Expression des SOCS-1 et SOCS-3 par les lymphocytes T humains en réponse à des cytokines immuno-modulatrices

Les cytokines jouent un rôle fondamental dans la régulation des processus biologiques via la cascade de signalisation JAK-STAT. Les « Suppressors of Cytokine Signalling » (SOCS), protéines intracellulaires, inhibent la voie JAK-STAT. Plusieurs études supportent leur implication dans des maladies immunitaires, mais peu d’informations sont disponibles sur leur expression par les lymphocytes T humains. Nous postulons que les cytokines Interféron-β(IFN-β) et Interleukine-27 (IL-27), dotées d’un potentiel immuno-régulateur, ont des rôles bénéfiques via l’induction des SOCS. L’impact de l’IFN-β et l’IL-27 sur l’expression des SOCS-1 et SOCS-3 par des cellules T CD8 et CD4 humaines a été étudié en utilisant des cellules sanguines de donneurs sains. L’expression de ces régulateurs a été évaluée aux niveaux de l’ARNm par qRT-PCR et protéique par immunocytochimie. Les SOCS-1 et SOCS-3 ont été rapidement induits en ARNm dans les deux types cellulaires en réponse à l’IFN-β ou l’IL-27 et une augmentation de l’expression a été confirmée au niveau protéique. Afin de mimer les thérapies à base d’IFN-β, les cellules T ont été exposées chroniquement à l’IFN-β. Après chaque ajout de cytokine les cellules T ont augmenté l’expression du SOCS-1, sans moduler le SOCS-3. L’IL-27 a induit les SOCS-1 et SOCS-3 préférentiellement dans les cellules T CD8 ; ceci corrèle avec des résultats du laboratoire démontrant une plus petite expression des récepteurs à l’IL-27 par les lymphocytes T CD4 que les CD8. Notre projet a permis d’élucider l’expression des SOCS dans deux populations de cellules T et de clarifier les mécanismes d’actions de l’IFN-β et l’IL-27.

Caractérisation phénotypique et génotypique d’isolats de Salmonella Typhimurium provenant de porcs sains ou septicémiques

Les infections à Salmonella Typhimurium constituent un problème de taille pour l’industrie porcine et la santé publique car cet animal est un réservoir pour les infections chez l’homme. De plus, on observe, chez des souches appartenant au lysotype (LT) 104, des résistances multiples aux antimicrobiens associées à des septicémies chez les porcs en engraissement, ce qui peut contribuer à la contamination des carcasses. Il faut donc contrôler l’infection au niveau du troupeau. Pour ce faire, il importe donc de mieux caractériser ces souches, comprendre la pathogénie de l’infection et identifier des facteurs de virulence. L’objectif principal de cette étude était de caractériser des isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques et de les comparer avec ceux de porcs sains. Une banque d’isolats provenant de porcs septicémiques (ASC) et de porcs sains à l’abattoir (SSC) était constituée. Le lysotype des isolats a été identifié et ceux-ci ont été caractérisés selon le profil de résistance aux antimicrobiens, le SDS-PAGE et l’immunobuvardage et le PFGE. Chez les isolats ASC, LT 104 représentait 36.4% des isolats et chez les isolats SSC la proportion était de 51.5%. Les isolats pouvaient être résistants jusqu’à douze antimicrobiens, peu importe leur origine. Il n’a toutefois pas été possible d’associer une protéine spécifique au groupe d’isolats ASC. Parmi les souches LT 104, plusieurs groupes génétiques ont été identifiés. Les différentes étapes de la pathogénie de Salmonella ont ensuite été évaluées, dont l’adhésion et l’invasion des isolats des deux banques sur des cellules intestinales humaines. Nos résultats ont démontré que les isolats ASC avaient un pouvoir accru d’invasion comparés aux isolats SSC (P=0.003). Pour un sous-groupe d’isolats sélectionnés selon leur taux d’invasion, des tests de phagocytose, d’apoptose et d’adhésion au mucus intestinal ont été effectués en utilisant la cytométrie en flux. La survie des bactéries après la phagocytose a aussi été évaluée et la méthode MATS a été utilisée pour évaluer l'adhésion aux solvants. Les pourcentages de phagocytose chez les isolats SSC par les monocytes porcins étaient plus élevés que chez les isolats ASC à 15 minutes (P=0.02). Nous n’avons trouvé aucune différence significative pour les autres méthodes utilisées. Nous avons ensuite comparé le génome d’un isolat ASC (#36) à celui d’un isolat SSC (#1) par le SSH pour identifier des facteurs de virulence potentiels. Des clones correspondant à des gènes retrouvés sur le chromosome ainsi que sur des plasmides ont été identifiés. Ces résultats nous ont dirigés vers l’analyse des profils plasmidiques de tous les isolats. Les différents profils étaient retrouvés autant chez les isolats ASC que chez les isolats SSC. Deux profils (PL14 et PL20) étaient observés plus fréquemment chez les isolats LT 104 que chez les isolats d’autres lysotypes (P=0.01 et P=0.01, respectivement). Le séquençage d’un des plasmides de l’isolat ASC, démontrait la présence d’informations génétiques codant pour la réplication et une bêta-galactosidase-α. Il serait intéressant de préciser le rôle exact de ces gènes dans l’infection. Nos travaux suggèrent que les isolats de S. Typhimurium provenant de porcs septicémiques se distinguent par un pouvoir d’invasion accru ainsi que par des taux de phagocytose plus faibles dans les phases initiales de l’infection. Cette étude aura donc permis d’accroître les connaissances sur la pathogénie des infections à S. Typhimurium chez le porc.

A new paradigm for the folding of ribonucleic acids

De récentes découvertes montrent le rôle important que joue l’acide ribonucléique (ARN) au sein des cellules, que ce soit le contrôle de l’expression génétique, la régulation de plusieurs processus homéostasiques, en plus de la transcription et la traduction de l’acide désoxyribonucléique (ADN) en protéine. Si l’on veut comprendre comment la cellule fonctionne, nous devons d’abords comprendre ses composantes et comment ils interagissent, et en particulier chez l’ARN. La fonction d’une molécule est tributaire de sa structure tridimensionnelle (3D). Or, déterminer expérimentalement la structure 3D d’un ARN s’avère fort coûteux. Les méthodes courantes de prédiction par ordinateur de la structure d’un ARN ne tiennent compte que des appariements classiques ou canoniques, similaires à ceux de la fameuse structure en double-hélice de l’ADN. Ici, nous avons amélioré la prédiction de structures d’ARN en tenant compte de tous les types possibles d’appariements, dont ceux dits non-canoniques. Cela est rendu possible dans le contexte d’un nouveau paradigme pour le repliement des ARN, basé sur les motifs cycliques de nucléotides ; des blocs de bases pour la construction des ARN. De plus, nous avons dévelopées de nouvelles métriques pour quantifier la précision des méthodes de prédiction des structures 3D des ARN, vue l’introduction récente de plusieurs de ces méthodes. Enfin, nous avons évalué le pouvoir prédictif des nouvelles techniques de sondage de basse résolution des structures d’ARN.

In silico analysis of mitochondrial proteins

Le rôle important joué par la mitochondrie dans la cellule eucaryote est admis depuis longtemps. Cependant, la composition exacte des mitochondries, ainsi que les processus biologiques qui sy déroulent restent encore largement inconnus. Deux facteurs principaux permettent dexpliquer pourquoi létude des mitochondries progresse si lentement : le manque defficacité des méthodes didentification des protéines mitochondriales et le manque de précision dans lannotation de ces protéines. En conséquence, nous avons développé un nouvel outil informatique, YimLoc, qui permet de prédire avec succès les protéines mitochondriales à partir des séquences génomiques. Cet outil intègre plusieurs indicateurs existants, et sa performance est supérieure à celle des indicateurs considérés individuellement. Nous avons analysé environ 60 génomes fongiques avec YimLoc afin de lever la controverse concernant la localisation de la bêta-oxydation dans ces organismes. Contrairement à ce qui était généralement admis, nos résultats montrent que la plupart des groupes de Fungi possèdent une bêta-oxydation mitochondriale. Ce travail met également en évidence la diversité des processus de bêta-oxydation chez les champignons, en corrélation avec leur utilisation des acides gras comme source dénergie et de carbone. De plus, nous avons étudié le composant clef de la voie de bêta-oxydation mitochondriale, lacyl-CoA déshydrogénase (ACAD), dans 250 espèces, couvrant les 3 domaines de la vie, en combinant la prédiction de la localisation subcellulaire avec la classification en sous-familles et linférence phylogénétique. Notre étude suggère que les gènes ACAD font partie dune ancienne famille qui a adopté des stratégies évolutionnaires innovatrices afin de générer un large ensemble denzymes susceptibles dutiliser la plupart des acides gras et des acides aminés. Finalement, afin de permettre la prédiction de protéines mitochondriales à partir de données autres que les séquences génomiques, nous avons développé le logiciel TESTLoc qui utilise comme données des Expressed Sequence Tags (ESTs). La performance de TESTLoc est significativement supérieure à celle de tout autre outil de prédiction connu. En plus de fournir deux nouveaux outils de prédiction de la localisation subcellulaire utilisant différents types de données, nos travaux démontrent comment lassociation de la prédiction de la localisation subcellulaire à dautres méthodes danalyse in silico permet daméliorer la connaissance des protéines mitochondriales. De plus, ces travaux proposent des hypothèses claires et faciles à vérifier par des expériences, ce qui présente un grand potentiel pour faire progresser nos connaissances des métabolismes mitochondriaux.

N-acétyltransférase lysosomale : organisation, fonctionnement et défauts moléculaires chez les patients atteints du syndrome de Sanfilippo type C

L’acétylation des résidus de glucosamine terminaux par la N-acétyltransférase lysosomale (HGSNAT) est une étape essentielle de la dégradation catabolique de l’héparan sulfate. Des défauts dans cette réaction causent une maladie de surcharge lysosomale autosomale récessive rare : le désordre de Sanfilippo type C (SFC). À ce jour, 54 mutations ont été rapportées chez des patients SFC, incluant 13 mutations des sites d’épissage, 11 insertions et délétions, 8 mutations non-sens, 18 mutations faux-sens et 4 polymorphismes, avec différentes manifestations phénotypiques. Nous avons identifié 10 d’entre elles et effectué une étude exhaustive portant sur l’éventail des mutations SFC, leur distribution dans la population de patients, ainsi que leur impact potentiel sur la structure de la HGSNAT. Les erreurs d’épissage, les mutations non-sens, les insertions et les délétions devraient toutes entraîner un ARN non fonctionnel qui est rapidement dégradé par des mécanismes de contrôle qualité cellulaire. Les 4 polymorphismes identifiés sont des changements d'acides aminés qui ne modifient pas l'activité enzymatique, la glycosylation ou la localisation et n'ont donc pas de signification au niveau clinique. Au niveau des enzymes, les polymorphismes sont des changements d’acides aminés qui n’affectent pas la fonction, mais dans un contexte d’acides nucléiques ils peuvent être considérés comme des mutations faux-sens. Les dix-huit mutations faux-sens qui ont été exprimées ont produit des protéines inactives, en raison d'erreurs dans leur repliement. Ceci expliquerait donc la progression sévère de la maladie chez les personnes porteuses de ces mutations. Les protéines mutantes mal repliées sont anormalement glycosylées et conservées dans le réticulum endoplasmique. La thérapie par amélioration de l’activité enzymatique par des chaperonnes est une option thérapeutique potentielle, spécifiquement conçue pour exploiter l'activité enzymatique résiduelle de mutants mal repliés, afin d’éliminer les substrats stockés. Nous avons démontré que le traitement de plusieurs lignées de fibroblastes de patients SFC avec le chlorhydrate de glucosamine, un inhibiteur spécifique de la HGSNAT, a partiellement restauré l’activité de l'enzyme mutante, fournissant une preuve de l’utilité future de la thérapie par des chaperonnes dans le traitement de la maladie de SFC.

Synthèse de 4-désoxy hexopyrannoses, C-disaccharides et C-glycosides biologiquement actifs

Les glucides constituent la classe de molécules organiques la plus abondante et ceux-ci jouent des rôles cruciaux dans divers processus biologiques. De part leur importance médicinale, la préparation des désoxy-sucres, des C-glycosides et des C-disaccharides est devenue un sujet de pointe en synthèse organique. De façon générale, cette thèse décrit une nouvelle synthèse de novo des 4-désoxy hexopyrannoses en plus de la préparation de C-glycosides biologiquement actifs. De plus, une attention particulière a été portée à la préparation de novo de 4-désoxy-C-disaccharides. Dans un premier temps, le catalyseur de Cr(III) de Jacobsen et un complexe binaphtol/titane ont été utilisés pour réaliser des hétéro-Diels-Alder énantiosélectives. Les dihydropyrannes ainsi générés ont été transformés en 4-désoxy hexopyrannoses présents dans la nature. De cette façon, un dérivé de l’acide ézoaminuroïque, un précurseur de la désosamine et de la néosidomycine, a été préparé suivant cette approche de novo. De plus, à titre comparatif, la néosidomycine a également été fabriquée selon une approche chiron, à partir du méthyl alpha-D-mannopyrannoside. Finalement, une évaluation biologique préliminaire de la néosidomycine a été effectuée sur une la concanavaline-A (Chapitre 2). Dans un deuxième temps, une allylation stéréosélective sur un aldéhyde lié via des liens C-C à une unité mannoside a permis de générer un alcool homoallylique. Cette dernière fonctionnalité a été transformée en 4-désoxy hexopyrannose de configuration D ou L. De cette façon, la préparation de pseudo 4-désoxy-C-disaccharides, de 4-désoxy-C-disaccharides et de pseudo 4-désoxy aza-C-disaccharides a facilement été réalisée. Les rapports diastéréoisomériques de la réaction d’allylation ont été déterminés en plus de la configuration absolue des nouveaux centres stéréogéniques formés. La transformation des alcools homoallyliques en pyrannes poly hydroxylés ou en lactames poly hydroxylés a été réalisée, en plus de la déprotection de certains membres de cette famille pour une évaluation biologique préliminaire sur la concanavaline-A (Chapitre 3). Finalement, la synthèse de C-glycosides biologiquement actifs a été réalisée selon deux volets: i) préparation de 3-C-mannopyrannosyl coumarines et ii) synthèse de C-galactosides, inhibiteurs de la lectine PA-IL. Pour ce faire, le couplage de Heck a été utilisé à partir d’un ester alpha,bêta-insaturé, attaché à une unité glycosidique via des liens C-C, pour générer un dérivé glycosyl cinnamate de méthyle. Cependant, lorsque le 2-iodophénol est utilisé comme partenaire de Heck, la coumarine correspondante a été isolée. Les dérivés C-galactopyrannosyl cinnamates de méthyle représentent de bons inhibiteurs monovalents de la PA-IL avec un Kd aussi bas que 37 micro M (Chapitre 4).

Le développement économique régional, la politique et les disparités régionales des grands territoires : le cas du Canada et de la Chine

Résumé Depuis le début des années 1990, la recherche sur le développement régional a pris une importance considérable dans les disciplines de l’économie et de la géographie dans la plupart des pays. De nombreuses études ont été consacrées à ce sujet et l’on constate une approche analytique de plus en plus sophistiquée. Que les économies pauvres ont tendance à converger vers les pays riches, ou bien à diverger au fil du temps est une question qui a attiré l'attention des décideurs et des universitaires depuis quelques décennies. Convergence ou de divergence économique est un sujet d'intérêt et de débat, non seulement pour valider ou non les deux modèles principaux de croissance qui sont considérés comme concurrent (l’approche néo-classique et celle des approches de croissance endogène), mais aussi pour ses implications pour les publiques politiques. En se basant sur une analyse des politiques de développement régional et des analyses statistiques de la convergence et des disparités régionales, les objectifs de cette thèse sont de tenter de fournir une explication des différents processus et des modèles de développement économique régional poursuivis dans le cas de territoires immenses en utilisant le Canada et la Chine comme études de cas, d'entreprendre une analyse des différents facteurs et des forces motrices qui sous-tendent le développement régional dans ces deux pays, et d'explorer à la fois les réussites et les échecs apparents dans les politiques de développement régional en comparant et contrastant les expériences de développement régional et les modèles de ces deux pays. A fin d'atteindre cet objectif, la recherche utilise une approche multi-scalaire et des méthodes de mesure multidimensionnelle dans le cadre des analyses sur les disparités « régionales » entre les macro régions (sous-ensembles de provinces) des deux pays, des provinces et des régions urbaines sélectionnées, dans le but ultime d’identifier des problèmes existants en termes de développement régional et de pouvoir proposer des solutions. Les étapes principales de la recherche sont : 1. La cueillette des données statistiques pour le Canada et la Chine (incluant les provinces de Québec et de Xinjiang) pour une gamme d’indicateurs (voir ci-dessous). 2. D’entreprendre une analyse de chaque dimension dans les deux juridictions: Population (p.ex. composition, structure, changement); Ressources (p. ex. utilisation, exploitation de l’énergie); Environnement (p.ex. la pollution); et le Développement socioéconomique (p.ex. le développement et la transformation des secteurs clé, et les modèles de développement rural et urbain), et les disparités changeantes par rapport à ces dimensions. 3. La définition d’une typologie de différents types de région en fonction de leurs trajectoires de développement, ce qui servira pour critiquer l’hypothèse centre-périphérie. 4. Le choix d’une région métropolitaine dans chaque juridiction (province). 5. D’entreprendre une analyse temporelle des événements clé (politiques, investissements) dans chaque région et les facteurs impliqués dans chaque événement, en utilisant l’information documentaire générale et des agences institutionnelles impliqués actuellement et dans un passée récent. Cette étude a tenté d'expliquer les schémas et les processus des deux économies, ainsi que la présentation d'études de cas qui illustrent et examinent les différences dans les deux économies à partir de l’échelle nationale jusqu’au niveau régional et provincial et aussi pour certaines zones urbaines. Cette étude a essayé de répondre aux questions de recherche comme: Est-il vrai que les pays avec des plus grandes territoires sont associés avec des plus grandes disparités interrégionales? Quel est le résultat des comparaisons entre pays développés et pays en développement? Quels sont les facteurs les plus importants dans le développement économique de vastes territoires dans les pays développés et pays en développement? Quel est le mécanisme de convergence et de divergence dans les pays développés et, respectivement, les pays en développement? Dans l'introduction à la thèse, le cadre général de l'étude est présenté, suivie dans le chapitre 1 d'une discussion sur les théories et les concepts utilisés dans la littérature théorique principale qui est pertinent à l'étude. Le chapitre 2 décrit la méthodologie de recherche. Le chapitre 3 présente une vue d'ensemble des politiques de développement économique régional et les programmes du Canada et de la Chine dans des périodes différentes à différentes échelles. Au chapitre 4, la convergence des deux pays à l'échelle nationale et la convergence provinciale pour chaque pays sont examinés en utilisant différentes méthodes de mesure telles que les méthodes traditionnelles, la convergence bêta et la convergence sigma. Dans le chapitre le plus complexe, le chapitre 5, les analyses comparatives sont présentées à l'aide de données statistiques, à partir des analyses des cas régionaux et provinciaux retenus des deux pays. Au chapitre 6, ces dispositions sont complétées par une analyse des régions urbaines choisies, qui permet également des aperçus sur les régions les plus périphériques. Dans la recherche proposée pour cette thèse, la politique, la population, le revenu, l'emploi, la composition industrielle, l'investissement, le commerce et le facteur de la migration sont également pris en compte comme facteurs importants de l'analyse régionale compte tenu de la superficie du territoire des deux pays et les différences de population entre eux. Cette thèse a évalué dans quelle mesure les politiques gouvernementales ont réussi à induire la convergence régionale ou ont encore ont creusé davantage les disparités régionales, ce qui implique nécessairement une évaluation de la durabilité des patrons et des programmes de développement régional. Cette étude a également mis l'accent sur les disparités régionales et la politique de développement régional, les comparaisons entre pays, pour mesurer la convergence entre les pays et entre les régions, y compris l'analyse spatiale, d'identifier les facteurs les plus actifs tels que la population, les ressources, la politique, l'urbanisation, les migrations, l'ouverture économique et leurs différents rôles dans le développement économique de ces grands territoires (au Canada et Chine). Les résultats empiriques et les processus de convergence et de divergence offrent un cadre intéressant pour l'examen de la trajectoire de développement régionales et les disparités régionales dans les deux économies. L'approche adoptée a révélé les différentes mosaïques complexes du développement régional dans les deux pays. Les résultats de cette étude ont démontré que la disparité en termes de revenu régional est une réalité dans chaque zone géographique, et que les causes sont nombreuses et complexes. Les deux économies ont certains parallèles dans la mise en œuvre des politiques de développement économique régional, mais il existe des différences importantes aussi et elles se sont développées à différentes vitesses. Les deux économies se sont développées depuis la Seconde Guerre mondiale, mais la Chine a connu une croissance rapide que le Canada comme témoignent de nombreux indicateurs depuis 1980. Cependant, la Chine est maintenant confrontée à un certain nombre de problèmes économiques et sociaux, y compris les disparités régionales marquées, un fossé toujours croissant entre les revenus ruraux et urbains, une population vieillissante, le chômage, la pauvreté et la dégradation rapide de l'environnement avec toujours plus de demandes en énergie. Le développement économique régional en Chine est plus déséquilibré. Le Canada accuse un degré de disparités régionales et provinciales moins important que la Chine. Dans les cas provinciaux, il existe d'importantes différences et de disparités dans la structure économique et spatiale du Québec et du Xinjiang. Les disparités infra provinciales sont plus grandes que celles à l’échelle des provinces et des grandes régions (des sous-ensembles de provinces). Les mécanismes de convergence et de divergence dans les deux pays sont différents. Les résultats empiriques et les processus de convergence et de divergence offrent un cadre intéressant pour l'examen de la trajectoire de développement régionale et les disparités régionales dans les deux économies. Cette étude démontre également que l'urbanisation (les métropoles et les villes) s’avère être le facteur le plus actif et contribue à l'économie régionale dans ces grands territoires. L'ouverture a joué un rôle important dans les économies des deux pays. La migration est un facteur majeur dans la stimulation de l'économie des deux pays mais de façons différentes. Les résultats empiriques démontrent que les disparités régionales ne peuvent pas être évitées et elles existent presque partout. Il n'y a pas une formule universelle et de politiques spécifiques sont de mise pour chaque région. Mais il semble possible pour les décideurs politiques nationaux et régionaux d’essayer de maintenir l'écart à une échelle raisonnable pour éviter l'instabilité sociale.

Approches transcriptomiques dans l’étude de la fibrose kystique

Les avancées en biotechnologie ont permis l’identification d’un grand nombre de mécanismes moléculaires, soulignant également la complexité de la régulation génique. Néanmoins, avoir une vision globale de l’homéostasie cellulaire, nous est pour l’instant inaccessible et nous ne sommes en mesure que d’en avoir qu’une vue fractionnée. Étant donné l’avancement des connaissances des dysfonctionnements moléculaires observés dans les maladies génétiques telles que la fibrose kystique, il est encore difficile de produire des thérapies efficaces. La fibrose kystique est causée par la mutation de gène CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), qui code pour un canal chlorique transmembranaire. La mutation la plus fréquente (ΔF508) induit un repliement incorrect de la protéine et sa rétention dans le réticulum endoplasmique. L’absence de CFTR fonctionnel à la membrane a un impact sur l’homéostasie ionique et sur l’hydratation de la muqueuse respiratoire. Ceci a pour conséquence un défaut dans la clairance mucocilliaire, induisant infection chronique et inflammation excessive, deux facteurs fondamentaux de la physiopathologie. L’inflammation joue un rôle très important dans l’évolution de la maladie et malgré le nombre important d’études sur le sujet, la régulation du processus inflammatoire est encore très mal comprise et la place qu’y occupe le CFTR n’est pas établie. Toutefois, plusieurs autres facteurs, tels que le stress oxydatif participent à la physiopathologie de la maladie, et considérer leurs impacts est important pour permettre une vision globale des acteurs impliqués. Dans notre étude, nous exploitons la technologie des puces à ADN, pour évaluer l’état transcriptionnel d’une cellule épithéliale pulmonaire humaine fibro-kystique. Dans un premier temps, l’analyse de notre expérience identifie 128 gènes inflammatoires sur-exprimés dans les cellules FK par rapport aux cellules non FK où apparaissent plusieurs familles de gènes inflammatoires comme les cytokines ou les calgranulines. L’analyse de la littérature et des annotations suggèrent que la modulation de ces transcripts dépend de la cascade de NF-κB et/ou des voies de signalisation associées aux interférons (IFN). En outre, leurs modulations pourraient être associées à des modifications épigénétiques de leurs loci chromosomiques. Dans un second temps, nous étudions l’activité transcriptionnelle d’une cellule épithéliale pulmonaire humaine FK en présence de DMNQ, une molécule cytotoxique. Notre but est d’identifier les processus biologiques perturbés par la mutation du gène CFTR en présence du stress oxydatif. Fondé sur une analyse canonique de redondance, nous identifions 60 gènes associés à la mort cellulaire et leur variance, observée dans notre expérience, s’explique par un effet conjoint de la mutation et du stress oxydatif. La mesure de l’activité des caspases 3/7, des effecteurs de l’apoptose (la mort cellulaire programmée), montre que les cellules porteuses de la mutation ΔF508, dans des conditions de stress oxydatif, seraient moins apoptotiques que les cellules saines. Nos données transcriptomiques suggèrent que la sous-activité de la cascade des MAPK et la sur-expression des gènes anti-apoptotiques pourraient être impliquées dans le déséquilibre de la balance apoptotique.

Modulation des réactions alloimmunitaires par les cytokines maîtresses IFN-γ et TGF-β

L’injection de cellules immunologiquement compétentes à un hôte histo-incompatible amène une réaction qui peut se traduire par la maladie du greffon-contre-l’hôte (GVHD). La GVHD demeure une barrière importante à une utilisation plus répandue de la greffe allogénique de cellules hématopoïétiques (AHCT), pourtant un traitement efficace pour traiter de nombreuses maladies. Une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent cette pathologie pourrait en faciliter le traitement et la prévention. L’Interféron-gamma (IFN-γ) et le Transforming Growth Factor-béta (TGF-β) sont deux cytokines maîtresses de l’immunité impliquées dans la fonction et l’homéostasie des cellules greffées. Nous démontrons chez la souris que l’IFN-γ limite la reconstitution lympho-hématopoïétique de façon dose-dépendante en mobilisant des mécanismes d’apoptose et en inhibant la prolifération cellulaire. Le TGF-β est quant à lui généralement connu comme un immunosuppresseur qui contrôle l’immunité en utilisant plusieurs voies de signalisation. Le rôle relatif de ces voies en AHCT est inconnu. Nous avons étudié une de ces voies en greffant des cellules provenant de donneurs déficients pour le gène SMAD3 (SMAD3-KO), un médiateur central de la voie canonique du TGF-β, à des souris histo-incompatibles. Bien que l’absence de SMAD3 ne cause aucune maladie chez nos souris donneuses, l’injection de cellules SMAD3-KO amène une GVHD du colon sévère chez le receveur. Cette atteinte est caractérisée par une différenciation Th1 et une infiltration massive de granulocytes témoignant d’un rôle central de SMAD3 dans la physiologie des lymphocytes T CD4 et des cellules myéloïdes. Nous avons focalisé ensuite nos efforts sur le rôle de SMAD3 chez les lymphocytes T CD4 en sachant que SMAD3 était actif chez les lymphocytes T CD4 tolérants. Nous avons découvert que SMAD3 était rapidement inactivé après une activation des cellules T, suggérant que l’inactivation de SMAD3 était fonctionnellement importante pour briser l’état de tolérance. Des études de micro-puces d’ADNc nous ont montré que SMAD3 contrôlait en effet l’expression de nombreux transcrits de gènes connus comme étant reliés à la tolérance et/ou à des processus biologiques dont les rôles dans le maintien de la tolérance sont plausibles.

Dépistage prénatal de la trisomie 21 et autres aneuploïdies au premier trimestre

La présente thèse par articles aborde différentes facettes du dépistage prénatal de certaines aneuploïdies au premier trimestre de la grossesse. L’introduction retrace l’historique du dépistage prénatal et énonce les différents marqueurs biochimiques et échographiques associés aux aneuploïdies. La première publication démontre que le tabagisme maternel abaisse significativement les niveaux sanguins maternels de PAPP-A et de la fraction libre de la β-hCG et augmente significativement la clarté nucale, confirmant la nécessité de contrôler cette co-variable dans le calcul de risque final, du moins pour la trisomie 18. Le deuxième article identifie des seuils de clarté nucale au-delà desquels la biochimie génétique n’apporte aucune valeur additionnelle au dépistage prénatal de la trisomie 21 et de la trisomie 18. Pour les fœtus avec clarté nucale supérieure aux seuils établis, un diagnostic prénatal intrusif devrait être offert sans délai. Le troisième et dernier article porte sur la première détermination des niveaux plasmatiques maternels de la protéine FLRG (follistatin-related gene) au premier trimestre de grossesse et sur son rôle potentiel à titre de marqueur biochimique dans le dépistage prénatal de la trisomie 21. Bien que détectables, les niveaux plasmatiques maternels de FLRG ne sont pas significativement altérés en présence de fœtus avec syndrome de Down. Dans la discussion générale, les trois articles sont abordés sous un angle plus spécifique au Québec. Des données complémentaires et originales y sont présentées. Une discussion sur l’évolution future du dépistage prénatal est entamée et des axes de recherche sont proposés.

Étude du mécanisme de protection des spermatozoïdes de mammifères par le lait

Le lait écrémé est utilisé depuis plus d’un demi-siècle comme diluant protecteur des spermatozoïdes de mammifères. Depuis quelques années, il existe une demande grandissante pour des diluants exempts de produits d’origine animale. Toutefois, le mécanisme par lequel le lait protège les spermatozoïdes n’est pas connu, ce qui rend difficile de lui trouver un substitut. Les protéines majeures du plasma séminal de taureau, les protéines « Binder of SPerm » (BSP), sont néfastes lors de la conservation de la semence. Les spermatozoïdes sont en contact avec une grande concentration de protéines BSP qui stimulent une extraction continuelle de cholestérol/phospholipides de leur membrane plasmique. Les lipoprotéines de faible densité (LDL) du jaune d’oeuf, un autre composé utilisé dans les diluants, empêcheraient les protéines BSP de se lier à la membrane des spermatozoïdes de taureaux et de stimuler un efflux des lipides membranaires, ce qui les protégerait durant la conservation. Notre hypothèse était que les protéines du lait protègent les spermatozoïdes durant la conservation en séquestrant les protéines BSP. Premièrement, nous avons démontré par filtration sur gel qu’il y a une interaction entre les protéines BSP bovines et les protéines du lait. Le lait écrémé a été fractionné en trois fractions : F1 (alpha-lactalbumine, bêta-lactoglobuline et caséine kappa), F2 (toutes les protéines du lait) et F3 (sels, sucres et petits peptides). Les protéines BSP1 et BSP5 ont une affinité plus grande pour F1 que BSP3, tandis que toutes les protéines BSP ont une affinité pour F2. Le titrage calorimétrique isotherme a permis de confirmer l’interaction entre les protéines BSP et les protéines du lait. L’association entre la protéine BSP1 bovine et les micelles de caséines est caractérisée par une constante d’affinité (Ka) de 3.5 × 10^5 M-1 et un paramètre stoichiométrique (n) de 4,5 BSP1 pour une caséine. L’association entre la protéine BSP1 bovine et l’alpha-lactalbumine (une protéine du sérum principale), est caractérisée par un Ka de 2.4 × 10^5 M-1 et une valeur “n” de 0,8. Ces résultats indiquent que le lait protège les spermatozoïdes bovins en séquestrant les protéines BSP grâce à une interaction protéine : protéine, tandis que le jaune d’oeuf les protège grâce à une interaction protéine : lipoprotéine. Deuxièmement, nous avons démontré par filtration sur gel que les protéines homologues aux BSP bovines retrouvées dans le plasma séminal de porc, d’étalon et de bélier ont une affinité avec les protéines du lait, ce qui suggère que le mécanisme de protection des spermatozoïdes par le lait pourrait être le même chez ces espèces. Troisièmement, nous avons caractérisé l’interaction entre BSP1 bovine et les LDL du jaune d’oeuf qui a un Ka de 3.4 ± 0.4 × 10^6 M-1 et une valeur de « n » de 104 BSP1 pour une particule de LDL, indiquant qu’il existe des différences entre le mécanisme de protection des spermatozoïdes par le lait et le jaune d’oeuf. Nous croyons que les résultats présentés dans cette thèse aideront à créer de nouveaux diluants ne contenant pas de produits d’origine animale afin de cryoconserver les spermatozoïdes des mammifères.

Étude fonctionnelle et génétique d'une population de lymphocytes T CD4-CD8- impliquée dans la résistance au diabète auto-immun chez la souris

Le diabète auto-immun résulte de la destruction des cellules bêta pancréatiques sécrétrices d’insuline par les lymphocytes T du système immunitaire. Il s’ensuit une déficience hormonale qui peut être comblée par des injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, toutefois il demeure à ce jour impossible de guérir les patients atteints de la maladie. De façon générale, un système immunitaire sain reconnaît une multitude d’antigènes différents et assure ainsi notre défense à l’égard de différents pathogènes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons génétiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent s’activer de façon aberrante suite à la reconnaissance d’antigènes provenant du soi. C’est ce bris de tolérance qui mène au développement de pathologies auto-immunes telles que le diabète auto-immun. Afin de limiter l’auto-immunité, des mécanismes de sélection stricts permettent d’éliminer la majorité des lymphocytes T présentant une forte affinité envers des antigènes du soi lors de leur développement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes réussissent toutefois à échapper à l’apoptose et migrent en périphérie afin d’y circuler en quête d’un antigène spécifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mécanismes périphériques assurent le maintien de la tolérance immunitaire en faisant obstacle à l’activation et à la prolifération des lymphocytes T auto-réactifs. L’une des avenues afin d’inhiber le développement de réponses immunitaires aberrantes est la génération de lymphocytes T régulateurs. Ces cellules, d’origine thymique ou périphérique, peuvent arborer différents phénotypes et agissent via de multiples mécanismes afin d’inactiver et/ou éliminer les cellules impliquées dans l’apparition de pathologies auto-immunes. L’utilisation de modèles murins transgéniques a permis la mise en évidence d’une population peu caractérisée de lymphocytes T au potentiel régulateur. En effet, la proportion de ces cellules T n’exprimant pas les corécepteurs CD4 et CD8 (double négatives, DN) a été inversement corrélée à la prédisposition à l’auto-immunité chez ces ii souris. L’objectif principal de cette thèse est de démontrer la fonction immuno-régulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs génétiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observé que les lymphocytes T DN exercent une activité cytotoxique à l’égard des lymphocytes B de façon spécifique à l’antigène, via la libération de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons établi qu’un unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin d’inhiber le développement du diabète auto-immun chez des hôtes transgéniques prédisposés à la maladie. Le recours à des souris déficientes pour l’expression du gène CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prédisposition au diabète auto-immun Idd13, qui contient le gène Sirp, a été identifié pour son rôle dans la régulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse génétique a révélé que d’autres intervalles génétiques sont impliqués dans le contrôle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situé en région proximale du chromosome 12 a été validé grâce à la création de souris congéniques. Grâce aux résultats présentés dans cette thèse, notre compréhension de la biologie ainsi que de la régulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la création de thérapies cellulaires novatrices permettant de prévenir et de guérir diverses pathologies auto-immunes.

Epithelial-Mesenchymal-Transition : a proposed mechanism in the development of Bronchiolitis Obliterans

La transplantation pulmonaire pour les patients avec une maladie pulmonaire en phase terminale est leur seul espoir de survie. Malheureusement, certains greffés du poumon rencontrent des difficultés après la transplantation du poumon, dont l'un est le rejet chronique du greffon pulmonaire également connu histologiquement comme la bronchiolite oblitérante et cliniquement comme syndrome de bronchiolite oblitérante. L'étiologie exacte de la BO reste mal comprise. Certaines hypothèses suggèrent l'implication des cellules épithéliales dans le processus de remodelage des voies respiratoires, conduisant à l'obstruction des voies aériennes. Un des mécanismes proposés est un processus de transition, connue sous le nom de transition épithéliale-mésenchymateuse (TEM). Lors de ce processus, les cellules perdent leurs propriétés épithéliales, acquièrent un phénotype mésenchymateux et deviennent plus mobiles et envahissantes. Cette transformation leur permet de participer activement au processus de remodelage bronchique dans la bronchiolite oblitérante. L’induction de la TEM peut être due à certains facteurs tels que l'inflammation et l'apoptose. Le principal objectif de ce travail de maîtrise est de détecter in vivo la présence de la TEM dans des biopsies transbronchiques obtenues chez des greffés et de l’associer à leurs conditions cliniques. Le deuxième objectif est d'induire la TEM in vitro dans les cellules épithéliales des petites voies aériennes à l'aide de milieux conditionnés apoptotiques et non apoptotiques produits par les cellules endothéliales microvasculaires humaines du poumon. D’autre part, nous avons évalué si des médiateurs connus pour participer au processus de TEM tels que le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF)et le facteur de croissance transformant bêta (TGF-beta) ainsi que le perlecan sont présents dans les milieux conditionnés utilisés.

Identification de nouveaux partenaires protéiques des récepteurs couplés aux protéines G contrôlant leur transport du reticulum endoplasmique à la membrane plasmique

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande et la plus diversifiée des familles de protéines localisées à la surface cellulaire et responsables de la transmission de signaux à l’intérieur des cellules. D’intenses recherches effectuées au cours des trente dernières années ont mené à l’identification de dizaines de protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant la signalisation, la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation de ces importantes cibles pharmacologiques. Contrairement aux processus régulant l’activité des récepteurs à partir de la membrane plasmique, les mécanismes moléculaires contrôlant la biosynthèse des RCPGs dans le reticulum endoplasmique (RE) et leur transport jusqu’à la surface cellulaire sont très peu caractérisés. Une meilleure compréhension de ces processus nécessite l’identification de la machinerie protéique responsable de la maturation des RCPGs. Un crible protéomique basé sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), qui permet la mesure d’interactions protéiques dans les cellules vivantes, a mené à l’identification de plusieurs nouvelles protéines localisées dans la voie de sécrétion et interagissant potentiellement avec les RCPGs. Ces protéines étant localisées dans les compartiments cellulaires (reticulum endoplasmique et appareil de Golgi) responsables de la synthèse, du repliement adéquat et du transport à la membrane plasmique des récepteurs, il est très probable qu’elles soient impliquées dans le contrôle de l’expression des RCPGs à la surface cellulaire. La caractérisation de l’homologue humain de cornichon 4 (CNIH4), un nouvel intéracteur des RCPGs identifié dans le crible, a démontré que cette protéine localisée dans les compartiments précoces de la voie de sécrétion (RE et ERGIC) interagit de façon sélective avec les RCPGs. De plus, la suppression de l’expression endogène de cette protéine préalablement non-caractérisée, diminue le transport à la membrane plasmique d’un récepteur, indiquant que CNIH4 influence positivement l’export des RCPGs du RE. Ceci est supporté par l’observation que la surexpression de CNIH4 à de faibles niveaux favorise la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE. Nous avons également pu démontrer que CNIH4 est associée à la protéine Sec23, une des composantes de l’enveloppe des vésicules COPII qui sont responsables du transport des protéines du RE vers le Golgi, suggérant que CNIH4 pourrait favoriser le recrutement des récepteurs dans ces vésicules. La surexpression de CNIH4 à de très hauts niveaux provoque également la rétention intracellulaire des récepteurs. Cet effet dominant négatif pourrait être causé par la titration d’un autre facteur d’export des RCPGs. Une deuxième étude a permis de révéler que la protéine transmembranaire 9 (TMEM9), un nouvel intéracteur des RCPGs également identifié dans le crible, interagit sélectivement avec les récepteurs et avec CNIH4. La surexpression de cette protéine aux fonctions précédemment inconnues, rétablit le transport normal d’un récepteur en présence de CNIH4 surexprimée. De plus, la co-expression de TMEM9 potentialise la capacité de CNIH4 à augmenter la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE, suggérant que ces deux protéines forment un complexe régulant la maturation des RCPGs. Au cours de cette thèse, de nouvelles protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant leur expression à la membrane plasmique ont donc été identifiées, permettant une meilleure compréhension des mécanismes régulant le transport des récepteurs du RE à la surface cellulaire.

Synthèse et caractérisation physicochimique de peptides de polyglutamines

Neuf maladies neurodégénératives sont le produit de l’expression de gènes mutés, dans lesquels le codon CAG est répété au-delà d’un seuil pathologique. Ceci produit des protéines mutantes dans lesquelles sont insérés des segments de polyglutamines (polyGln), qui perdent leur activité et acquièrent une nouvelle fonction, ce qui est toxique pour le neurone. Ces altérations sont attribuables aux propriétés particulières de la polyGln. En effet, ces dernières possèdent la capacité de s’assembler pour former des corps d’inclusion intracellulaires. Cette propension à l’agrégation de la polyGln rend difficile l’étude de ces pathologies. C’est ainsi que l’utilisation de peptides peut s’avérer une approche avantageuse. Toutefois, la synthèse de polyGln est associée à de nombreuses délétions et nécessite l’ajout de groupements chargés afin de permettre leur purification. Cependant, ce prérequis donne lieu à des interactions électrostatiques qui biaisent la structure et la cinétique d’agrégation de ces peptides, en plus d’interférer avec l’évaluation d’éventuels agents thérapeutiques. L’objectif du projet est de développer un système permettant l’étude de la polyGln en s’affranchissant des effets de charges. Pour ce faire, deux approches ont été explorées, la première utilise la polyGln non chargée et la seconde utilise une structure polyGln-morpholine ayant des charges labiles en fonction du pH. Ces peptides ont été produits en utilisant une approche linéaire de synthèse peptidique sur support solide avec protection maximale des chaînes latérales. La purification a été effectuée par chromatographie de haute performance en phase inverse en milieu acide. Ces stratégies ont permis de produire des peptides de polyGln de grande pureté avec des rendements acceptables. Une procédure de solubilisation des peptides alliant sonication et lyophilisation a été développée afin d’étudier chacun de ces peptides à l’aide de diverses techniques physicochimiques, telles que la diffusion de la lumière, la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire, Raman et UV-visible, le dichroïsme circulaire et la microscopie optique polarisée. La polyGln non chargée solubilisée dans le trifluoroéthanol-eau a montré que la taille des particules et la vitesse d’agrégation sont proportionnelles à la fraction volumique en eau. De plus, la structure secondaire en solution est à prédominance alpha et semble être peu sensible à la fraction d’eau jusqu’à un certain seuil (25%) après lequel la structure aléatoire prédomine. L’analyse des agrégats à l’état solide montre des structures hélicoïdales > aléatoires et ont les caractéristiques des fibrilles amyloïdes. Le peptide de polyGln-morpholines a un pKa de 7,3 en milieu aqueux. Il demeure en solution lorsque le pH < pKa et à faible force ionique, alors qu’il s’autoassemble lorsque ces conditions ne sont pas respectées. Ceci suggère que la répulsion électrostatique est responsable de la stabilisation du peptide en solution. La dimension fractale nous indique que le peptide forme des agrégats compacts dont les constituants ont une taille de 2,5 nm, compatibles avec une conformation aléatoire compacte, en coude bêta ou hélicoïdale. Ceci est en accord avec l’étude structurale des peptides en solution qui a montré des espèces aléatoires > bêta > alpha. De plus, en RMN, l’élargissement des signaux du 1Hγ en cours d’agrégation suggère une interaction via les chaînes latérales. Les analyses en phase solide ont plutôt montré une prédominance de structures bêta et alpha. L’inhibition de l’agrégation à pH 8 varie selon rouge de Congo > tréhalose, alors que le peptide liant la polyGln 1 et la thioflavine T ne semble pas avoir d’effet. Ces approches ont donc permis pour la première fois de s’affranchir des effets de charges auparavant inhérents à l’étude de la polyGln en solution et par conséquent d’obtenir des informations inédites quant à la solubilité, la structure et la cinétique d’agrégation. Enfin, le dispositif à charges labiles permet d’évaluer l’efficacité d’éventuels agents thérapeutiques à pH quasi physiologique.