provou-se que os suportes zeolíticos (MCM-22 e Seta) conduziram a valores de conversão de NO comparáveis ou melhores aos do suporte zeolítico ZSM-5, citado como sendo o melhor, até hoje, estudado para tal reação.

Produção, caracterização, purificação e aplicação de uma protease produzida pelo microrganismo Microbacterium sp. kr10

O uso de enzimas como agentes de modificação das propriedades funcionais de proteínas tem se tornado bastante difundido na indústria de alimentos. As proteases, apresentam inúmeras vantagens, principalmente, devido a sua atividade em baixas concentrações e a sua ausência de toxicidade, que faz com que se elimine a necessidade da sua remoção do produto final. O objetivo deste trabalho foi determinar as condições ótimas de produção da protease de Microbacterium sp. kr10, caracterizar e purificar parcialmente a enzima, assim como verificar a sua utilização como agente de modificação das propriedades funcionais da proteína de soja. Através da metodologia de superfície de resposta foram determinadas as condições ótimas de produção da protease, pH de 7,0, temperatura de 25°C e 12,5 g L-1 de farinha de pena (p/v). O padrão proteolítico da enzima tanto no extrato cru quanto na parcialmente purificada indicam que esta é uma metaloprotease, com pH e temperaturas ótimos nas faixas de 6,5 a 7,5, e 45 a 55°C, respectivamente. A atividade enzimática foi totalmente inibida por EDTA, fenantrolina, HgCl2 e CuCl2 e parcialmente inibida por ZnCl2, MnCl2 e SnCl2. A enzima foi parcialmente purificada através de cromatografia de gel filtração e troca iônica resultando num fator de purificação de 250. Um aumento gradativo do grau de hidrólise da proteína de soja foi observado à medida que se aumentou a razão enzima/substrato utilizada, assim como a redução da formação de espuma e o aumento da capacidade emulsificante de uma solução composta pelo hidrolisado de soja e óleo de soja, mesmo sob condições de alta temperatura e alta concentração de sal. Desta forma, esta protease apresenta potencial para aplicação como agente de modificação protéica de proteína de soja isolada.

Obtenção, funcionalização e caracterização de IPNS compostas de poliuretano e poliestireno

O presente trabalho teve como objetivo verificar as possibilidades de desenvolvimento de membranas poliméricas a partir de redes de polímeros interpenetrantes (IPNs) compostas de poliuretano obtido a partir do óleo de mamona e de copolímero de poli(estireno-co-divinilbenzeno). Filmes de IPNs foram funcionalizados através da sulfonação, utilizando sulfato de acetila como reagente, a fim de se produzirem membranas íon-seletivas do tipo catiônicas. Os materiais poliméricos produzidos, sulfonados ou não, foram estudados através de um conjunto de métodos termoanalíticos (TGA, DSC, DMA), microscopia eletrônica de varredura e avaliados quanto à resistência química e mecânica. As IPNs sulfonadas foram avaliadas quanto seu comportamento de absorção de água e quanto à capacidade de troca iônica. Os resultados mostraram que a concentração dos componentes das IPNs afeta suas propriedades e que as condições de sulfonação afetam as características das membranas produzidas.

Produção, caracterização, purificação parcial e aplicação de um peptídeo antimicrobiano produzido por Bacillus licheniformis P40

Uma bactéria identificada como Bacillus licheniformis P40 isolada de intestino de peixe (Leporinus sp.) da bacia amazônica foi estudada quanto à sua capacidade de produzir antimicrobianos. O sobrenadante da cultura obtido em caldo de cérebro e coração (BHI) foi caracterizado, sendo ativo contra importantes bactérias patogênicas e deteriorantes como L. monocytogenes, B. cereus, E. carotovora e isolados clínicos de Streptococcus. Este foi parcialmente purificado através de precipitação com sulfato de amônio e cromatografia de gel filtração e de troca iônica. Foram assim isoladas duas substâncias com atividade antimicrobiana, sendo uma delas de natureza protéica. Esta foi estável a altas temperaturas (100o C), numa ampla faixa de pH e mostrou propriedades de biosurfactante. O sobrenadante parcialmente purificado foi utilizado para o combate a um importante fitopatógeno: Erwinia carotovora. Uma dose de 6400 UA/mL foi bactericida para uma concentração de 107 UFC/mL em 20 minutos in vitro. A substância foi capaz de evitar a formação da podridão mole em batatas (in vivo). Foi estudada a produção da atividade antimicrobiana em resíduos e sub-produtos da indústria de alimentos, sendo escolhido o soro de queijo para otimizar a produção através de um experimento fatorial 23 variando as condições de temperatura, pH e concentração de soro de queijo em pó. As melhores condições foram para temperaturas entre 26 e 37o C e pH entre 6,5 e 7,5 para uma concentração de soro de 7%, sendo que aumentos na concentração levaram a aumentos na produção.

Estudo dos ácidos naftênicos do gasóleo pesado derivado do petróleo Marlim

Pouco se conhece sobre a estrutura dos ácidos naftênicos presentes no petróleo brasileiro e derivados. Existem alguns trabalhos realizados com a fração ácida, dos óleos crus, direcionados à aplicação geológica, visto que os ácidos hopanóicos, constituintes dessa fração, podem ser indicadores de migração e maturação. Entretanto, além do interesse geológico, a fração ácida, também está relacionada à corrosão nos equipamentos de refino desses óleos, motivando pesquisas para separar e identificar os ácidos responsáveis pelo problema corrosivo nas refinarias. Os ácidos naftênicos (AN) representam um teor muito pequeno, tanto nos óleos crus, quanto nos derivados, dos quais são constituintes. A concentração bastante baixa destes ácidos, em matrizes com composição ampla e variada, dificulta sua extração. Portanto, as etapas de separação, concentração e purificação da amostra, além da análise, demandam tempo e trabalho extensivos. Os objetivos deste trabalho de pesquisa podem ser resumidos em, otimizar o método de extração e análise, para os ácidos presentes no gasóleo pesado (GOP) e verificar seu efeito corrosivo. Neste trabalho, utilizou-se extração líquido-líquido (ELL), cromatografia líquida preparativa com sílica, cromatografia de troca iônica com as resinas A-21e A-27 e extração em fase sólida (SPE) com dessorção em banho de ultra-som (US), aplicada no extrato da ELL, para extrair a fração ácida do (GOP) do petróleo Marlim (Campos, Rio de Janeiro, Brasil). A análise foi realizada, através de cromatografia em fase gasosa com detector de espectrometria de massas e ionização por impacto de elétrons, após uma etapa de derivatização com metanol/BF3 ou com N-metil-N-(terc-butildimetilsilil)trifluoracetamida. Os resultados apresentados indicam a presença de ácidos carboxílicos, pertencentes a famílias de compostos alicíclicos e cíclicos, com até quatro anéis na molécula. Também foi verificado o efeito corrosivo da amostra de GOP sobre amostras de aço ASTM 1010, associado à presença de ácidos naftênicos nesta amostra.

Atividades proteolíticas e microrganismos envolvidos na maturação do queijo serrano

A proposição do presente trabalho foi avaliar o potencial das enzimas das NSLAB do queijo Serrano quanto às atividades aminopeptidásicas. Seis bateladas de queijo Serrano foram elaboradas (3 no verão e 3 no inverno) por três diferentes produtores (A, B e C) de Caxias do Sul (RS), utilizando leite cru, sem adição de culturas iniciadoras. A atividade das aminopeptidases foi avaliada nas FPS dos queijos e nos extratos aquosos dos microrganismos através da hidrólise dos substratos sintéticos Gly- NA, Arg- NA, Tyr- NA, Leu- NA e Asp- NA, Glu- NA, Lys- NA, e Pro- NA. Nos queijos do produtor A, que apresentaram as maiores atividades (19 a 74 U/g de queijo), foram analisados os amino ácidos livres (AAL) e os resultados revelaram que eles aumentam continuamente, estão presentes em quantidades elevadas (4051 mg/100g de ES do queijo aos 60 d), e os AAL com maiores concentrações nos queijos foram Glu, Arg, Lys, Pro e Leu (juntos representam 58% a 61% do total de AAL). Extratos aquosos das NSLAB dos queijos de verão foram parcialmente purificados por cromatografia de troca iônica de fluxo rápido, utilizando Q-sepharose e incubados com os substratos Glu- NA, Arg- NA, Lys- NA, Leu- NA e Pro- NA, indicando atividade para todos os substratos e que a atividade nas frações mudam nas NSLAB para queijos com diferentes tempos de maturação. Uma comparação das atividades aminopeptidases recuperadas após o zimograma do gel de eletroforese-PAGE das FPS dos queijos e dos microrganismos, sugerem que as PepN, PepC e PepL ativas nas FPS têm suas origens na lise das NSLAB presentes nos mesmos.

Produção e purificação de β-1,3 glicanases em Metarhizium anisopliae

Metarhizium anisopliae é um fungo cosmopolita com capacidade de infectar uma grande variedade de hospedeiros, estando entre eles o carrapato Boophilus microplus. A penetração de M. anisopliae em seus hospedeiros ocorre de forma ativa onde a cutícula constitui a principal barreira. A penetração é um processo multifatorial, porém, o emprego de pressão mecânica e a secreção de enzimas hidrolíticas parecem ser fundamentais para o seu sucesso. M. anisopliae, quando cultivado em meios com fontes de carbono que mimetizam a cutícula de seus hospedeiros, secreta enzimas como proteases, quitinases e lipases. Atualmente, o emprego de técnicas que identificam genes diferencialmente expressos (RDA) mostrou o possível envolvimento de outras enzimas, como as β-glicanases, durante o processo de penetração. A descoberta da ocorrência de modificações morfológicas como espessamento e perda da definição da parede celular nas extremidades das hifas que penetram na cutícula do carrapato sustentam ainda mais o possível envolvimento de enzimas que degradam as β-glicanas nas etapas iniciais da infecção. Neste trabalho, foi investigada a produção de β-1,3- glicanases pela linhagem E6 de M. anisopliae como também, buscou-se purificar as enzimas produzidas. A síntese e secreção de β-1,3-glicanases foram verificadas em meio contendo diferentes fontes de carbono sendo a secreção diferenciada dependendo da condição testada. A utilização de glicose em determinadas concentrações pareceu inibir a secreção enzimática. Duas das condições testadas, N-acetilglicosamina (NAG) 0,5% e parede celular de Rizoctonia solani 0,5%, foram utilizadas para a produção enzimática em larga escala. O sobrenadante dos cultivos em fermentador foi submetido ao processo de purificação que constou de três etapas: concentração por ultrafiltração com membrana de celulose regenerada, aplicação em coluna de troca iônica QSepharose Fast Flow e aplicação em coluna de filtração em gel Superdex 75. O emprego deste protocolo permitiu a purificação parcial de uma β-1,3-glicanase com aproximadamente 95kDa, secretada durante a fermentação em presença de parede celular de Rizoctonia solani, e de outra, com aparentemente a mesma massa molecular secretada em fermentação utilizando NAG 0,5% como fonte de carbono. Durante este trabalho, também foi confirmada a presença de pelo menos um gene que codifica uma exo-β-1,3-glicanase no genoma da linhagem E6 de M. anisopliae. Por fim, o estudo das β-1,3 glicanases em M. anisopliae é justificado pela importância destas enzimas em variados aspectos do desenvolvimento do fungo bem como, pelo seu possível envolvimento na infecção de hospedeiros.