Espermatogênese xenogênica pós-transplante de células tronco caninas no testículo de camundongos

As células tronco espermatogoniais (SSCs) são caracterizadas pela capacidade de autorrenovação, proliferação e transmissão das informações genéticas. Em caninos a primeira tentativa de xenotransplante não obteve o sucesso da produção de espermatozoides, no entanto, há evidências de que as células testiculares xenogênicas podem ser transplantadas no testículo do animal hospedeiro, e gerar espermatozoides viáveis do doador. Portanto, este estudo tem como objetivo realizar o xenotransplante das células germinativas caninas em camundongos imunosuprimidos, e com isto promover à produção de espermatozoides caninos viáveis, geneticamente modificados. E por meio desta técnica, analisar a eficiência da espermatogênese pós-transplante. Células germinativas testiculares foram caracterizadas, isoladas e cultivadas de cães pré-púberes, por meio de sistemas de cultura de enriquecimento e fatores de crescimento. As células foram transduzidas com um gene repórter GFP e LacZ, e por um vetor lentiviral para indentificar as SSCs nos testículos receptores. As SSCs transduzidas foram transplantadas nos testículos de camundongos (C57BL/6) tratados com Busulfan, após diferentes períodos os animais receptores foram eutanasiados e analisados. Aos 10 dias de cultivo as células germinativas adultas foram positivas para CD49f, CD117, e com 5 dias uma expressão semelhante de GFRA1 e DAZL, demonstrando a presença de SSCs e algumas células em meiose. Transplantamos 105 células e 20-43% das células transplantadas foram identificadas na membrana basal dos túbulos seminíferos do animal receptor. Portanto, o transplante das células germinativas caninas, mostrou que a purificação e o cultivo realizados são possíveis para obter SSCs caninas, as quais colonizaram os túbulos seminíferos dos camundongos imunodeficientes e mantiveram-se vivas na membrana basal por 90 dias após transplante, mesmo que estes animais tenham distância filogenética

Contribuição das células-tronco mesenquimais para as propriedades tumorigênicas de células de glioblastoma humano

Células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam tropismo a tumores, sendo importantes componentes do estroma tumoral. No cérebro, o nicho perivascular é uma importante fonte de CTM, as quais podem contribuir direta e/ou indiretamente para o desenvolvimento de tumores, embora os mecanismos envolvidos sejam pouco conhecidos. No presente trabalho, investigou-se a influência de CTM sobre a proliferação, capacidade invasiva e tumorigenicidade de células de Glioblastoma (GBM) humano. Sabe-se que CTM produzem TGFB1, uma citocina multifuncional envolvida em imunomodulação, proliferação, migração e transição epitelial-mesenquimal de células tumorais. Experimentos in vitro, realizados com meios condicionados de CTM de cordão umbilical humano com silenciamento permanente do gene TGFB1, demonstraram que o TGFB1 secretado por CTM é capaz de aumentar significativamente a proliferação e viabilidade de células de GBM humano da linhagem U87FP635. Esses resultados revelam uma importante ação parácrina dessa citocina regulatória, quando produzida por outros tipos celulares contidos no microambiente tumoral. Entretanto, sob condições experimentais que melhor mimetizam o microambiente tumoral, detectou-se que CTM também afetam o comportamento de células tumorais por um mecanismo alternativo, dependente de contato celular, mas independente dos níveis de TGFB1 secretados pelas CTM. Sob condições de cocultivo celular, envolvendo contato físico entre CTM e células de GBM U87FP635, detectou-se um aumento significativo na quantidade de células tumorais viáveis. Quando cultivadas na forma de esferoides tumorais, o contato com CTM aumentou a capacidade invasiva das células U87FP635. Finalmente, em modelo in vivo ectópico de GBM, células U87FP635 geraram tumores mais desenvolvidos quando coinjetadas com CTM. Esses efeitos pró-tumorigênicos foram observados tanto em contato com CTM controles, quanto com CTM contendo o gene TGFB1 permanentemente silenciado. Assim, esses achados indicam que CTM podem exercer efeitos pró-tumorigênicos por dois mecanismos alternativos e independentes: ação parácrina de TGFB1 secretado por CTM e ação mediada por contato célula-célula. Nas condições experimentais testadas, o mecanismo dependente de contato célula-célula demonstrou ser predominante. O estudo proteômico do secretoma dessas células identificou 126 proteínas diferencialmente expressas além de 10 proteínas exclusivamente detectadas em meios condicionados de cocultivos de CTM com células de GBM U87FP635. Cerca de 80% dessas proteínas exclusivamente secretadas pelo contato célula-célula são componentes de exossomos e estão envolvidas em proliferação celular e desenvolvimento tecidual. Esses resultados apontam uma interação dinâmica de comunicação entre CTM e células tumorais, e revelam algumas proteínas interessantes potencialmente envolvidas em uma ação pró-tumorigênica de CTM mediada por contato celular

Células-tronco localizadas na cinta placentária de carnívoros domésticos (Canis familiaris e Felis domesticus)

As células-tronco podem ser isoladas tanto de tecidos embrionários quanto de tecidos provenientes de um organismo adulto. Este projeto teve por objetivo caracterizar, descrever as células derivadas da região uterina e da cinta placentária junção materno/fetal da placenta de carnívoros domésticos (cães e gatos), e verificar a sua capacidade de pluripotência. Os úteros gestantes e não gestantes foram obtidos em campanhas de castrações e de controle populacional de cães e gatos, na cidade de Pirassununga/SP. Foram coletados 24 úteros gravídicos de animais hígidos, em diferentes idades gestacionais. O material foi dividido em três fases distintas da gestação, ou seja inicio que compreende de 8 a 20 dias de gestação; meio de 21 a 30 dias de gestação e final de 31 a 60 dias de gestação. O material foi coletado de fêmeas caninas e felinas, quatro úteros de cada fase, totalizando 12 úteros de cães e 12 de felinos. Coletamos também 8 úteros de fêmeas nulíparas (4 de cadelas e 4 de gatas) e 8 úteros com um mês pós parto (4 de cadelas e 4 de gatas). As amostras foram fixadas em paraformoldeido tamponado a 4% para a análise histológica e de imunohistoquimica. Para a padronização da imunohistoquimica inúmeros testes de marcação e diluição dos anticorpos utilizados nesta pesquisa foram realizados, todo protocolo aqui descrito foi padronizado pela primeira vez. Nas análises de imunohistoquimica avaliamos a expressão de marcadores associados a células-tronco pluripotentes Nanog, Oct4 e Sox2. Nas cadelas, as marcações foram positivas em todas as fases, gestacionais e não gestacionais. A detecção dessas proteínas nesta espécie ficaram padronizadas, destacando algumas diferenças quantitativas durante alguns períodos da gestação. Foi observado que o Oct4 na cadela, mostra uma diferença significativa (p=0,0064), entre as fases de início e meio da gestação e entra o início e a fase de termo. Quando comparados os resultados das análises imunohistoquimicas utilizando os três anticorpos entre si, nos três períodos gestacionais ficou evidente uma diferença (p=0,0005) somente relativa a proteína Nanog com Oct4. Nas gatas apenas foi possível padronizar o protocolo do Nanog e do Sox2, sendo a marcação feita com Oct4 negativa. Nesta espécie foi possível observar uma diferença da proteína Nanog (p=0,0006) quando comparada na fase inicial para a fase do meio e início da gestação para a fase termo. No que se refere as fêmeas nulíparas e fêmeas pós-parto destaca-se a ausência de diferenças quando comparados os anticorpos na fase pós parto tanto em cadelas quanto em gatas. Na fase nulípara foram observadas diferenças somente na cadela (p=0,0018) para os três anticorpos. Desta forma, a caracterização de células de origem placentária com característica de células tronco pode abrir um leque de possibilidades para obtenção destas células de forma mais ética, uma vez que este material é descartado na castrações. Foi possível a identificação das células que expressão proteínas pluripotentes em diferentes idades gestacionais, tanto na região de cinta placentária como no útero. Apesar de semelhantes, as espécies aqui estudadas apresentaram diferenças na realização do protocolo da imunihistoquímica. Pesquisas relacionadas com as células-tronco do endométrio vêm crescendo, principalmente porque estas células podem ser facilmente obtidas, a partir de fontes descartadas, sem entraves éticos. Desta forma tem o potencial de serem uma nova fonte para o desenvolvimento na terapêutica como terapia celular

Análise comparativa de enxertos de gordura em refinamentos de reconstrução mamária com e sem suplementação de células-tronco

INTRODUÇÃO: Os enxertos de gordura tem se mostrado como uma poderosa técnica cirúrgica em reconstrução mamaria secundária e os enxertos enriquecidos com células-tronco, além de suas ações parácrinas, vem apresentando resultados encorajadores no que tange a persistência volumétrica. OBJETIVO: Este estudo clínico teve como objetivo analisar comparativamente quantitativa e qualitativamente enxertos de gordura enriquecidos com células da fração vásculoestromal em reconstrução mamária secundária e a incidência de complicações. MÉTODO: Nós desenvolvemos um método que produz enxertos de gordura, na sala de cirurgia, em uma taxa de enriquecimento maior que os já publicados (2:1). Este estudo clínico prospectivo e controlado analisou qualitativa e quantitativamente enxertos de gordura com (GT - grupo tronco) e sem (GC - grupo controle) adição das células da fração vásculo-estromal fresca em reconstrução mamária secundária; através de volumetria mamária por RNM de mamas, imunofenotipagem e contagem celular. Também foram estudados os resultados estéticos, a satisfação das pacientes e as complicações. RESULTADOS: A persistência volumétrica no GT foi 78,9% e 51,4% no GC, entretanto não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos. CD90 foi o marcador mais expresso e que alcançou diferença significante e ao mesmo tempo apresentou correlação positiva entre a sua expressão e a persistência volumétrica (r=0.651, p=0.03). Necrose gordurosa ocorreu, isoladamente em 4 pacientes do GT submetidas à radioterapia e nenhuma paciente do GC apresentou este evento. Desta forma, pacientes do GC mostraram tendência de estar mais satisfeitas com o enxerto de gordura. Nos dois grupos, os resultados estéticos foram iguais e não foram observadas recidivas loco-regionais. CONCLUSÃO: Os resultados do enriquecimento em uma taxa maior que as já publicadas são encorajadores, apesar de a persistência volumétrica não ter alcançado diferença estatisticamente significante entre os grupos. Enxertos de gordura enriquecidos na proporção 2:1 podem não ser indicados para pacientes submetidas à radioterapia apesar de terem se mostrados seguros num tempo de seguimento de 3 anos

Reprogramação de células-tronco mesenquimais em neurônios utilizando genes pró-neurais

A possibilidade de repor células perdidas em doenças neurodegenerativas através de transplantes com células-troncos das mais diversas fontes vem sendo amplamente estudada. As células-tronco adultas (CTA) podem ser facilmente isoladas e sua utilização na pesquisa não envolve questões éticas e religiosas. Além disso, estas células são menos propícias à transformação tumoral do que células-tronco embrionárias, outra importante fonte de células para terapias celulares. No entanto, as CTA são, em estados fisiológicos, restritas a geração de células dos seus tecidos de origem, o que poderia limitar a sua utilização. Porém, nos últimos anos, uma série de técnicas vem sendo descritas com o objetivo de reverter tais limitações. Neste trabalho, nós investigamos a capacidade das células-tronco mesenquimais adultas, isoladas de camundongos ou do cordão umbilical humano, serem induzidas a adquirir um fenótipo neuronal de forma direta, sem passar por um estágio de célula progenitora ou pluripotente, através da reprogramação genética com genes pró-neurais. Nossos resultados indicam que tanto células-tronco mesenquimais adultas murinas quanto humanas podem ser reprogramadas em neurônios após a expressão combinada de Sox2 e Ascl1 ou Sox2 e Neurog2. As células reprogramadas exibem morfologias compatíveis com o fenótipo neuronal, expressam proteínas típicas de neurônios maduros, apresentam a capacidade de gerar potenciais de ação repetitivos e formam conexões sinápticas com outros neurônios presentes no cultivo. Portanto, nosso trabalho apresenta a primeira evidência de reprogramação direta de células-tronco mesenquimais humanas em neurônios funcionais.

Impacto de andrógenos sobre a proliferação e atividade de fibroblastos e células epiteliais em cultura celular

Pós-graduação em Odontologia - FOAR

Cenário internacional da pesquisa em células-tronco embrionárias

OBJETIVO:Analisar comparativamente regulações governamentais entre países sobre pesquisa em células-tronco embrionárias. MÉTODOS:O estudo foi conduzido entre março e maio de 2008, por meio de busca eletrônica direta nas fontes oficiais sobre documentos legislativos de 25 países selecionados e confirmada, quando necessário, por consulta por e-mail a pesquisadores e autoridades desses países. RESULTADOS: Os resultados mostraram tendência a permitir a prática de pesquisas com células-tronco embrionárias, embora com rígidas restrições éticas. Dentre os países estudados, apenas Itália e Alemanha explicitamente condenam a extração de células-tronco e apenas Itália proíbe seu uso subseqüente. Decisões jurídicas brasileiras recentes são coerentes com o contexto regulatório internacional sobre pesquisa embrionária. CONCLUSÕES: A tendência observada representa a liberdade de pesquisa para a promoção do conhecimento como um bem público, reforçada pela expectativa de potencialidade terapêutica na pesquisa com células-tronco embrionárias para o tratamento e cura de doenças sem qualquer possibilidade de assistência médica.

Transplante de Células-tronco marcadas para o miocárdio de paciente com doença de chagas

O transplante de células-tronco é uma nova terapia com objetivo de produzir regeneração cardíaca pela diferenciação ou aumento dos miócitos cardíacos ou proliferação neovascular em pacientes no estágio final de insuficiência cardíaca congestiva secundária a cardiomiopatia dilatada¹, mas os resultados são desconhecidos2,3.

Motilidad Orientada de Células Neurales: La comunicación celular a distancia. Oriented neural cell motility: Cell comunication at a distance.

La motilidad celular orientada (o mecanismo quimiotáctico de orientación), es una respuesta celular a señales moleculares de su micro-ambiente necesaria para modular la distribución celular en sitios específicos y con elevada precisión. Nuestra hipótesis establece que la migración orientada de células neurales es regulada por gradientes de concentración de moléculas solubles liberadas por sus regiones "blanco". Este proyecto es continuación del estudio de la quimiotaxis de células de cresta neural (CCN) y de neuronas ventriculares (NV) inducida respectivamente por factores difusibles de la región del futuro ganglio ciliar y del bulbo olfatorio.En el sistema de CCN, hemos caracterizado como moléculas quimiotácticas a la quimioquina Stromal Cell-Derived Factor-1, y los factores tróficos Stem Cell Factor y Neurotrophic Factor-3, habiendo determinado la expresión de sus respectivos receptores CXCR4, TrkC y p75 en la población de CCN mesencefálicas de ambrión de pollo. Actualmente, estamos desarrollando experimentos con el Ciliary Neurotrophic Factor y factores de la familia Bone Morphogenetic Proteins. Además de la estrategia experimental in vitro, hemos determinado en el embrión entero la expresión de las moléculas quimioatractantes mediante hibridación in situ del ARNm y la presencia de las respectivas proteínas mediante inmunocitoquímica. En el sistema de NV, estamos analizando la motilidad celular en relación con moléculas liberadas por el bulbo olfatorio. En los dos sistemas biológicos, estamos analizando elementos de la transducción de señales y cambios en el citoesqueleto, en ambos casos asociados con la respuesta temprana en la orientación quimiotáctica de la célula. Asimismo, en ambos sistemas biológicos, evaluamos los efectos del etanol sobre la migración y distribución celular, en condiciones equivalentes a las que inducen el Sindrome Fetal Alcohólico en mamíferos.En base a resultados ya obtenidos en experimentos in vitro, en la presente etapa intentaremos su caracterización in vivo mediante el bloqueo funcional de las moléculas quimiotácticas (y/o sus receptores) sobre embriones enteros, mediante silenciamiento con ARNsi (o morfolinos específicos) mediante electroporación, y posterior determinación de la distribución celular mediante marcadores específicos anti-CCN (o lipofílicos de tipo DiI).Los resultados permitirán mejorar el conocimiento del mecanismo de la migración celular orientada y aportar al diseño de recursos diagnósticos, terapéuticos o de control de anomalías embrionarias o patologías tumorales por mala distribución celular como las Neurocristopatías, o inducidas por tóxicos exógenos como el Sindrome Fetal Alcohólico.