Rôle de GPR40 dans la survie et la prolifération cellulaires induites par l’oléate dans les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de cancer de la prostate DU145

La relation entre l’obésité et le cancer, bien qu’établie par des études épidémiologiques, est peu connue. Pourtant, environ 25 % des cancers pourraient y être attribuables. Parmi les cancers reliés à l’obésité, les cancers du côlon, du sein chez les femmes ménopausées et de la prostate sont les plus fréquents. Des études sur modèles animaux ont suggéré une association positive entre une diète riche en gras et le développement du cancer mammaire et de la prostate. Nous avons étudié les mécanismes moléculaires par lesquels les acides gras influencent le devenir de lignées de cellules cancéreuses du sein et de la prostate. Ces travaux ont montré que les acides gras insaturés, dont l’oléate, induisent la prolifération cellulaire tandis que les acides gras saturés, dont le palmitate, diminuent la prolifération. Un traitement à l’oléate stimule la formation de gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145 alors qu’un traitement au palmitate entraîne l’apoptose. Le mécanisme d’action de l’oléate sur la prolifération a été étudié de façon plus approfondie. L’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques nous a permis de déterminer que l’effet prolifératif de l’oléate implique la voie PI3K/Akt, la voie ERK1/2 et l’activation d’un ou de plusieurs récepteur(s) couplé(s) aux protéines G (GPCR). L’oléate induit la phosphorylation rapide des protéines Akt et ERK1/2 dans les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145. Au cours des dernières années, deux GPCRs ont été identifiés comme étant activables par des acides gras à moyennes et à longues chaînes, GPR40 et GPR120. GPR40 étant exprimé dans plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein et de la prostate contrairement à l’expression de GPR120 qui était inexistante dans la plupart des lignées, nous avons étudié l’implication de GPR40 dans l’effet prolifératif de l’oléate. Ces deux récepteurs n’étant pas exprimés dans les cellules épithéliales mammaires humaines en culture primaire, ces cellules ne répondent pas aux effets de l’oléate sur la prolifération et l’activation des voies de signalisation. L’activation des voies Akt et ERK1/2 par l’oléate dans les cellules MDA-MB-231 et DU145 est potentialisée par la surexpression du récepteur GPR40 et inhibée par l’utilisation d’un siRNA dirigé contre ce récepteur. Cependant, la prolifération induite par l’oléate ne semble pas affectée par la présence d’un siRNA dirigé contre GPR40. L’oléate étant un acide gras, il est capable d’entrer librement dans les cellules et une partie de ses effets sur la prolifération pourrait être attribuée à sa métabolisation. Un agoniste de GPR40, le GW9508, est en mesure d’activer GPR40 sans toutefois entrer dans les cellules ni activer le métabolisme de l’oléate. Le GW9508 stimule la phosphorylation des protéines Akt et ERK1/2 dans les cellules du cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145, mais il n’est pas en mesure d’induire la prolifération cellulaire comme le fait l’oléate. Ces résultats nous permettent de mieux comprendre le mécanisme d’action de l’oléate sur les cellules de cancer du sein et de la prostate. L’oléate induit la signalisation de GPR40 qui est impliquée dans l’activation rapide des voies de signalisation Akt et ERK1/2. De son côté, l’effet prolifératif induit par l’oléate s’effectue par un mécanisme GPR40-indépendant, possiblement lié au métabolisme de l’oléate.

Le remodelage cardiaque lors de la gestation chez la rate : implication du récepteur aux minéralocorticoïdes et altérations par un supplément sodique

La grossesse induit de profonds changements hémodynamiques et métaboliques de l’organisme maternel qui ont des conséquences sur le cœur. L’adaptation du cœur à cette condition physiologique nécessite un remodelage de sa structure et par conséquent des ajustements de sa fonction. Les mécanismes responsables de ces adaptations sont en grande partie inconnus. Cependant, ces connaissances sont essentielles pour la compréhension des complications cardiovasculaires, telle que l’hypertension gestationnelle (HG), qui constituent un risque pour la santé de la mère et du fœtus. Afin de caractériser les adaptations du cœur lors de la grossesse, l’originalité de notre approche expérimentale consistait à étudier le remodelage à l’échelle des cardiomyocytes du ventricule gauche. Ainsi, notre premier objectif était de déterminer les modifications structurales et fonctionnelles des cardiomyocytes chez la rate en vue d’identifier les altérations lors de l’HG. Chez les rates gestantes, le remodelage structural des cardiomyocytes se caractérise par une hypertrophie cellulaire avec une augmentation proportionnelle des dimensions. L’HG a été induite par un supplément sodique (0.9% NaCl) dans la diète. L’inadaptation structurale lors de l’HG se traduit par une diminution du volume cellulaire. L’étude des modifications fonctionnelles a révélé que lors de la gestation le fonctionnement contractile des cellules est dépendant de l’adaptation du métabolisme maternel. En effet, les substrats énergétiques, lactate et pyruvate, induisent une augmentation de la contractilité des cardiomyocytes. Cet effet est plus faible dans les cellules des rates hypertendues, ce qui suggère des anomalies du couplage excitation-contraction, dans lequel les courants calciques de type L (ICa-L) jouent un rôle important. Paradoxalement, le lactate et le pyruvate ont induit une augmentation de la densité des courants ICa-L seulement chez les rates hypertendues. Le récepteur aux minéralocorticoïdes (RM) est connu pour son implication dans le remodelage structuro-fonctionnel du cœur dans les conditions pathologiques mais pas dans celui induit par la grossesse. Notre deuxième objectif était donc de déterminer le rôle du RM dans l’adaptation de la morphologie et de la contractilité des cardiomyocytes. Des rates gestantes ont été traitées avec le canrénoate de potassium (20 mg/kg/jr), un antagoniste des RM. L’inhibition des RM pendant la gestation empêche l’hypertrophie cellulaire. De plus, l’inhibition des RM bloque l’effet du lactate et du pyruvate sur la contractilité. Chez la femme, la grossesse est associée à des changements des propriétés électriques du cœur. Sur l’électrocardiogramme, l’intervalle QTc est plus long, témoignant de la prolongation de la repolarisation. Les mécanismes régulant cette adaptation restent encore inconnus. Ainsi, notre troisième objectif était de déterminer le rôle du RM dans l’adaptation de la repolarisation. Chez la rate gestante, l’intervalle QTc est prolongé ce qui est corroboré par la diminution des courants potassiques Ito et IK1. L’inhibition des RM pendant la gestation empêche la prolongation de l’intervalle QTc et la diminution des courants Ito. Les travaux exposés dans cette thèse apportent une vision plus précise du remodelage cardiaque induit par la grossesse, qui est permise par l’étude à l’échelle cellulaire. Nos résultats montrent que lors de la gestation et de l’HG les cardiomyocytes subissent des remodelages morphologiques contrastés. Notre étude a aussi révélé que lors de la gestation, la fonction contractile est tributaire des adaptations métaboliques et que cette relation est altérée lors de l’HG. Nos travaux montrent que la régulation de ces adaptations gestationnelles fait intervenir le RM au niveau de la morphologie, de la relation métabolisme/fonctionnement contractile et de la repolarisation. En faisant avancer les connaissances sur l’hypertrophie de la grossesse, ces travaux vont permettre d’améliorer la compréhension des complications cardiovasculaires gestationnelles.

Régulation du cycle cellulaire par le récepteur natriurétique de type C dans les cellules du muscle lisse vasculaire : mécanismes moléculaires

Nous avons précédemment montré que l’activation du récepteur natriurétique de type C (NPR-C) par son agoniste spécifique, le C-ANP4-23, atténue l’augmentation de la prolifération des cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) induite par les peptides vasoactifs (Ang II, ET-1 et l’AVP). Puisque les CMLV provenant de rats spontanément hypertendus (SHR) montrent elles aussi un taux de prolifération plus élevé que leur contrôle, les CMLV de rats Wystar-Kyoto (WKY), nous avons entrepris cette étude dans le but de déterminer si C-ANP4-23 peut également diminuer le taux élevé de prolifération des CMLV de SHR et, le cas échéant déterminer les mécanismes responsables de cette réponse. Nos résultats montrent que le taux de prolifération des CMLV de SHR est significativement plus élevé que celui des CMLV de WKY et que la présence de C-ANP4-23 diminue de manière-dose dépendante le taux de prolifération des CMLV de SHR. En plus, l’expression des protéines de la phase G1 du cycle cellulaire, la cycline D1, la kinase dépendante des cyclines 2 (cdk2) et la forme phosphorylée de la protéine du rétinoblastome (pRb) est augmentée dans les CMLV de SHR comparativement aux CMLV de WKY et est atténué par C-ANP4-23. De plus, nos résultats montrent que les inhibiteurs du complexe cycline D1/cdk4 (NSC 625987) et cdk2 (NU2058) diminue le taux de prolifération élevé des CMLV de SHR. Les CMLV de SHR montrent également un taux de phosphorylation de ERK1/2 et d’AKT et est atténué par C-ANP4-23. De plus, le taux d’expression élevé des protéines cycline D1, cdk2 et pRb des CMLV de SHR est diminué par la toxine pertussis qui inactive la protéine Giα, le PD 98095, un inhibiteur de MEK de la voie des MAPK, du wortmannin, un inhibiteur de la PI3-K et finalement du losartan, un antagoniste du récepteur AT1. Ces résultats suggèrent que l’activation du récepteur NPR-C par C-ANP4-23 diminue le taux de prolifération élevé des CMLV de SHR par une régulation à la baisse des composantes du cycle cellulaire via l’inhibition de la protéine Giα et des voies signalétique MAP kinase/PI3-K.

Etudes ab initio des effets de la température sur le spectre optique des semi-conducteurs

Thèse réalisée en cotutelle avec l'Université Catholique de Louvain (Belgique)

Études sur la dérégulation des cytokines et des cellules Natural Killer chez les patients infectés par le VIH-1

La prolifération, la différenciation ainsi que les fonctions des cellules du système immunitaire sont contrôlées en partie par les cytokines. Lors de l’infection par le VIH-1, les défauts observés dans les fonctions, la maintenance, ainsi que la consistance des cellules du système immunitaire sont en large partie attribués à une production altérée des cytokines et à un manque d’efficacité au niveau de leurs effets biologiques. Durant ces études, nous nous sommes intéréssés à la régulation et aux fonctions de deux cytokines qui sont l’IL-18 et l’IL-21. Nous avons observé une corrélation inversée significative entre les concentrations sériques d’IL-18 et le nombre des cellules NK chez les patients infectés par le VIH-1. Nos expériences in vitro ont démontré que cette cytokine induit l’apoptose des cellules NK primaires et que cette mort peut être inhibée par des anticorps neutralisants spécifiques pour FasL et TNF-α. Cette mort cellulaire est due à l’expression de FasL sur les cellules NK et à la production de TNF-α par ces cellules. L’IL-18 augmente aussi la susceptibilité à la mort des cellules NK par un stimulus pro-apoptotique, en diminuant l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-XL. Nous démontrons aussi que, contrairement à l’IL-18, les niveaux d’IL-18BP sont plus faibles dans les sérum de patients infectés. Ceci résulte sur une production non coordonnée de ces deux facteurs, aboutissant à des niveaux élevés d’IL-18 libre et biologiquement active chez les patients infectés. L’infection de macrophages in vitro induit la production d’IL-18 et réduit celle d’IL-18BP. De plus, l’IL-10 et le TGF-β, dont les concentrations sont élevées chez les patients infectés, réduisent la production d’IL-18BP par les macrophages in vitro. Finalement, nous démontrons que l’IL-18 augmente la réplication du VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ infectés. Les niveaux élevés d’IL-18 libres et biologiquement actives chez les patients infectés contribuent donc à l’immuno-pathogénèse induite par le VIH-1 en perturbant l’homéostasie des cellules NK ainsi qu’en augmentant la réplication du virus chez les patients. Ces études suggèrent donc la neutralisation des effets néfastes de l’IL-18 en utilisant son inhibiteur naturel soit de l’IL-18BP exogène. Ceci permettrait de moduler l’activité de l’IL-18 in vivo à des niveaux souhaitables. L’IL-21 joue un rôle clef dans le contrôle des infections virales chroniques. Lors de ces études, nous avons déterminé la dynamique de la production d’IL-21 lors de l’infection par le VIH-1 et sa conséquence sur la survie des cellules T CD4+ et la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1. Nous avons démontré que sa production est compromise tôt au cours de l’infection et que les concentrations d’IL-21 corrèlent avec le compte de cellules T CD4+ chez les personnes infectées. Nos études ont démontré que le traitement antirétroviral restaure partiellement la production d’IL-21. De plus, l’infection par le VIH-1 de cellules T CD4+ humaines inhibe sa production en réduisant l’expression du facteur de transcription c-Maf. Nous avons aussi démontré que la fréquence des cellules T CD4+ spécifiques au VIH-1 qui produisent de l’IL-21 est réduite chez les patients virémiques. Selon nos résultats, l’IL-21 empêche l’apoptose spontanée des cellules T CD4+ de patients infectés et l’absence d’IL-21 réduit la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1 chez ces patients. Nos résultats démontrent que l'IL-21R est exprimé de façon égale sur tous les sous-types de cellules NK chez les donneurs sains et chez les patients infectés. L’IL-21 active les protéines STAT-3, MAPK et Akt afin d'augmenter les fonctions effectrices des cellules NK. L'activation de STAT-3 joue un rôle clef dans ces fonctions avec ou sans un traitement avec de l'IL-21. L'IL-21 augmente l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL, augmente la viabilité des cellules NK, mais ne possède aucun effet sur leur prolifération. Nous démontrons de plus que l'IL-21 augmente l'ADCC, les fonctions sécrétrices et cytotoxiques ainsi que la viabilité des cellules NK provenant de patients chroniquement infectés par le VIH-1. De plus, cette cytokine semble présenter ces effets sans augmenter en contrepartie la réplication du VIH-1. Elle permet donc d'inhiber la réplication virale lors de co-cultures autologues de cellules NK avec des cellules T CD4+ infectées d'une manière dépendante à l'expression de perforine et à l'utilisation de la protéine LFA-1. Les niveaux d’IL-21 pourraient donc servir de marqueurs biologiques pour accompagner les informations sur le taux de cellules T CD4+ circulantes en nous donnant des informations sur l’état de fonctionnalité de ce compartiment cellulaire. De plus, ces résultats suggèrent l’utilisation de cette cytokine en tant qu’agent immunothérapeutique pour restaurer les niveaux normaux d’IL-21 et augmenter la réponse antivirale chez les patients infectés par le VIH-1.

Mécanismes de recuit dans le silicium implanté par faisceau d’ion caractérisés par nanocalorimétrie

Nous présenterons le procédé de fabrication, la caractérisation, ainsi qu’un modèle numérique permettant l’optimisation d’un nouveau dispositif permettant d’effectuer des mesures de nanocalorimétrie sur un échantillon de silicium monocristallin. Ce dernier possède entre autre des propriétés thermiques nous permettant d’effectuer des mesures à des températures supérieures à 900 C, avec une résolution meilleure que 16 C. Ceci nous a permis d’étudier la dynamique des défauts induits par implantation ionique dans le silicium monocristallin. Deux comportements différents sont observés dans la germination de la phase amorphe induite par implantation à 10 et 80 keV. Ces résultats ont été confrontés à des simulations Monte-Carlo basées sur le modèle des paires lacunesinterstitiels. La comparaison entre les simulations et les mesures expérimentales ont montré que ce modèle est incomplet car il ne reproduit qualitativement que certaines caractéristiques observées expérimentalement. Des mesures réalisées à partir de -110 C dans le silicium monocristallin et amorphisé implanté avec des ions légers, ont mis en évidence des différences claires entre la relaxation dans le silicium amorphe et le recuit des défauts dans le silicium monocristallin. Deux processus à des énergies d’activation de 0.48 et 0.6 eV ont été observés pour les implantations réalisées dans le silicium monocristallin tandis qu’un relâchement de chaleur uniforme ne révélant qu’un spectre continu d’énergie d’activation a été observé dans le silicium amorphe.

Dégradation des membres de la famille du LDLR par la convertase PCSK9 : troisième locus de l'hypercholestérolémie familiale

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont les principales causes de mortalité et de morbidité à travers le monde. En Amérique du Nord, on estime à 90 millions le nombre d’individus ayant une ou plusieurs MCV, à près de 1 million le nombre de décès reliés par année et à 525 milliards de dollars les coûts directs et indirects en 2010. En collaboration avec l’équipe du Dre. Boileau, notre laboratoire a récemment identifié, le troisième locus impliqué dans l’hypercholestérolémie familiale. Une étude publiée dans le New Engl J Med a révélé que l’absence de la convertase PCSK9 réduit de 88% le risque de MCV, corrélé à une forte réduction du taux de cholestérol plasmatique (LDL-C). Il fut démontré que PCSK9 lie directement le récepteur aux lipoprotéines de faible densité (LDLR) et, par un mécanisme méconnu, favorise sa dégradation dans les endosomes/lysosomes provoquant ainsi une accumulation des particules LDL-C dans le plasma. Dans cet ouvrage, nous nous sommes intéressés à trois aspects bien distincts : [1] Quels sont les cibles de PCSK9 ? [2] Quelle voie du trafic cellulaire est impliquée dans la dégradation du LDLR par PCSK9 ? [3] Comment peut-on inhiber la fonction de PCSK9 ? [1] Nous avons démontré que PCSK9 induit la dégradation du LDLR de même que les récepteurs ApoER2 et VLDLR. Ces deux membres de la famille du LDLR (fortes homologies) sont impliqués notamment dans le métabolisme des lipides et de la mise en place de structures neuronales. De plus, nous avons remarqué que la présence de ces récepteurs favorise l’attachement cellulaire de PCSK9 et ce, indépendamment de la présence du LDLR. Cette étude a ouvert pour la première fois le spectre d’action de PCSK9 sur d’autres protéines membranaires. [2] PCSK9 étant une protéine de la voie sécrétoire, nous avons ensuite évalué l’apport des différentes voies du trafic cellulaire, soit extra- ou intracellulaire, impliquées dans la dégradation du LDLR. À l’aide de milieux conditionnées dérivés d’hépatocytes primaires, nous avons d’abord démontré que le niveau extracellulaire de PCSK9 endogène n’a pas une grande influence sur la dégradation intracellulaire du LDLR, lorsqu’incubés sur des hépatocytes provenant de souris déficientes en PCSK9 (Pcsk9-/-). Par analyses de tri cellulaire (FACS), nous avons ensuite remarqué que la surexpression de PCSK9 diminue localement les niveaux de LDLR avec peu d’effet sur les cellules voisines. Lorsque nous avons bloqué l’endocytose du LDLR dans les cellules HepG2 (lignée de cellules hépatiques pour l’étude endogène de PCSK9), nous n’avons dénoté aucun changement des niveaux protéiques du récepteur. Par contre, nous avons pu démontrer que PCSK9 favorise la dégradation du LDLR par l’intermédiaire d’une voie intracellulaire. En effet l’interruption du trafic vésiculaire entre le réseau trans-Golgien (RTG) et les endosomes (interférence à l’ARN contre les chaînes légères de clathrine ; siCLCs) prévient la dégradation du LDLR de manière PCSK9-dépendante. [3] Par immunobuvardage d’affinité, nous avons identifié que la protéine Annexine A2 (AnxA2) interagit spécifiquement avec le domaine C-terminal de PCSK9, important pour son action sur le LDLR. Plus spécifiquement, nous avons cartographié le domaine R1 (acides aminés 34 à 108) comme étant responsable de l’interaction PCSK9AnxA2 qui, jusqu’à présent, n’avait aucune fonction propre. Finalement, nous avons démontré que l’ajout d’AnxA2 prévient la dégradation du LDLR induite par PCSK9. En somme, nos travaux ont pu identifier que d’autres membres de la famille du LDLR, soit ApoER2 et VLDLR, sont sensibles à la présence de PCSK9. De plus, nous avons mis en évidence que l’intégrité du trafic intracellulaire est critique à l’action de PCSK9 sur le LDLR et ce, de manière endogène. Finalement, nous avons identifié l’Annexine A2 comme unique inhibiteur naturel pouvant interférer avec la dégradation du LDLR par PCSK9. Il est indéniable que PCSK9 soit une cible de premier choix pour contrer l’hypercholestérolémie afin de prévenir le développement de MCV. Cet ouvrage apporte donc des apports considérables dans notre compréhension des voies cellulaires impliquées, des cibles affectées et ouvre directement la porte à une approche thérapeutique à fort potentiel.

Identification des peptides du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I par spectrométrie de masse

L’immunité adaptive et la discrimination entre le soi et le non-soi chez les vertébrés à mâchoire reposent sur la présentation de peptides par les récepteurs d’histocompatibilité majeur de classe I. Les peptides antigéniques, présentés par les molécules du complexe d’histocompatibilité (CMH), sont scrutés par les lymphocytes T CD8 pour une réponse immunitaire appropriée. Le répertoire des peptides du CMH de classe I, aussi appelé immunopeptidome, est généré par la dégradation protéosomale des protéines endogènes, et a un rôle essentiel dans la régulation de l’immunité cellulaire. La composition de l’immunopeptidome dépend du type de cellule et peut présenter des caractéristiques liées à des maladies comme le cancer. Les peptides antigéniques peuvent être utilisés à des fins immunothérapeutiques notamment dans le traitement voire la prévention de certains cancers. La spectrométrie de masse est un outil de choix pour l’identification, le séquençage et la caractérisation de ces peptides. Cependant, la composition en acides aminés, la faible abondance et la diversité de ces peptides compliquent leur détection et leur séquençage. Nous avons développé un programme appelé StatPeaks qui permet de calculer un certains nombres de statistiques relatives à la fragmentation des peptides. À l’aide de ce programme, nous montrons sans équivoque que les peptides du CMH classe I, en mode de fragmentation par dissociation induite par collision (CID), fragmentent très différemment des peptides trypsiques communément utilisés en protéomique. Néanmoins, la fragmentation par décomposition induite par collision à plus haute énergie (HCD) proposée par le spectromètre LTQ-Orbitrap Velos améliore la fragmentation et fournit une haute résolution qui permet d’obtenir une meilleure confiance dans l’identification des peptides du CMH de classe I. Cet avantage permet d’effectuer le séquençage de novo pour identifier les variants polymorphes qui ne sont normalement pas identifiés par les recherches utilisant des bases de données. La comparaison des programmes de séquençage Lutefisk, pepNovo, pNovo, Vonode et Peaks met en évidence que le dernier permet d’identifier un plus grand nombre de peptides du CMH de classe I. Ce programme est intégré dans une chaîne de traitement de recherche d’antigènes mineurs d’histocompatibilité. Enfin, une base de données contenant les informations spectrales de plusieurs centaines de peptides du CMH de classe I accessible par Internet a été développée.

Modulation de la signalisation du récepteur de type 2 du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGFR-2) par l’ubiquitination

Résumé L’angiogenèse est l’un des processus les plus importants pour le maintien de l’homéostasie de l’oxygène dans les tissus. Le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, VEGF, joue un rôle primordial dans la réponse angiogénique. Ce facteur de croissance mène à l’activation du récepteur de type 2 du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, VEGFR-2. Suite à une activation du VEGFR-2, plusieurs cascades de signalisation sont activées dans les cellules endothéliales. Afin d’atténuer cette signalisation, le VEGFR-2 est multi-ubiquitiné sur des résidus lysine et de cette manière, il est amené aux voies de dégradation, principalement dans les lysosomes. Cette ubiquitination est induite par l’association de l’ubiquitine ligase (E3) c-Cbl à un résidu tyrosine phosphorylé du domaine C-terminal du récepteur. Dans cette étude, nous avons identifié la tyrosine 1319 comme étant nécessaire pour l’association de c-Cbl au VEGFR-2 et son ubiquitination. Nos résultats démontrent aussi que dans des cellules endothéliales aortiques bovines, BAEC, la surexpression du récepteur mutant Y1319F ralentit la dégradation du VEGFR-2 et induit une activation plus forte et prolongée de la synthétase endothéliale du monoxyde d’azote (eNOS). Ces résultats nous permettent de mieux comprendre le déroulement de la régulation de la signalisation du VEGFR-2 au niveau intracellulaire. Mots-clés: [Angiogenèse, VEGFR-2, VEGF, c-Cbl, Ubiquitination, Tyrosine 1319, Dégradation]

Étude du mécanisme par lequel la thérapie à l'IL7 induit l'expansion homéostatique des lymphocytes T CD4+

Dans les cas de lymphopénie, les lymphocytes T résiduels prolifèrent exagérément dans un phénomène appelé «expansion homéostatique périphérique» (HPE), qui est efficace pour la régénération des T CD8+, mais inefficace pour les T CD4+. L’interleukine-7 (IL7) est une cytokine homéostatique utilisée afin d’augmenter les comptes lymphocytaires T des patients lymphopéniques. Toutefois, la raison de l’expansion préférentielle des lymphocytes T CD8+ par l’IL7 demeure toujours inconnue. Nous montrons que cette expansion est due au fait que l’IL7 induit une prolifération efficace des T CD8+ périphériques (CD8+PERI) ainsi que des émigrants thymiques CD8+ (CD8+RTEs). Par contre, l’effet prolifératif de l’IL7 est restreint presqu’uniquement aux CD4+RTEs même si les CD4+PERI survivent mieux que les CD4+RTEs. De plus faibles doses d’IL7 sont nécessaires aux CD4+RTEs afin de phosphoryler STAT5 ou de proliférer comparativement aux CD4+PERI et nous démontrons que les contacts TCR/CMHII sont nécessaires à la prolifération induite par l’IL7 des CD4+RTEs en périphérie. De fait, augmenter au Flt3 ligand le nombre de cellules dendritiques périphériques d’une souris donneuse, avant de transférer ses TPERI dans des souris receveuses traitées à l’IL7 induit une prolifération significative des CD4+PERI. Nos résultats indiquent donc que l’abondance des contacts TCR/CMHII reçus dans le thymus semble contrôler la sensibilité à l’IL7 des CD4+RTEs. Finalement, l’observation que les CD8+PERI et CD8+RTEs prolifèrent pareillement pendant la thérapie à l’IL7, alors que la prolifération des T CD4+ est largement restreinte aux RTEs expliquerait pourquoi, dans les cas de lymphopénie, la régénération des T CD4+ est aussi dépendante de la thymopoïèse.

Rôle de l'estérification des acides gras dans la régulation de la sécrétion d'insuline et le stress métabolique induits par le glucose

Le diabète est une maladie chronique de l’homéostasie du glucose caractérisée par une hyperglycémie non contrôlée qui est le résultat d’une défaillance de la sécrétion d’insuline en combinaison ou non avec une altération de l’action de l’insuline. La surnutrition et le manque d’activité physique chez des individus qui ont des prédispositions génétiques donnent lieu à la résistance à l’insuline. Pendant cette période dite de compensation où la concentration d’acides gras plasmatiques est élevée, l’hyperinsulinémie compense pleinement pour la résistance à l’insuline des tissus cibles et la glycémie est normale. Le métabolisme du glucose par la cellule pancréatique bêta entraîne la sécrétion d’insuline. Selon le modèle classique de la sécrétion d’insuline induite par le glucose, l’augmentation du ratio ATP/ADP résultant de la glycolyse et de l’oxydation du glucose, induit la fermeture des canaux KATP-dépendant modifiant ainsi le potentiel membranaire suivi d’un influx de Ca2+. Cet influx de Ca2+ permet l’exocytose des granules de sécrétion contenant l’insuline. Plusieurs nutriments comme les acides gras sont capables de potentialiser la sécrétion d’insuline. Cependant, le modèle classique ne permet pas d’expliquer cette potentialisation de la sécrétion d’insuline par les acides gras. Pour expliquer l’effet potentialisateur des acides gras, notre laboratoire a proposé un modèle complémentaire où le malonyl-CoA dérivé du métabolisme anaplérotique du glucose inhibe la carnitine palmitoyltransférase-1, l’enzyme qui constitue l’étape limitante de l’oxydation des acides gras favorisant ainsi leur estérification et donc la formation de dérivés lipidiques signalétiques. Le modèle anaplérotique/lipidique de la sécrétion d'insuline induite par le glucose prédit que le malonyl-CoA dérivé du métabolisme du glucose inhibe la bêta-oxydation des acides gras et augmente la disponibilité des acyl-CoA ou des acides gras non-estérifiés. Les molécules lipidiques agissant comme facteurs de couplage du métabolisme des acides gras à l'exocytose d'insuline sont encore inconnus. Des travaux réalisés par notre laboratoire ont démontré qu’en augmentant la répartition des acides gras vers la bêta-oxydation, la sécrétion d’insuline induite par le glucose était réduite suggérant qu’un des dérivés de l’estérification des acides gras est important pour la potentialisation sur la sécrétion d’insuline. En effet, à des concentrations élevées de glucose, les acides gras peuvent être estérifiés d’abord en acide lysophosphatidique (LPA), en acide phosphatidique (PA) et en diacylglycérol (DAG) et subséquemment en triglycérides (TG). La présente étude a établi l’importance relative du processus d’estérification des acides gras dans la production de facteurs potentialisant la sécrétion d’insuline. Nous avions émis l’hypothèse que des molécules dérivées des processus d’estérification des acides gras (ex : l’acide lysophosphatidique (LPA) et le diacylglycerol (DAG)) agissent comme signaux métaboliques et sont responsables de la modulation de la sécrétion d’insuline en présence d’acides gras. Afin de vérifier celle-ci, nous avons modifié le niveau d’expression des enzymes clés contrôlant le processus d’estérification par des approches de biologie moléculaire afin de changer la répartition des acides gras dans la cellule bêta. L’expression des différents isoformes de la glycérol-3-phosphate acyltransférase (GPAT), qui catalyse la première étape d’estérification des acides gras a été augmenté et inhibé. Les effets de la modulation de l’expression des isoenzymes de GPAT sur les processus d’estérifications, sur la bêta-oxydation et sur la sécrétion d’insuline induite par le glucose ont été étudiés. Les différentes approches que nous avons utilisées ont changé les niveaux de DAG et de TG sans toutefois altérer la sécrétion d’insuline induite par le glucose. Ainsi, les résultats de cette étude n’ont pas associé de rôle pour l’estérification de novo des acides gras dans leur potentialisation de la sécrétion d’insuline. Cependant, l’estérification des acides gras fait partie intégrante d’un cycle de TG/acides gras avec sa contrepartie lipolytique. D’ailleurs, des études parallèles à la mienne menées par des collègues du laboratoire ont démontré un rôle pour la lipolyse et un cycle TG/acides gras dans la potentialisation de la sécrétion d’insuline par les acides gras. Parallèlement à nos études des mécanismes de la sécrétion d’insuline impliquant les acides gras, notre laboratoire s’intéresse aussi aux effets négatifs des acides gras sur la cellule bêta. La glucolipotoxicité, résultant d’une exposition chronique aux acides gras saturés en présence d’une concentration élevée de glucose, est d’un intérêt particulier vu la prépondérance de l’obésité. L’isoforme microsomal de GPAT a aussi utilisé comme outil moléculaire dans le contexte de la glucolipotoxicité afin d’étudier le rôle de la synthèse de novo de lipides complexes dans le contexte de décompensation où la fonction des cellules bêta diminue. La surexpression de l’isoforme microsomal de la GPAT, menant à l’augmentation de l’estérification des acides gras et à une diminution de la bêta-oxydation, nous permet de conclure que cette modification métabolique est instrumentale dans la glucolipotoxicité.

Implication de l'association CD20/CD40 dans la mort cellulaire induite via le CD20

CD20 est une phosphoprotéine transmembranaire exprimée spécifiquement à la surface des lymphocytes B. Malgré les nombreuses études qui ont montré son implication dans le flux calcique, son rôle physiologique est assez mal connu. Cependant, des études récentes ont démontré que CD20 peut jouer un rôle important dans la mort cellulaire. D’ailleurs, le rituximab, un anticorps monoclonal chimérique dirigé contre CD20 humain, a montré son efficacité dans le traitement de nombreuses maladies auto-immunes. Cet anticorps est capable d’induire une profonde déplétion des lymphocytes B, qui va également interférer avec la coopération T et la sécrétion de cytokines. En plus, l’engagement du CD20 à la surface des cellules induit la mort cellulaire, alors que la partie cytoplasmique de cette molécule ne possède pas un motif de mort. Donc, il est possible que cette réponse soit médiée par des molécules qui semblent être associées au CD20 comme CD40. En effet, CD40, une glycoprotéine transmembranaire de type I, est un composant majeur du système immunitaire, dont l’engagement pourrait moduler la fonction cellulaire et même conduire à la mort rapide des cellules B. Le travail présenté dans ce mémoire porte sur l’étude de la mort cellulaire induite par un anti-CD20, le rituximab, ainsi que l’étude du rôle de l’association CD20/CD40 dans la mort cellulaire médiée par cet anticorps. Nos résultats montrent que la mort cellulaire induite par le rituximab varie en fonction du type cellulaire et du niveau d’expression du CD20, et que la présence du CD40 à la surface des cellules augmente l’activité de la mort cellulaire induite par le rituximab. En plus, CD20 et CD40 sont associés à la surface cellulaire, et la partie cytoplasmique n’est pas impliquée dans cette association mais semble être importante dans la mort cellulaire induite via CD20.

Réactivité posturale et inconfort subjectif induits par un stimulus visuel

Il est bien connu des professionnels de la vision que l’ajustement des verres progressifs sur un patient presbyte peut induire de l’inconfort et des difficultés posturales (Timmis, Johnson, Elliott, & Buckley, 2010). Ces plaintes sont directement associées à l’information visuelle perçue à travers les verres progressifs. Le principal objectif de cette thèse est d’identifier quels sont les paramètres d’un stimulus visuel (p.ex. fréquence temporelle ou vélocité) à l’origine de la perturbation posturale et de l’inconfort. Les distorsions dynamiques perçues à travers des verres progressifs s’apparentent aux mouvements d’un bateau qui roule de droite à gauche ou qui tangue d’avant en arrière. Ce type de stimulation visuelle a été reproduit dans une voute d’immersion en réalité virtuelle avec un sol à texture de damier noir et blanc qui oscillait périodiquement de droite à gauche et d’avant en arrière à différentes fréquences et amplitudes. Les études qui portent sur ce sujet montrent que la réponse posturale induite visuellement augmente avec la vélocité de stimulation et diminue lorsque la fréquence augmente. Cette information peut paraitre contradictoire, car ces deux variables sont liées entre elles par l’amplitude et covarient dans le même sens. Le premier objectif de cette thèse était de déterminer les causes possibles de cette contradiction. En faisant varier la fréquence temporelle de stimulation visuelle, on retrouve deux domaines de réponse posturale. Le premier domaine correspond aux fréquences inférieures à 0,12 Hz. Dans ce domaine, la réponse posturale est visuodépendante et augmente avec la vélocité du stimulus. Le second domaine postural correspond aux fréquences supérieures à 0,25 Hz. Dans ce domaine, la réponse posturale sature et diminue avec l’augmentation de la fréquence. Cette saturation de la réponse posturale semble causée par des limitations biomécaniques et fréquentielles du système postural. D’autres études ont envisagé d’étudier l’inconfort subjectif induit par des stimuli visuels périodiques. Au sein de la communauté scientifique, deux théories principales se confrontent. La théorie sensorielle repose sur les conflits sensoriels induit par le stimulus visuel tandis que la théorie posturale suggère que l’inconfort est la conséquence de l’instabilité posturale. Nos résultats révèlent que l’inconfort subjectif induit par une stimulation visuelle dynamique dépend de la vélocité du stimulus plutôt que de sa fréquence. L’inconfort peut être prédit par l’instabilité naturelle des individus en l’absence de stimulus visuel comme le suggère la théorie posturale. Par contre, l’instabilité posturale induite par un stimulus visuel dynamique ne semble pas être une condition nécessaire et suffisante pour entrainer de l’inconfort. Ni la théorie sensorielle ni la théorie posturale ne permettent à elles seules d’expliquer tous les mécanismes à l’origine de l’inconfort subjectif. Ces deux théories sont complémentaires, l’une expliquant que l’instabilité intrinsèque est un élément prédictif de l’inconfort et l’autre que l’inconfort induit par un stimulus visuel dynamique résulte d’un conflit entre les entrées sensorielles et les représentations acquises par l’individu.

Novel non phospholipid liposomes with high sterol content : development and characterization

Les liposomes sont des nanovecteurs polyvalents et prometteurs quant à leur utilisation dans plusieurs domaines. Il y a une décennie, un nouveau type de liposome constitué d’amphiphiles monoalkylés et de stérols est né fortuitement dans notre groupe. Ils sont nommés Stérosomes puisqu’ils contiennent une grande proportion de stérols, entre 50 et 70 mol %. Les objectifs de cette thèse sont de développer de nouvelles formulations de Stérosomes ayant des caractéristiques spécifiques et d’acquérir une compréhension plus profonde des règles physicochimiques qui dictent leur comportement de phase. Nous avons spécifiquement examiné le rôle de motifs moléculaires des stérols, de la charge interfaciale et de la capacité à former des liaisons H dans les interactions intermoléculaires menant à l’autoassemblage. Le comportement de phase a été caractérisé par calorimétrie différentielle à balayage (DSC), par spectroscopie infrarouge (IR) et par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire du deutérium (²H NMR). Premièrement, nous avons établi certaines corrélations entre la structure des stérols, leur tendance à former des bicouches fluides en présence d'amphiphile monoalkylé et la perméabilité des grandes vésicules unilamellaires (LUV) formées. La nature des stérols module les propriétés de mélange avec de l’acide palmitique (PA). Les stérols portant une chaîne volumineuse en position C17 sont moins aptes à induire des bicouches fluides que ceux qui ont une chaîne plus simple, comme celle du cholestérol. Un grand ordre de la chaîne alkyle de PA est un effet commun à tous les stérols investigués. Il a été démontré que la perméabilité des LUV peut être contrôlée en utilisant des stérols différents. Cependant, ces stérols n’ont aucun impact significatif sur la sensibilité des Stérosomes au pH. Afin de créer des liposomes qui sont sensibles au pH et qui ont une charge positive à la surface, des Stérosomes composés de stéarylamine et de cholestérol (Chol) ont été conçus et caractérisés. Il a été conclu que l’état de protonation de l’amine, dans ce travail, ou du groupe carboxylique, dans un travail précédent, confère une sensibilité au pH et détermine la charge à la surface du liposome. Les premiers Stérosomes complètement neutres ont été fabriqués en utilisant un réseau de fortes liaisons H intermoléculaires. Le groupe sulfoxyde est capable de former de fortes liaisons H avec le cholestérol et les molécules d’eau. Une bicouche fluide métastable a été obtenue, à la température de la pièce, à partir d'un mélange équimolaire d’octadécyl méthyl sulfoxyde (OMSO) et de Chol. Ce comportement distinct a permis d’extruder le mélange pour former des LUV à la température de la pièce. Après 30 h, le temps de vie de la phase métastable, des Stérosomes stables et imperméables existaient toujours sous une forme solide. Un diagramme de température-composition a été proposé afin de résumer le comportement de phase des mélanges d’OMSO/Chol. Finalement, nous avons élaboré des Stérosomes furtifs en incorporant du polyéthylène glycol (PEG) avec une ancre de cholestérol (PEG-Chol) à l’interface de Stérosomes de PA/Chol. Jusqu’à 20 mol % de PEG-Chol peut être introduit sans perturber la structure de la bicouche. La présence du PEG-Chol n’a aucun impact significatif sur la perméabilité de la LUV. L'encapsulation active de la doxorubicine, un médicament contre le cancer, a été réalisée malgré la faible perméabilité de ces LUV et la présence du PEG à l’interface. L’inclusion de PEG a modifié considérablement les propriétés de l’interface et a diminué la libération induite par la variation de pH observée avec des LUV nues de PA/Chol. Cette formulation inédite est potentiellement utile pour l’administration intraveineuse de médicaments.

Étude des mécanismes cellulaires activés par l'Angiopoïétine-1 et le VEGF régulant la perméabilité et la migration endothéliales

L’angiogenèse est la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d’un réseau vasculaire existant. C’est un phénomène essentiel pour des processus physiologiques et pathologiques. L’activation des cellules endothéliales est contrôlée par plusieurs facteurs de croissance. Le VEGF et son récepteur le VEGFR-2 ont été prouvés comme étant spécifiques et critiques pour la formation des vaisseaux sanguins alors que Tie2, le récepteur auquel se lie l’Ang-1, est requis aussi bien dans le développement vasculaire que dans l’angiogenèse tumorale. Il est connu que l’activation de Tie2 est nécessaire à la stabilisation finale de la vascularisation en inhibant la perméabilité vasculaire induite par le VEGFR-2. Nous avons premièrement découvert que le facteur de croissance pro-angiogénique, l’Ang-1 contrecarre les effets de perméabilité cellulaire induits par le VEGF en inhibant la production de NO dans les cellules endothéliales. Cet effet inhibiteur de Tie2 intervient directement au niveau de l’activité de l’enzyme eNOS. Suite à l’activation de Tie2 par l’Ang-1, eNOS devient fortement phosphorylé sur la Thr497 après la phosphorylation et l’activation de la PKCζ. Nos résultats suggèrent que l’inhibition, par Tie2, de la perméabilité vasculaire durant l’angiogenèse serait due, en partie, à l’inhibition de la production de NO. Deuxièmement nous avons pu distinguer entre deux modes de migration cellulaire endothéliale induits par l’Ang-1 et le VEGF. À l’opposé du VEGF qui promeut une migration individuelle aléatoire, l’Ang-1 induit une migration collective directionnelle. Dans cette étude, nous avons identifié la β-caténine comme un nouveau partenaire moléculaire de la PKCζ. Cette association de la PKCζ à la β-caténine amène le complexe de polarité Par6-aPKC et le complexe des jonctions d’adhérences cellulaires à interagir ensemble à deux localisations différentes au niveau de la cellule endothéliale. Au niveau des contacts intercellulaires, le complexe PKCζ/β-caténine maintien la cohésion et l’adhésion cellulaire nécessaire pour le processus migratoire collectif. Ce complexe se retrouve aussi au niveau du front migratoire des cellules endothéliales afin d’assurer la directionalité et la persistance de la migration endothéliale en réponse à l’Ang-1. D’une manière intéressante, lors de l’inhibition de la PKCζ ou de la β-caténine on assiste à un changement du mode de migration en réponse à l’Ang-1 qui passe d’une migration directionnelle collective à une migration individuelle aléatoire. Ce dernier mode de migration est similaire à celui observé chez des cellules endothéliales exposées au VEGF. Ces résultats ont été corroborés in vivo par une polarité et une adhésion défectueuses au cours de la vasculogenèse chez le poisson zèbre déficient en PKCζ. En résumé, Ang-1/Tie2 module la signalisation et les réponses biologiques endothéliales déclenchées par le VEGF/VEGFR-2. L’identification des mécanismes moléculaires en aval de ces deux récepteurs, Tie2 et VEGFR-2, et la compréhension des différentes voies de signalisation activées par ces complexes moléculaires nous permettra de mettre la lumière sur des nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des maladies angiogéniques.