Étude des propriétés de transport dans les hydrogels de curdlan

Les hydrogels de polysaccharide sont des biomatériaux utilisés comme matrices à libération contrôlée de médicaments et comme structures modèles pour l’étude de nombreux systèmes biologiques dont les biofilms bactériens et les mucus. Dans tous les cas, le transport de médicaments ou de nutriments à l’intérieur d’une matrice d’hydrogel joue un rôle de premier plan. Ainsi, l’étude des propriétés de transport dans les hydrogels s’avère un enjeu très important au niveau de plusieurs applications. Dans cet ouvrage, le curdlan, un polysaccharide neutre d’origine bactérienne et formé d’unités répétitives β-D-(1→3) glucose, est utilisé comme hydrogel modèle. Le curdlan a la propriété de former des thermogels de différentes conformations selon la température à laquelle une suspension aqueuse est incubée. La caractérisation in situ de la formation des hydrogels de curdlan thermoréversibles et thermo-irréversibles a tout d’abord été réalisée par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR) en mode réflexion totale atténuée à température variable. Les résultats ont permis d’optimiser les conditions de gélation, menant ainsi à la formation reproductible des hydrogels. Les caractérisations structurales des hydrogels hydratés, réalisées par imagerie FT-IR, par microscopie électronique à balayage en mode environnemental (eSEM) et par microscopie à force atomique (AFM), ont permis de visualiser les différentes morphologies susceptibles d’influencer la diffusion d’analytes dans les gels. Nos résultats montrent que les deux types d’hydrogels de curdlan ont des architectures distinctes à l’échelle microscopique. La combinaison de la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) à gradients pulsés et de l’imagerie RMN a permis d’étudier l’autodiffusion et la diffusion mutuelle sur un même système dans des conditions expérimentales similaires. Nous avons observé que la diffusion des molécules dans les gels est ralentie par rapport à celle mesurée en solution aqueuse. Les mesures d’autodiffusion, effectuées sur une série d’analytes de diverses tailles dans les deux types d’hydrogels de curdlan, montrent que le coefficient d’autodiffusion relatif décroit en fonction de la taille de l’analyte. De plus, nos résultats suggèrent que l’équivalence entre les coefficients d’autodiffusion et de diffusion mutuelle dans les hydrogels de curdlan thermo-irréversibles est principalement due au fait que l’environnement sondé par les analytes durant une expérience d’autodiffusion est représentatif de celui exploré durant une expérience de diffusion mutuelle. Dans de telles conditions, nos résultats montrent que la RMN à gradients pulsés peut s’avérer une approche très avantageuse afin de caractériser des systèmes à libération contrôlée de médicaments. D’autres expériences de diffusion mutuelle, menées sur une macromolécule de dextran, montrent un coefficient de diffusion mutuelle inférieur au coefficient d’autodiffusion sur un même gel de curdlan. L’écart mesuré entre les deux modes de transport est attribué au volume différent de l’environnement sondé durant les deux mesures. Les coefficients d’autodiffusion et de diffusion mutuelle similaires, mesurés dans les deux types de gels de curdlan pour les différents analytes étudiés, suggèrent une influence limitée de l’architecture microscopique de ces gels sur leurs propriétés de transport. Il est conclu que les interactions affectant la diffusion des analytes étudiés dans les hydrogels de curdlan se situent à l’échelle moléculaire.

Réinventer la stratégie d’affirmation de puissance dans le contexte post-Guerre froide : la réponse de la Chine à l’hégémonie américaine

Ce mémoire analyse la stratégie d’affirmation de puissance mise en oeuvre par la Chine dans le contexte post-Guerre froide, caractérisé par la seule superpuissance des États-Unis, en utilisant le cadre théorique du réalisme offensif. Challenger désigné des États-Unis, la Chine a basculé dans le 21ème siècle avec un défi important à relever. La prépondérance américaine continue d’être une donnée essentielle dans le système politique mondial. Les États-Unis produisent plus du quart du total de l’économie mondiale et comptent pour près de la moitié des dépenses militaires. La Chine, de son côté, avec ses 1.3 milliards d’habitants, une croissance économique quasiexponentielle, dotée d’un arsenal nucléaire conventionnel, est la principale puissance émergente, avec le potentiel de rivaliser avec les États-Unis dans les affaires mondiales. Mais, vu l’énorme écart qui les sépare, pour la Chine la question de l’hégémonie américaine se pose sous la forme d’une équation dont la seule variable connue est le potentiel de l’adversaire à affronter. Le principal problème auquel la Chine est confrontée est dès lors sa capacité de penser une stratégie sans toutefois courir le risque de provoquer la seule superpuissance du globe. Par conséquent, cette étude analyse les politiques et actions stratégiques développées par la Chine à la lumière des contraintes que lui impose un environnement international peu favorable. Elle s’intéresse en particulier à la manière dont Beijing a su exploiter avec maestria une des armes les plus redoutables de l’ère post-Guerre froide, sa puissance économique, afin de consolider son ascension au rang de grande puissance. Elle soutient que, tenant compte d’un retard considérable à combler, la Chine a entrepris de balancer la superpuissance américaine d’une manière pragmatique. A cet effet, elle a conçu une stratégie qui comprend deux grands piliers : sur le plan interne, des réformes économiques et militaires ; sur le plan externe, une diplomatie agressive et efficace en adéquation avec ses ambitions de puissance. Nous concluons qu’une telle stratégie vise à éviter à la Chine pour le moment tout risque de confrontation directe qui aurait pour principal effet de nuire à son ascension. Cependant, à mesure que sa puissance s’accroît, elle pourrait afficher une posture plus agressive, quitte à engager également, avec la seule superpuissance du monde, des compétitions de nature sécuritaire en Asie et au-delà de cette région.

Étude de la sortie du virus herpès simplex de type 1 (HSV 1) hors du noyau

Le virus herpès simplex de type 1 (HSV 1) affecte la majorité de la population mondiale. HSV 1 cause de multiples symptômes délétères dont les plus communs sont les lésions orofaciales usuellement appelées feux sauvages. Le virus peut aussi causer des effets plus sérieux comme la cécité ou des troubles neurologiques. Le virus réside de façon permanente dans le corps de son hôte. Malgré l’existence de nombreux traitements pour atténuer les symptômes causés par HSV 1, aucun médicament ne peut éliminer le virus. Dans le but d’améliorer les connaissances concernant le cycle viral de HSV 1, ce projet cible l’étude du transport du virus dans la cellule hôte. Ce projet aura permis la collecte d’informations concernant le modus operandi de HSV 1 pour sortir des compartiments cellulaires où il séjourne. Les différentes expérimentations ont permis de publier 3 articles dont un article qui a été choisi parmi les meilleurs papiers par les éditeurs de « Journal of Virology » ainsi qu’un 4e article qui a été soumis. Premièrement, un essai in vitro reproduisant la sortie de HSV 1 du noyau a été mis sur pied, via l’isolation de noyaux issus de cellules infectées. Nous avons démontré que tout comme dans les cellules entières, les capsides s’évadent des noyaux isolés dans l’essai in vitro en bourgeonnant avec la membrane nucléaire interne, puis en s’accumulant sous forme de capsides enveloppées entre les deux membranes nucléaires pour finalement être relâchées dans le cytoplasme exclusivement sous une forme non enveloppée. Ces observations appuient le modèle de transport de dé-enveloppement/ré-enveloppement. Deuxièmement, dans le but d’identifier des joueurs clefs viraux impliqués dans la sortie nucléaire du virus, les protéines virales associées aux capsides relâchées par le noyau ont été examinées. La morphologie multicouche du virus HSV 1 comprend un génome d’ADN, une capside, le tégument et une enveloppe. Le tégument est un ensemble de protéines virales qui sont ajoutées séquentiellement sur la particule virale. La séquence d’ajout des téguments de même que les sites intracellulaires où a lieu la tégumentation sont l’objet d’intenses recherches. L’essai in vitro a été utilisé pour étudier cette tégumentation. Les données recueillies suggèrent un processus séquentiel qui implique l’acquisition des protéines UL36, UL37, ICP0, ICP8, UL41, UL42, US3 et possiblement ICP4 sur les capsides relâchées par le noyau. Troisièmement, pour obtenir davantage d’informations concernant la sortie de HSV 1 des compartiments membranaires de la cellule hôte, la sortie de HSV 1 du réseau trans golgien (TGN) a aussi été étudiée. L’étude a révélé l’implication de la protéine kinase D cellulaire (PKD) dans le transport post-TGN de HSV 1. PKD est connue pour réguler le transport de petits cargos et son implication dans le transport de HSV 1 met en lumière l’utilisation d’une machinerie commune pour le transport des petits et gros cargos en aval du TGN. Le TGN n’est donc pas seulement une station de triage, mais est aussi un point de rencontre pour différentes voies de transport intracellulaire. Tous ces résultats contribuent à une meilleure compréhension du processus complexe de maturation du virus HSV 1, ce qui pourrait mener au développement de meilleurs traitements pour combattre le virus. Les données amassées concernant le virus HSV 1 pourraient aussi être appliquées à d’autres virus. En plus de leur pertinence dans le domaine de la virologie, les découvertes issues de ce projet apportent également de nouveaux détails au niveau du transport intracellulaire.

Caractérisation fonctionnelle de la GTPase Ran dans le cancer épithélial de l'ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire est le plus létal des cancers gynécologiques. Les tumeurs de l’ovaire se divisent en différentes classes reflétant l’étendue de la maladie. Les tumeurs à faible potentiel de malignité présentent une survie relative à 5 ans de 90%, alors que pour les tumeurs invasives, la survie à 5 ans chute drastiquement à 35-40%. Au laboratoire, nous avons précédemment identifié la protéine Ran, un membre de la superfamille des GTPases Ras, comme marqueur fortement exprimé dans les cancers épithéliaux de l’ovaire de haut grade et de haut stade dont la surexpression est associée à un mauvais pronostic. Ran est déjà connue pour contribuer au transport nucléocytoplasmique et à la progression du cycle cellulaire, mais son rôle dans le cancer ovarien n’est pas bien défini. En utilisant une approche de shRNA inductibles à la tétracycline basée sur les lentivirus, nous avons montré que la diminution de l’expression de Ran dans des lignées cellulaires agressives du cancer de l’ovaire affecte drastiquement la prolifération cellulaire par l’induction d’une apoptose caspase-3 dépendante. Par un essai de tumeurs en xénogreffes, nous avons démontré que la déplétion de Ran résulte en une diminution de la tumorigenèse et que la formation éventuelle de tumeurs est associée à une sélection des cellules tumorales ayant la capacité de ré-exprimer la protéine Ran. Ces résultats suggèrent un rôle critique pour Ran dans la survie et la tumorigénicité des cellules du cancer ovarien, indiquant que Ran pourrait être une cible thérapeutique intéressante.

Trafic intracellulaire de l’ARN de la télomérase chez Saccharomyces cerevisiæ : relation entre biogénèse de la télomérase et homéostasie des télomères

Le contrôle de la longueur des télomères est une étape critique régissant le potentiel réplicatif des cellules eucaryotes. A cause du problème de fin de réplication, les chromosomes raccourcissent à chaque cycle de division. Ce raccourcissement se produit dans des séquences particulières appelées télomères. La longueur des télomères est en relation directe avec les capacités prolifératives des cellules et est responsable de la limite de division de Hayflick. Cependant, dans certains types cellulaires et dans plus de 90% des cancers, la longueur des télomères va être maintenue par une enzyme spécialisée appelée télomérase. Encore aujourd’hui, comprendre la biogénèse de la télomérase et savoir comment elle est régulée reste un élément clé dans la lutte contre le cancer. Depuis la découverte de cette enzyme en 1985, de nombreux facteurs impliqués dans sa maturation ont été identifiés. Cependant, comment ces facteurs sont intégrés dans le temps et dans l’espace, afin de produire une forme active de la télomérase, est une question restée sans réponse. Dans ce projet, nous avons utilisé la levure Saccharomyces cerevisiæ comme modèle d’étude des voies de biogénèse et de trafic intracellulaire de l’ARN de la télomérase, en condition endogène. La première étape de mon travail fut d’identifier les facteurs requis pour l’assemblage et la localisation de la télomérase aux télomères en utilisant des techniques d’Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH). Nous avons pu montrer que la composante ARN de la télomérase fait la navette entre le noyau et le cytoplasme, en condition endogène, dans les cellules sauvages. Nos travaux suggèrent que ce trafic sert de contrôle qualité puisqu’un défaut d’assemblage de la télomérase conduit à son accumulation cytoplasmique et prévient donc sa localisation aux télomères. De plus, nous avons identifié les voies d’import/export nucléaire de cet ARN. Dans une deuxième approche, nous avons réussi à développer une méthode de détection des particules télomérasiques in vivo en utilisant le système MS2-GFP. Notre iv étude montre que contrairement à ce qui a été précédemment décrit, la télomérase n’est pas associée de façon stable aux télomères au cours du cycle cellulaire. En fin de phase S, au moment de la réplication des télomères, la télomérase se regroupe en 1 à 3 foci dont certains colocalisent avec les foci télomériques, suggérant que nous visualisons la télomérase active aux télomères in vivo. La délétion des gènes impliqués dans l’activation et le recrutement de la télomérase aux télomères entraine une forte baisse dans l’accumulation des foci d’ARN au sein de la population cellulaire. Nos résultats montrent donc pour la première fois la localisation endogène de l’ARN TLC1 in situ et in vivo et propose une vue intégrée de la biogenèse et du recrutement de la télomérase aux télomères.

Effet de la thérapie de resynchronisation cardiaque sur les fonctions ventriculaires gauche et droite

La thérapie de resynchronisation cardiaque (CRT) est un traitement qui vise à rétablir le synchronisme de contraction du ventricule gauche chez les patients souffrant d’insuffisance cardiaque. Aujourd’hui encore, plus de 30% de ces patients ne répondent pas au traitement de resynchronisation. Afin de mieux comprendre les effets de la CRT sur la fonction cardiaque, un resynchronisateur biventriculaire a été implanté chez des chiens sains et des chiens atteints d’insuffisance cardiaque. Les fonctions ventriculaires gauche et droite ont été étudiées selon différents modes de resynchronisation. Les résultats de cette étude confirment premièrement que la durée du complexe QRS n’est pas un marqueur approprié dans l’optimisation de la CRT. Les résultats démontrent également qu’une optimisation individualisée de la CRT est nécessaire afin de maximiser l’effet de la thérapie sur le ventricule gauche et que la modulation du délai de resynchronisation a un impact significatif sur la fonction ventriculaire droite. Plus précisément, la fonction systolique du ventricule droit est optimale lors d’une activation précoce de l’électrode gauche.

Étude des aimants quantiques et supraconducteurs non conventionnels

Une première partie de ce mémoire portera sur l’analyse des états fondamentaux ma- gnétiques de deux composés isolants et magnétiquement frustrés SrDy2O4 et SrHo2O4. Une étude de la chaleur spécifique à basse température sous l’effet de champs magné- tiques de ces échantillons a été menée afin de détecter la présence de transitions de phases. L’utilisation d’un composé isotructurel non magnétique, le SrLu2O4, a permis l’isolement de la composante magnétique à la chaleur spécifique. Les comportements observés sont non conformes avec les transitions magnétiques conventionnelles. De plus, le calcul de l’entropie magnétique ne montre qu’un recouvrement partiel de l’entropie associée à un système d’ions magnétiques. En second lieu, une analyse des oscillations quantiques de Haas-van Alphen a été effectuée dans le LuCoIn5, composé apparenté au supraconducteur à fermions lourds CeCoIn5. Les résultats obtenus montrent une topologie de la surface de Fermi très différente comparativement aux CeCoIn5 et LaCoIn5, ayant un comportement beaucoup plus tridimensionnel sans les cylindres caractéristiques présents chez les autres membres de cette famille. Finalement, le montage d’un système de détection PIXE a permis l’analyse nucléaire d’échantillons afin de déterminer la concentration de chacun des éléments les constituant. L’analyse a été effectuée sur une série d’échantillons YbxCe1−xCoIn5 dont le changement de concentration a des effets importants sur les propriétés du système.

A mechanism for co-transcriptional recruitment of mRNA localization factor on nascent mRNAs in budding yeast

Le transport et la localisation des ARN messagers permettent de réguler l’expression spatiale et temporelle de facteurs spécifiques impliqués dans la détermination du destin cellulaire, la plasticité synaptique, la polarité cellulaire et la division asymétrique des cellules. Chez S.cerevisiæ, plus de trente transcrits sont transportés activement vers le bourgeon cellulaire. Parmi ces transcrits, l’ARNm ASH1 (asymetric synthesis of HO) est localisé à l’extrémité du bourgeon pendant l’anaphase. Ce processus va entrainer une localisation asymétrique de la protéine Ash1p, qui sera importée uniquement dans le noyau de la cellule fille, où elle entraine le changement de type sexuel. La localisation asymétrique de l’ARNm ASH1, et donc de Ash1p, implique la présence de différents facteurs de localisation. Parmi ces facteurs, les protéines She (She1p/Myo4p, She2p et She3p) et les répresseurs traductionnels (Puf6p, Loc1p et Khd1p) participent à ce mécanisme. La protéine navette She2p est capable de lier l’ARNm ASH1 et va entrainer le ciblage de cet ARNm vers l’extrémité du bourgeon en recrutant le complexe She3p-Myo4p. Des répresseurs traductionnels régulent la traduction de cet ARNm et évitent l’expression ectopique de la protéine Ash1p pendant son transport. Alors que la fonction cytoplasmique de She2p sur la localisation des ARNm est connue, sa fonction nucléaire est encore inconnue. Nous avons montré que She2p contient une séquence de localisation nucléaire non classique qui est essentielle à son import nucléaire médié par l’importine α (Srp1p). L’exclusion de She2p du noyau par mutation de son NLS empêche la liaison de Loc1p et Puf6p sur l’ARNm ASH1, entrainant un défaut de localisation de l’ARNm et de la protéine. Pour étudier plus en détail l’assemblage de la machinerie de localisation des ARNm dans le noyau, nous avons utilisé des techniques d’immunoprécipitation de chromatine afin de suivre le recrutement des facteurs de localisation et des répresseurs traductionnels sur les ARNm naissants. Nous avons montré que She2p est recruté sur le gène ASH1 pendant sa transcription, via son interaction avec l’ARNm ASH1 naissant. Puf6p est également recruté sur ASH1, mais d’une manière dépendante de la présence de She2p. De façon intéressante, nous avons détecté une interaction entre She2p et la plus grande sous-unité de l’ARN polymérase II (Rpb1p). Cette interaction est détectée avec la forme active en élongation de l’ARN polymérase II. Nous avons également démontré que She2p interagit avec le complexe d’élongation de la transcription Spt4p/Spt5p. Une délétion de SPT4 ou une mutation dans SPT5 (Ts spt5) à température restrictive empêche l’interaction entre She2p et Rpb1p, et diminue le recrutement de She2p au gène ASH1, entrainant un défaut de localisation de l’ARNm et un défaut de localisation asymétrique de la protéine Ash1p. De manière globale, nos résultats montrent que les facteurs impliqués dans la localisation cytoplasmique des ARNm et dans leur contrôle traductionnel sont recrutés de façon co-transcriptionnelle sur les ARNm naissants via leur interaction avec la machinerie de transcription, suggèrant un rôle important de la machinerie transcriptionelle dans la localisation des ARNm.

Étude moléculaire de la fonction du gène Bmi1 dans le processus de sénescence du système nerveux

Des études présentées dans cette thèse ont permis de démontrer que le gène du groupe Polycomb (PcG) Bmi1 est essentiel à l’auto-renouvellement des progéniteurs rétiniens immatures et pour le développement rétinien après la naissance. Ce travail illustre chez l’embryon que Bmi1 est hautement enrichie dans une sous-population de progéniteurs rétiniens exprimant le marqueur de surface SSEA-1 et différents marqueurs de cellules souches. À tous les stades de développement analysés, l’absence de Bmi1 résulte en une diminution de la prolifération et de l’auto-renouvellement des progéniteurs immatures. Pour mieux comprendre la cascade moléculaire en absence de Bmi1, nous avons inactivé p53 dans les colonies Bmi1-/-. Cette inactivation a permis une restauration partielle du potentiel d’auto-renouvellement. De plus, en absence de Bmi1, la prolifération et la maintenance de la population de progéniteurs rétiniens immatures localisés dans le corps ciliaire sont aussi affectées après la naissance. Bmi1 permet donc de distinguer les progéniteurs immatures de la population principale de progéniteurs, et est requis pour le développement normal de la rétine. Nous avons également démontré que l’oncogène Bmi1 est requis dans les neurones pour empêcher l’apoptose et l’induction d’un programme de vieillissement prématuré, causé par une baisse des défenses anti-oxydantes. Nous avons observé dans les neurones Bmi1-/- une augmentation des niveaux de p53, de la concentration des ROS et de la sensibilité aux agents neurotoxiques. Nous avons démontré ainsi que Bmi1 contrôle les défenses anti-oxydantes dans les neurones en réprimant l’activité pro-oxydante de p53. Dans les neurones Bmi1-/-, p53 provoque la répression des gènes anti-oxydants, induisant une augmentation des niveaux de ROS. Ces résultats démontrent pour la première fois que Bmi1 joue un rôle critique dans la survie et le processus de vieillissement neuronal.

Intracellular trafficking of protease : Activated Receptor 2 (PAR2) by members of sorting nexins family

Le dogme voulant que les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) activent des voies de signalisation seulement lorsqu’ils sont localisés à la membrane plasmatique, a récemment été remis en question. Des données récentes indiquent que certains GPCRs peuvent également induire une réponse intracellulaire à partir des compartiments intracellulaires dont le noyau. Les récepteurs activés par la protéase (PAR) sont des membres de la famille GPCR. Les PARs sont activés par le clivage de la partie N–terminale du récepteur ce qui permet au ligand attaché sur le récepteur de se lier à sa poche réceptrice. Quatre PARs ont été décrits : PAR1, PAR2, PAR3 et PAR4. PAR2 peut susciter des effets mitogéniques et participer aux processus comme l’angiogenèse et l'inflammation. Alors que beaucoup d'effets intracellulaires de PAR2 peuvent être expliqués lorsqu’il est localisé à la membrane plasmatique, une fonction intracrine de PAR2 a aussi été proposée. Pourtant les mécanismes par lesquels PAR2 peut provoquer l’expression de gènes ciblés sont toujours inconnus. Le but de notre étude était de vérifier l’existence d’une population nucléaire de PAR2. Nous avons également émis l’hypothèse que les voies activées par l’activation de PAR2 dépendent de sa localization cellulaire. En utilisant des techniques de microscopie confocale et de "Western Blot" nous avons démontré la présence d’une population nucléaire de PAR2. À la suite de la stimulation de PAR2, nous avons observé une augmentation de la translocation du récepteur de la membrane plasmatique au noyau. En utilisant la technique de "RT – PCR", nous avons observé des rôles différents de PAR2 à la surface de la cellule et du noyau dans l’initiation de l’expression des gènes. Afin d’identifier les mécanismes responsables de la translocation nucléaire de PAR2, nous avons évalué l’implication des membres de la famille de "Sorting Nexins (SNX)" dans la translocation nucléaire de PAR2. "Sorting Nexins" est un groupe de protéines avec des fonctions de transport bien établies. SNX1 et SNX2 ont été identifiés comme responsables du transfert de PAR1 vers les lysosomes. SNX11 n'a pas encore été étudié et nous avons émis l’hypothèse qu'il pourrait être un autre membre de la famille des SNX impliqué dans la signalisation de PAR2. Pour ce faire, nous avons développé des "knockdowns" stables pour SNX1, SNX2 et SNX11 dans les cellules HEK293. En utilisant les essais d’immunofluorescence, "Western Blot" et de cytométrie en flux, nous avons déterminé que tous les trois membres du groupe SNX sont des partenaires d'interaction de PAR2. Toutefois, seul SNX11 se co-localise avec son partenaire au noyau et est responsable de sa translocation nucléaire. Les expériences de "RT - PCR" sur les lignées de cellule de SNXs "knockdowns" ont démontré que la fonction de PAR2 nucléaire dépend surtout de SNX11; néanmoins SNX1 et SNX2 peuvent aussi l’influencer, suggérant qu'ils font aussi partie du réseau signalétique de PAR2. En conclusion, PAR2 est déplacé de la membrane plasmatique à la membrane nucléaire après sa stimulation avec un agoniste. La translocation nucléaire de PAR2 par un mécanisme impliquant SNX11, initie des effets intracellulaires différents de sa signalisation membranaire. Mots clés : récepteurs couplés à la protéine G, “Sorting Nexins”, récepteurs activés par la protéase, translocation nucléaire, membrane nucléaire, signal nucléaire.

Discrimination d'événements par analyse des signaux enregistrés par le projet PICASSO

La matière sombre est un mystère dans le domaine de l’astrophysique depuis déjà plusieurs années. De nombreuses observations montrent que jusqu’à 85 % de la masse gravitationnelle totale de l’univers serait composée de cette matière de nature inconnue. Une théorie expliquant cette masse manquante considérerait les WIMPs (Weakly Interacting Massive Particles), particules stables, non chargées, prédites par des extensions du modèle standard, comme candidats. Le projet PICASSO (Projet d’Identification des CAndidats Supersymétriques à la matière Sombre) est une expérience qui tente de détecter directement le WIMP. Le projet utilise des détecteurs à gouttelettes de fréon (C4F10) surchauffées. La collision entre un WIMP et le noyau de fluor crée un recul nucléaire qui cause à son tour une transition de phase de la gouttelette liquide à une bulle gazeuse. Le bruit de ce phénomène est alors capté par des senseurs piézoélectriques montés sur les parois des détecteurs. Le WIMP n’est cependant pas la seule particule pouvant causer une telle transition de phase. D’autres particules environnantes peuvent former des bulles, telles les particules alpha où même des rayons gamma . Le système d’acquisition de données (DAQ) est aussi en proie à du bruit électronique qui peut être enregistré, ainsi que sensible à du bruit acoustique extérieur au détecteur. Finalement, des fractures dans le polymère qui tient les gouttelettes en place peut également causer des transitions de phase spontanées. Il faut donc minimiser l’impact de tous ces différents bruit de fond. La pureté du matériel utilisé dans la fabrication des détecteurs devient alors très importante. On fait aussi appel à des méthodes qui impliquent l’utilisation de variables de discrimination développées dans le but d’améliorer les limites d’exclusion de détection du WIMP.

L’influence du réseau de chimiokines sur les lymphocytes T dans le contexte de l’infection à virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1)

Les chimiokines et leurs récepteurs respectifs jouent un rôle important dans l’immunité innée et adaptative. Les récepteurs de chimiokines identifient des cellules T CD4+ avec potentiel de migration dans des tissus spécifiques et à fonctionnalité distincte du point de vue de la spécificité antigénique et de la production de cytokines. L’identité de la population des cellules T CD4+ susceptibles versus résistantes à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) reste mal définie. Le recrutement dans les muqueuses intestinales d’un excès de cellules T effectrices (CD8+) comparé aux cellules cibles (CD4+) représente un bon pronostic de l’infection par le virus de l’immunodéficience simienne (VIS), tandis que la déplétion des cellules Th17 dans les tissus lymphoïdes associés au tractus gastro-intestinal (GALT) est un marqueur de la progression de l’infection à VIH. L’effet régulateur des chimiokines sur l’activation de la réplication virale dans différentes sous-populations cellulaires T CD4+ reste peu étudié. Ce projet de maîtrise est divisé en 3 parties: (1) l’identification des récepteurs de chimiokines CCR4, CXCR3 et CCR6 comme marqueurs de surfaces des sous populations T CD4+ avec susceptibilité distincte à l’infection par le VIH; (2) la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules T CD4+ et T CD8+ spécifiques au VIH de sujets à progression lente vers le stade sida (LTNP); et (3) les effets des chimiokines ligands de CCR4, CXCR3 et CCR6 sur l’activation cellulaire et la réplication virale in vitro. Nos résultats démontrent que les cellules T CD4+ CCR4+CCR6+ (profile cytokinique Th17) et CXCR3+CCR6+ (profile cytokinique Th1/Th17) sont hautement permissives à l’infection par le VIH. Nous proposons également de nouveaux corrélats de protection immunitaire contre le VIH chez les sujets LTNP: (i) le potentiel de co-localisation dans les muqueuses intestinales des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH via l’intégrine β7, (ii) le ratio élevé entre les cellules T effectrices (CD8+) versus les cellules cibles (CD4+) spécifiques au VIH, (iii) le profil cytokinique Th17 et (iv) la capacité des cellules T CD4+ et CD8+ spécifiques au VIH à produire des ligands de CCR5 bloquant l’entrée virale. Finalement, nos résultats sur l’effet co-stimulateur des chimiokines sur les cellules T et leurs effets opposés sur la réplication virale démontrent l’implication du réseau des chimiokines dans la régulation de la pathogenèse de l’infection à VIH.

Études structurales d’interactions protéine/protéine impliquées dans l’érythropoïèse

Le développement hématopoïétique est régulé par l’action combinée de facteurs de transcription lignée spécifiques et de la machinerie transcriptionnelle de base, permettant ainsi l’expression de gènes en temps et lieu appropriés. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur l’étude structurale et fonctionnelle d’interactions décisives pour la régulation de l’expression de gènes et impliquant des domaines de transactivation (TAD). En effet, les interactions faisant intervenir les TAD d’activateurs permettent de réguler l’activation de la transcription de façon spécifique. La première étude présentée dans cette thèse relate l'identification et la caractérisation d'une nouvelle interaction entre deux facteurs de transcription : le facteur hématopoïétique GATA-1 et la protéine suppresseur de tumeur p53. En combinant des études in vitro par titrage calorimétrique en condition isotherme (ITC) et par spectroscopie RMN et des études in vivo, nous avons identifié et caractérisé cette nouvelle interaction. Il s'avère que le TAD de p53 et le domaine de liaison à l’ADN de GATA-1 sont les domaines minimaux requis pour la formation de ce complexe. L'inhibition de la voie p53 par GATA-1 s’est avérée être la conséquence majeure de cette interaction, permettant ainsi le maintien en vie des précurseurs érythrocytaires via l’inhibition de l’apoptose. Un deuxième type d’interaction a fait l’objet d’études : l’interaction entre divers TAD et la machinerie transcriptionnelle de base, plus spécifiquement avec le Facteur général de Transcription IIH (TFIIH). La structure des complexes constitués par la sous-unité Tfb1/p62 du facteur TFIIH en interaction avec le TAD viral de VP16 d’une part, et avec le TAD humain du facteur érythrocytaire « Erythroid Krüppel-like factor» (EKLF) d’autre part, ont été résolues par spectroscopie RMN. La structure du complexe Tfb1/VP16 a révélée que le mode de liaison de VP16 à Tfb1 est similaire au mode de liaison du TAD de p53 avec le même partenaire. En effet, les TAD de VP16 et de p53 forment tous deux une hélice α de 9 résidus en interaction avec Tfb1. En dépit de partager avec p53 et VP16 le même site de liaison sur Tfb1/p62, la structure RMN du complexe EKLF/Tfb1 démontre que le mode d’interaction de ce TAD se distingue du mode de liaison canonique des activeurs transcriptionnels. Etonnamment, EKLF adopte un mécanisme de liaison semblable au mécanisme de liaison du facteur général de transcription TFIIEα avec p62, leurs conformations demeurent étendues en interaction avec Tfb1/p62. En se basant sur nos données structurales, nous avons identifié un résidu dans le TAD d'EKLF décisif pour la formation du complexe EKLF/p62 : le Trp73. La mutation de cet acide aminé perturbe son interaction avec Tfb1PH/p62PH et réduit significativement l'activité transcriptionnelle d'EKLF dans les érythrocytes.

Couplage du récepteur à sept domaines transmembranaires GABA-B1 aux voies intracellulaires de signalisation en absence de GABA-B2

Le GABA est le principal neurotransmetteur inhibiteur du SNC et est impliqué dans le développement du cerveau, la plasticité synaptique et la pathogénèse de maladies telles que l’épilepsie, les troubles de l’anxiété et la douleur chronique. Le modèle actuel de fonctionnement du récepteur GABA-B implique l’hétérodimérisation GABA-B1/B2, laquelle est requise au ciblage à la surface membranaire et au couplage des effecteurs. Il y est cependant des régions du cerveau, des types cellulaires et des périodes du développement cérébral où la sous-unité GABA-B1 est exprimée en plus grande quantité que GABA-B2, ce qui suggère qu’elle puisse être fonctionnelle seule ou en association avec des partenaires inconnus, à la surface cellulaire ou sur la membrane réticulaire. Dans le cadre de cette thèse, nous montrons la capacité des récepteurs GABA-B1 endogènes à activer la voie MAPK-ERK1/2 dans la lignée dérivée de la glie DI-TNC1, qui n’exprime pas GABA-B2. Les mécanismes qui sous-tendent ce couplage demeurent mal définis mais dépendent de Gi/o et PKC. L’immunohistochimie de récepteurs endogènes montre par ailleurs que des anticorps GABA-B1 dirigés contre la partie N-terminale reconnaissent des protéines localisées au RE tandis des anticorps C-terminaux (CT) marquent une protéine intranucléaire. Ces données suggèrent que le domaine CT de GABA-B1 pourrait être relâché par protéolyse. L’intensité des fragments potentiels est affectée par le traitement agoniste tant en immunohistochimie qu’en immunobuvardage de type western. Nous avons ensuite examiné la régulation du clivage par le protéasome en traitant les cellules avec l’inhibiteur epoxomicine pendant 12 h. Cela a résulté en l’augmentation du marquage intranucléaire de GABA-B1-CT et d’un interacteur connu, le facteur de transcription pro-survie ATF-4. Dans des cellules surexprimant GABA-B1-CT, l’induction et la translocation nucléaire d’ATF-4, qui suit le traitement epoxomicine, a complètement été abolie. Cette observation est associée à une forte diminution du décompte cellulaire. Étant donné que les trois derniers résidus de GABA-B1-CT (LYK) codent un ligand pseudo-PDZ et que les protéines à domaines PDZ sont impliquées dans la régulation du ciblage nucléaire et de la stabilité de protéines, en complément de leur rôle d’échaffaud à la surface cellulaire, nous avons muté les trois derniers résidus de GABA-B1-CT en alanines. Cette mutation a complètement annulé les effets de GABA-B1-CT sur l’induction d’ATF-4 et le décompte cellulaire. Cette deuxième série d’expériences suggère l’existence possible de fragments GABA-B1 intranucléaires régulés par le traitement agoniste et le protéasome dans les cellules DI-TNC1. Cette régulation d’ATF-4 dépend des résidus LYK de GABA-B1-CT, qui modulent la stabilité de GABA-B1-CT et favorisent peut-être la formation d’un complexe multiprotéique incluant GABA-B1-CT, ATF-4, de même qu’une protéine d’échaffaudage inconnue. En somme, nous démontrons que les sous-unités GABA-B1 localisées au RE, lorsque non-hétérodimérisées avec GABA-B2, demeurent capables de moduler les voies de signalisation de la prolifération, la différentiation et de la survie cellulaire, via le couplage de protéines G et possiblement la protéolyse régulée. Les mécanismes de signalisation proposés pourraient servir de nouvelle plate-forme dans la compréhension des actions retardées résultant de l’activation des récepteurs 7-TMs.

Contribution de la Glycoprotéine M dans la Sortie de HSV-1

Le Virus Herpès Simplex de type 1 (HSV-1) est un agent infectieux qui cause l’herpès chez une grande proportion de la population mondiale. L’herpès est généralement considéré comme une maladie bénigne dont la forme la plus commune est l'herpès labial (communément appelé « bouton de fièvre »), mais elle peut se révéler très sérieuse et causer la cécité et l’encéphalite, voir létale dans certain cas. Le virus persiste toute la vie dans le corps de son hôte. Jusqu'à présent, aucun traitement ne peut éliminer le virus et aucun vaccin n’a été prouvé efficace pour contrôler l’infection herpétique. HSV-1 est un virus avec un génome d’ADN bicaténaire contenu dans une capside icosaèdrale entourée d’une enveloppe lipidique. Treize glycoprotéines virales se trouvent dans cette enveloppe et sont connues ou supposées jouer des rôles distincts dans différentes étapes du cycle de réplication viral, incluant l'attachement, l'entrée, l’assemblage, et la propagation des virus. La glycoprotéine M (gM) qui figure parmi ces glycoprotéines d’enveloppe, est la seule glycoprotéine non essentielle mais est conservée dans toute la famille herpesviridae. Récemment, l’homologue de gM dans le Pseudorabies virus (PRV), un autre herpesvirus, a été impliqué dans la phase finale de l’assemblage (i.e. l’enveloppement cytoplasmique) au niveau du réseau trans-Golgi (TGN) en reconnaissant spécifiquement des protéines tégumentaires et d’autres glycoprotéines d’enveloppe ([1]). Toutefois, il a été proposé que cette hypothèse ne s’applique pas pour le HSV-1 ([2]). De plus, contrairement à la localisation au TGN dans les cellules transfectées, HSV-1 gM se localise dans la membrane nucléaire et sur les virions périnucléaires durant une infection. L’objectif du projet présenté ici était d’éclaircir la relation de la localisation et la fonction de HSV-1 gM dans le contexte d’une infection. Dans les résultats rapportés ici, nous décrivons tout abord un mécanisme spécifique de ciblage nucléaire de HSV-1 gM. En phase précoce d’une infection, gM est ciblée à la membrane nucléaire d'une manière virus ii dépendante. Cela se produit avant la réorganisation du TGN normalement induite par l’infection et avant que gM n’entre dans la voie de sécrétion. Ce ciblage nucléaire actif et spécifique de gM ne semble pas dépendre des plusieurs des partenaires d’interaction proposés dans la littérature. Ces données suggèrent que la forme nucléaire de gM pourrait avoir un nouveau rôle indépendant de l’enveloppement final dans le cytoplasme. Dans la deuxième partie du travail présenté ici, nous avons concentré nos efforts sur le rôle de gM dans l’assemblage du virus en phase tardive de l’infection et en identifiant un domaine critique de gM. Nos résultats mettent en valeur l’importance du domaine carboxyl-terminal cytoplasmique de gM dans le transport de gM du réticulum endoplasmique (RE) à l’appareil de Golgi, dans l’enveloppement cytoplasmique et la propagation intercellulaire du virus. Ainsi, l’export du RE de gM a été complètement compromis dans les cellules transfectées exprimant un mutant de gM dépourvu de sa région C-terminale. La délétion la queue cytoplasmique de gM cause une réduction légère du titre viral et de la taille des plaques. L'analyse de ces mutants par microscopie électronique a démontré une accumulation des nucléocapsides sans enveloppe dans le cytoplasme par rapport aux virus de type sauvage. Étrangement, ce phénotype était apparent dans les cellules BHK mais absent dans les cellules 143B, suggérant que la fonction de gM dépende du type cellulaire. Finalement, le criblage de partenaires d’interaction du domaine C-terminal de gM identifiés par le système de double-hybride nous a permis de proposer plusieurs candidats susceptibles de réguler la fonction de gM dans la morphogénèse et la propagation de virus.