Programa Nacional de Vigilância da Gripe: relatório da época 2015/2016

O vírus da gripe é uma das maiores causas de morbilidade e mortalidade em todo o mundo, afetando um elevado número de indivíduos em cada ano. Em Portugal a vigilância epidemiológica da gripe é assegurada pelo Programa Nacional de Vigilância da Gripe (PNVG), através da integração da informação das componentes clínica e virológica, gerando informação detalhada relativamente à atividade gripal. A componente clínica é suportada pela Rede Médicos-Sentinela e tem um papel especialmente relevante por possibilitar o cálculo de taxas de incidência permitindo descrever a intensidade e evolução da epidemia de gripe. A componente virológica tem por base o diagnóstico laboratorial do vírus da gripe e tem como objetivos a deteção e caraterização dos vírus da gripe em circulação. Para o estudo mais completo da etiologia da síndrome gripal foi efectuado o diagnóstico diferencial de outros vírus respiratórios: vírus sincicial respiratório tipo A (RSV A) e B (RSV B), o rhinovírus humano (hRV), o vírus parainfluenza humano tipo 1 (PIV1), 2 (PIV2) e 3 (PIV3), o coronavírus humano (hCoV), o adenovírus (AdV) e o metapneumovirus humano (hMPV). Desde 2009 a vigilância da gripe conta também com a Rede Portuguesa de Laboratórios para o Diagnóstico da Gripe que atualmente é constituída por 15 hospitais onde se realiza o diagnóstico laboratorial da gripe. A informação obtida nesta Rede Laboratorial adiciona ao PNVG dados relativos a casos de doença respiratória mais severa com necessidade de internamento. Em 2011/2012, foi lançado um estudo piloto para vigiar os casos graves de gripe admitidos em Unidades de Cuidados Intensivos (UCI) que deu origem à atual Rede de vigilância da gripe em UCI constituída em 2015/2016 por 31 UCI (324 camas). Esta componente tem como objetivo a monitorização de novos casos de gripe confirmados laboratorialmente e admitidos em UCI, permitindo a avaliação da gravidade da doença associada à infeção pelo vírus da gripe. O Sistema da Vigilância Diária da Mortalidade constitui uma componente do PNVG que permite monitorizar a mortalidade semanal por “todas as causas” durante a época de gripe. É um sistema de vigilância epidemiológica que pretende detetar e estimar de forma rápida os impactos de eventos ambientais ou epidémicos relacionados com excessos de mortalidade. A notificação de casos de Síndrome Gripal (SG) e a colheita de amostras biológicas foi realizada em diferentes redes participantes do PNVG: Rede de Médicos-Sentinela, Rede de Serviços de Urgência/Obstetrícia, médicos do Projeto EuroEVA, Rede Portuguesa de Laboratórios para o Diagnóstico da Gripe e Rede vigilância da gripe em UCI. Na época de vigilância da gripe de 2015/2016 foram notificados 1.273 casos de SG, 87% dos quais acompanhados de um exsudado da nasofaringe para diagnóstico laboratorial. No inverno de 2015/2016 observou-se uma atividade gripal de baixa intensidade. O período epidémico ocorreu entre a semana 53/2015 e a semana 8/2016 e o valor mais elevado da taxa de incidência semanal de SG (72,0/100000) foi observado na semana 53/2015. De acordo com os casos notificados à Rede Médicos-Sentinela, o grupo etário dos 15 aos 64 anos foi o que apresentou uma incidência cumulativa mais elevada. O vírus da gripe foi detetado em 41,0% dos exsudados da nasofaringe recebidos tendo sido detetados outros vírus respiratórios em 24% destes. O vírus da gripe A(H1)pdm09 foi o predominantemente detetado em 90,4% dos casos de gripe. Foram também detetados outros vírus da gripe, o vírus B - linhagem Victoria (8%), o vírus A(H3) (1,3%) e o vírus B- linhagem Yamagata (0,5%). A análise antigénica dos vírus da gripe A(H1)pdm09 mostrou a sua semelhança com a estirpe vacinal 2015/2016 (A/California/7/2009), a maioria dos vírus pertencem ao novo grupo genético 6B.1, que foi o predominantemente detetado em circulação na Europa. Os vírus do tipo B apesar de detetados em número bastante mais reduzido comparativamente com o subtipo A(H1)pdm09, foram na sua maioria da linhagem Victoria que antigenicamente se distinguem da estirpe vacinal de 2015/2016 (B/Phuket/3073/2013). Esta situação foi igualmente verificada nos restantes países da Europa, Estados Unidos da América e Canadá. Os vírus do subtipo A(H3) assemelham-se antigenicamente à estirpe selecionada para a vacina de 2016/2017 (A/Hong Kong/4801/2014). Geneticamente a maioria dos vírus caraterizados pertencem ao grupo 3C.2a, e são semelhantes à estirpe vacinal para a época de 2016/2017. A avaliação da resistência aos antivirais inibidores da neuraminidase, não revelou a circulação de estirpes com diminuição da suscetibilidade aos inibidores da neuraminidase (oseltamivir e zanamivir). A situação verificada em Portugal é semelhante à observada a nível europeu. A percentagem mais elevada de casos de gripe foi verificada nos indivíduos com idade inferior a 45 anos. A febre, as cefaleias, o mal-estar geral, as mialgias, a tosse e os calafrios mostraram apresentar uma forte associação à confirmação laboratorial de um caso de gripe. Foi nos doentes com imunodeficiência congénita ou adquirida que a proporção de casos de gripe foi mais elevada, seguidos dos doentes com diabetes e obesidade. A percentagem total de casos de gripe em mulheres grávidas foi semelhante à observada nas mulheres em idade fértil não grávidas. No entanto, o vírus da gripe do tipo A(H1)pdm09 foi detetado em maior proporção nas mulheres grávidas quando comparado as mulheres não grávidas. A vacina como a principal forma de prevenção da gripe é especialmente recomendada em indivíduos com idade igual ou superior a 65 anos, doentes crónicos e imunodeprimidos, grávidas e profissionais de saúde. A vacinação antigripal foi referida em 13% dos casos notificados. A deteção do vírus da gripe ocorreu em 25% dos casos vacinados e sujeitos a diagnóstico laboratorial estando essencialmente associados ao vírus da gripe A(H1)pdm09, o predominante na época de 2015/2016. Esta situação foi mais frequentemente verificada em indivíduos com idade compreendida entre os 15 e 45 anos. A confirmação de gripe em indivíduos vacinados poderá estar relacionada com uma moderada efetividade da vacina antigripal na população em geral. A informação relativa à terapêutica antiviral foi indicada em 67% casos de SG notificados, proporção superior ao verificado em anos anteriores. Os antivirais foram prescritos a um número reduzido de doentes (9,0%) dos quais 45.0% referiam pelo menos a presença de uma doença crónica ou gravidez. O antiviral mais prescrito foi o oseltamivir. A pesquisa de outros vírus respiratórios nos casos de SG negativos para o vírus da gripe, veio revelar a circulação e o envolvimento de outros agentes virais respiratórios em casos de SG. Os vírus respiratórios foram detetados durante todo o período de vigilância da gripe, entre a semana 40/2015 e a semana 20/2016. O hRV, o hCoV e o RSV foram os agentes mais frequentemente detetados, para além do vírus da gripe, estando o RSV essencialmente associado a crianças com idade inferior a 4 anos de idade e o hRV e o hCoV aos adultos e população mais idosa (≥ 65 anos). A Rede Portuguesa de Laboratórios para o Diagnóstico da Gripe, efetuou o diagnóstico da gripe em 7443 casos de infeção respiratória sendo o vírus da gripe detetado em 1458 destes casos. Em 71% dos casos de gripe foi detetado o vírus da gripe A(H1)pdm09. Os vírus da gripe do tipo A(H3) foram detetados esporadicamente e em número muito reduzido (2%), e em 11% o vírus da gripe A (não subtipado). O vírus da gripe do tipo B foi detetado em 16% dos casos. A frequência de cada tipo e subtipo do vírus da gripe identificados na Rede Hospitalar assemelha-se ao observado nos cuidados de saúde primários (Rede Médicos-Sentinela e Serviços de Urgência). Foi nos indivíduos adultos, entre os 45-64 anos, que o vírus A(H1)pdm09 representou uma maior proporção dos casos de gripe incluindo igualmente a maior proporção de doentes que necessitaram de internamento hospitalar em unidades de cuidados intensivos. O vírus da gripe do tipo B esteve associado a casos de gripe confirmados nas crianças entre os 5 e 14 anos. Outros vírus respiratórios foram igualmente detetados sendo o RSV e os picornavírus (hRV, hEV e picornavírus) os mais frequentes e em co circulação com o vírus da gripe. Durante a época de vigilância da gripe, 2015/2016, não se observaram excessos de mortalidade semanais. Nas UCI verificou-se uma franca dominância do vírus da gripe A(H1)pdm09 (90%) e a circulação simultânea do vírus da gripe B (3%). A taxa de admissão em UCI oscilou entre 5,8% e 4,7% entre as semanas 53 e 12 tendo o valor máximo sido registado na semana 8 de 2016 (8,1%). Cerca de metade dos doentes tinha entre 45 e 64 anos. Os mais idosos (65+ anos) foram apenas 20% dos casos, o que não será de estranhar, considerando que o vírus da gripe A(H1)pdm09 circulou como vírus dominante. Aproximadamente 70% dos doentes tinham doença crónica subjacente, tendo a obesidade sido a mais frequente (37%). Comparativamente com a pandemia, em que circulou também o A(H1)pdm09, a obesidade, em 2015/2016, foi cerca de 4 vezes mais frequente (9,8%). Apenas 8% dos doentes tinha feito a vacina contra a gripe sazonal, apesar de mais de 70% ter doença crónica subjacente e de haver recomendações da DGS nesse sentido. A taxa de letalidade foi estimada em 29,3%, mais elevada do que na época anterior (23,7%). Cerca de 80% dos óbitos ocorreram em indivíduos com doença crónica subjacente que poderá ter agravado o quadro e contribuído para o óbito. Salienta-se a ausência de dados históricos publicados sobre letalidade em UCI, para comparação. Note-se que esta estimativa se refere a óbitos ocorridos apenas durante a hospitalização na UCI e que poderão ter ocorrido mais óbitos após a alta da UCI para outros serviços/enfermarias. Este sistema de vigilância da gripe sazonal em UCI poderá ser aperfeiçoado nas próximas épocas reduzindo a subnotificação e melhorando o preenchimento dos campos necessários ao estudo da doença. A época de vigilância da gripe 2015/2016 foi em muitas caraterísticas comparável ao descrito na maioria dos países europeus. A situação em Portugal destacou-se pela baixa intensidade da atividade gripal, pelo predomínio do vírus da gripe do subtipo A(H1)pdm09 acompanhada pela deteção de vírus do tipo B (linhagem Victoria) essencialmente no final da época gripal. A mortalidade por todas as causas durante a epidemia da gripe manteve-se dentro do esperado, não tendo sido observados excessos de mortalidade. Os vírus da gripe do subtipo predominante na época 2015/2016, A(H1)pdm09, revelaram-se antigénicamente semelhantes à estirpe vacinal. Os vírus da gripe do tipo B detetados distinguem-se da estirpe vacinal de 2015/2016. Este facto conduziu à atualização da composição da vacina antigripal para a época 2016/2017. A monitorização contínua da epidemia da gripe a nível nacional e mundial permite a cada inverno avaliar o impacto da gripe na saúde da população, monitorizar a evolução dos vírus da gripe e atuar de forma a prevenir e implementar medidas eficazes de tratamento da doença, especialmente quando esta se apresenta acompanhada de complicações graves.

Utility of a panviral microarray for detection of swine respiratory viruses in clinical samples

Several factors have recently converged, elevating the need for highly parallel diagnostic platforms that have the ability to detect many known, novel, and emerging pathogenic agents simultaneously. Panviral DNA microarrays represent the most robust approach for massively parallel viral surveillance and detection. The Virochip is a panviral DNA microarray that is capable of detecting all known viruses, as well as novel viruses related to known viral families, in a single assay and has been used to successfully identify known and novel viral agents in clinical human specimens. However, the usefulness and the sensitivity of the Virochip platform have not been tested on a set of clinical veterinary specimens with the high degree of genetic variance that is frequently observed with swine virus field isolates. In this report, we investigate the utility and sensitivity of the Virochip to positively detect swine viruses in both cell culture-derived samples and clinical swine samples. The Virochip successfully detected porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in serum containing 6.10 × 10(2) viral copies per microliter and influenza A virus in lung lavage fluid containing 2.08 × 10(6) viral copies per microliter. The Virochip also successfully detected porcine circovirus type 2 (PCV2) in serum containing 2.50 × 10(8) viral copies per microliter and porcine respiratory coronavirus (PRCV) in turbinate tissue homogenate. Collectively, the data in this report demonstrate that the Virochip can successfully detect pathogenic viruses frequently found in swine in a variety of solid and liquid specimens, such as turbinate tissue homogenate and lung lavage fluid, as well as antemortem samples, such as serum.

Detection of Influenza type A virus by LightCycler RT-PCR

Using the Roche LightCycler we developed a real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) assay using the Influenza A LightCycler RT-PCR (FA-LC-RTPCR) for the rapid detection of Influenza A. The assay was used to examine 178 nasopharyngeal aspirate (NPA) samples, from patients with clinically recognised respiratory tract infection, for the presence of Influenza A RNA. The results were then compared to a testing algorithm combining direct immunofluorescent assy (DFA) and a culture augmented DFA (CA-DFA) assay. In total, 76 (43%) specimens were positive and 98 (55%) specimens were negative by both the FA-LC-RTPCR and the DFA and CA-DFA algorithm. In addition, the FA-LC-RTPCR detected a further 4 (2%) positive specimens, which were confirmed by a conventional RT-PCR method. The high level of sensitivity and specificity, combined with the rapid turnaround time for results, makes the LC-RT-PCR assay suitable for the detection of Influenza A in clinical specimens.

Serologic studies on the behaviour of influenza virus type A in persons of greater São Paulo during 1976, 1978 and 1979

Sera of persons of different age groups collected in 1976, 1978 and 1979 were tested for the presence of HI antibodies against various strains of the H3N2 and H1N1 subtypes of influenza virus. The occurrence of infection by H3N2 subtype was recorded during the 1976-1978 period but in 1979, circulation of this subtype of virus was limited. The prevalence of antibody against A/São Paulo/1/78 (H1N1) was significantly higher than that of antibody to A/USSB/90/77 (HIND in 1978. However in 1979 the predominant strain was A/USSR/90/77 (HIND. Persons under 20 years of age were the most affected by H1N1 subtype. Antibodies to H1N1 subtype were detected in sera of individuals older than 20 years in 1976, before the re-emergence of this strain. Serological results indicate that infections by H3N2 subtype in 1978 occurred in 65.4% of young children (0-4 year group). About 47.0% of children from the 0-4 year group had antibodies to H1N1 subtype in 1979. Antibodies to swine influenza virus were detected in 60% of 60+ year old people.

Co-infection between influenza virus and flagellated bacteria

Trypsin is required in the hemagglutinin (HA) cleavage to in vitro influenza viruses activation. This HA cleavage is necessary for virus cell entry by receptor-mediated endocytosis. Bacteria in the respiratory tract are potential sources of proteases that could contribute to the cleavage of influenza virus in vivo. From 47 samples collected from horses, pigs, and from humans, influenza presence was confirmed in 13 and these samples demonstrated co-infection of influenza with flagellated bacteria, Stenotrophomonas maltophilia from the beginning of the experiments. Despite treatment with antibiotics, the bacteria remained resistant in several of the co-infected samples (48.39%). These bacteria, considered opportunistic invaders from environmental sources, are associated with viral infections in upper respiratory tract of hosts. The protease (elastase), secreted by Stenotrophomonas maltophilia plays a role in the potentiation of influenza virus infection. Proteolytic activity was detected by casein agar test. Positive samples from animals and humans had either a potentiated influenza infectivity or cytopathic effect (CPE) in MDCK and NCI H292 cells, Stenotrophomonas maltophilia were always present. Virus and bacteria were observed ultrastructurally. These in vitro findings show that microbial proteases could contribute to respiratory complications by host protease activity increasing inflammation or destroying endogenous cell protease inhibitors.

PREVALENCE OF ANTIBODIES AGAINST INFLUENZA VIRUS IN NON-VACCINATED EQUINES FROM THE BRAZILIAN PANTANAL

The prevalence of antibodies against Equine Influenza Virus (EIV) was determined in 529 equines living on ranches in the municipality of Poconé, Pantanal area of Brazil, by means of the hemagglutination inhibition test, using subtype H3N8 as antigen. The distribution and possible association among positive animal and ranches were evaluated by the chi-square test, spatial autoregressive and multiple linear regression models. The prevalence of antibodies against EIV was estimated at 45.2% (95% CI 30.2 - 61.1%) with titers ranging from 20 to 1,280 HAU. Seropositive equines were found on 92.0% of the surveyed ranches. Equine from non-flooded ranches (66.5%) and negativity in equine infectious anemia virus (EIAV) (61.7%) were associated with antibodies against EIV. No spatial correlation was found among the ranches, but the ones located in non-flooded areas were associated with antibodies against EIV. A negative correlation was found between the prevalence of antibodies against EIV and the presence of EIAV positive animals on the ranches. The high prevalence of antibodies against EIV detected in this study suggests that the virus is circulating among the animals, and this statistical analysis indicates that the movement and aggregation of animals are factors associated to the transmission of the virus in the region.

Lessons from the epidemiological surveillance program, during the influenza A (H1N1) virus epidemic, in a reference university hospital of Southeastern Brazil

INTRODUCTION: The case definition of influenza-like illness (ILI) is a powerful epidemiological tool during influenza epidemics. METHODS: A prospective cohort study was conducted to evaluate the impact of two definitions used as epidemiological tools, in adults and children, during the influenza A H1N1 epidemic. Patients were included if they had upper respiratory samples tested for influenza by real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction during two periods, using the ILI definition (coughing + temperature > 38ºC) in period 1, and the definition of severe acute respiratory infection (ARS) (coughing + temperature > 38ºC and dyspnoea) in period 2. RESULTS: The study included 366 adults and 147 children, covering 243 cases of ILI and 270 cases of ARS. Laboratory confirmed cases of influenza were higher in adults (50%) than in children (21.6%) ( p < 0.0001) and influenza infection was more prevalent in the ILI definition (53%) than ARS (24.4%) (p < 0.0001). Adults reported more chills and myalgia than children (p = 0.0001). Oseltamivir was administered in 58% and 46% of adults and children with influenza A H1N1, respectively. The influenza A H1N1 case fatality rate was 7% in adults and 8.3% in children. The mean time from onset of illness until antiviral administration was 4 days. CONCLUSIONS: The modification of ILI to ARS definition resulted in less accuracy in influenza diagnosis and did not improve the appropriate time and use of antiviral medication.

Comparative study of lymphocytes from individuals that were vaccinated and unvaccinated against the pandemic 2009-2011 H1N1 influenza virus in Southern Brazil

ABSTRACTINTRODUCTION:While no single factor is sufficient to guarantee the success of influenza vaccine programs, knowledge of the levels of immunity in local populations is critical. Here, we analyzed influenza immunity in a population from Southern Brazil, a region with weather conditions that are distinct from those in the rest of country, where influenza infections are endemic, and where greater than 50% of the population is vaccinated annually.METHODS:Peripheral blood mononuclear cells were isolated from 40 individuals. Of these, 20 had received the H1N1 vaccine, while the remaining 20 were unvaccinated against the disease. Cells were stimulated in vitro with the trivalent post-pandemic influenza vaccine or with conserved major histocompatibility complex I (MHC I) peptides derived from hemagglutinin and neuraminidase. Cell viability was then analyzed by [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide)]-based colorimetric assay (MTT), and culture supernatants were assayed for helper T type 1 (Th1) and Th2-specific cytokine levels.RESULTS:Peripheral blood lymphocytes from vaccinated, but not unvaccinated, individuals exhibited significant proliferation in vitro in the presence of a cognate influenza antigen. After culturing with vaccine antigens, cells from vaccinated individuals produced similar levels of interleukin (IL)-10 and interferon (IFN)-γ, while those from unvaccinated individuals produced higher levels of IFN-γ than of IL-10.CONCLUSIONS:Our data indicate that peripheral blood lymphocytes from vaccinated individuals are stimulated upon encountering a cognate antigen, but did not support the hypothesis that cross-reactive responses related to previous infections can ameliorate the immune response. Moreover, monitoring IL-10 production in vaccinated individuals could comprise a valuable tool for predicting disease evolution.

Mathematische Modellierung von Influenza Virus Replikation in Säugerzellen

Virus dynamics, mathematical modeling, influenza virus, mammalian cells, vaccines, antiviral strategies

Etablierung und Anwendung einer analytischen Methode zur Untersuchung der N-Glykosylierung des Influenza-Virus Hämagglutinin

Magdeburg, Univ., Fak. für Verfahrens- und Systemtechnik, Diss., 2013

Characterization of the avian designer cells AGE1.CR and AGE1.CR.plX considering growth, metabolism and production of influenza virus and Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA)

Magdeburg, Univ., Fak. für Verfahrens- und Systemtechnik, Diss., 2014