MOLECULAR TYPING OF Giardia duodenalis ISOLATES FROM NONHUMAN PRIMATES HOUSED IN A BRAZILIAN ZOO

A pesquisa de infecções por Giardia e a caracterização genotípica deste protozoário foi realizada em primatas não humanos (PNH) mantidos em Zoológico a fim de avaliar o seu potencial zoonótico. As amostras dos animais consistiram de fezes colhidas do piso de 22 baias onde eram mantidos 47 primatas de 18 diferentes espécies. Exames coproparasitológicos foram realizados pelos métodos de concentração por sedimentação e centrífugo-flutuação e revelaram a presença dos seguintes parasitas e suas respectivas frequências: Giardia (18%); Entamoeba spp. (18%); Endolimax nana (4.5%); Iodamoeba spp. (4.5%); oxiurídeos (4.5%) e estrongilídeos (4.5%). O DNA extraído de todas as amostras fecais foi submetido à técnica de PCR para a amplificação dos genes gdh e tpi de Giardia, porém, só foram obtidos amplicons das quatro amostras positivas provenientes de Ateles belzebuth, Alouatta caraya, Alouatta fusca and Alouatta seniculus. O seqüenciamento dos fragmentos amplificados foi possível apenas para as amostras oriundas de Ateles belzebuth (BA1), Alouatta fusca (BA2) e Alouatta caraya (BA3), cuja análise fenética de ambos os genes revelou pertencerem ao genótipo A. As análises das sequências de tpi revelaram que todas as amostras pertencem ao subgenótipo AII. No que se refere ao gene gdh as análises revelaram uma amostra pertencente ao subgenótipo AII (BA3) e duas ao subgenótipo A1 (BA1 e BA2). Considerando o potencial zoonótico do genótipo A e o fato de que os animais não apresentavam sintomas de infecção, os dados do presente trabalho salientam a importância de se realizar, periodicamente, exames coproparasitológicos dos animais de zoológico, para implementação de medidas preventivas para resguardar a saúde dos animais em cativeiro, a de seus tratadores e dos visitantes de parques zoológicos.

Avaliação parasitológica em amostras de alfaces (Lactuca sativa var. crispa) comercializadas no município de Quatá, São Paulo, Brasil

There is little research on the practices of sanitary inspection in the chain of production of vegetables to the consumer, especially those eaten raw, they are liable to serve microorganism such as bacteria, fungi and parasites, contributing to possible health hazards. The aim of this study was to assess qualitatively contamination by parasites and / or commensals of medical interest in lettuce leaves (Lactuca sativa) fresh market in the municipality of Quata Sao Paulo. A total of 15 random samples were analyzed every other day of the three different places that sell vegetables a grocery store, a supermarket and a vegetable garden during the month of May 2011. The parasites and / or commensals found in lettuce were Entamoeba coli (67%), Entamoeba histolytica (20%), Giardia sp (13%) and Ascaris lumbricoides (7%). The analysis showed the presence of parasites and / or commensals in all samples, except in the cultivated garden which showed poor sanitary conditions, probably due to contamination in the shipping and handling by third parties in supermarket and grocery store. The parasite monitoring sanitary conditions of vegetables sold in urban environments becomes relevant for preventive measures to avoid the continued parasitic cycle and possible future health complications.

Parasitos e comensais intestinais em pacientes neoplásicos submetidos à quimioterapia

The objective of this study was to verify the prevalence of intestinal parasites and/or commensals in the neoplastic patients undergoing chemotherapy. Stool samples were analyzed by the method of Lutz (1919) and Rugai (1954), in triplicate. This work was composed of three groups, the first one (GI) formed by neoplastic patients that are not undergoing chemotherapy, the second (GII) comprised patients who were undergoing chemotherapy, and the third group (GIII) consisting of patients who completed chemotherapy. A total of 30 patients (GI-5, GII-18 and GIII-7) were screened at the Assis Regional Hospital of the Unified Health System of Assis, São Paulo.Additional information on antiparasitic treatment and tumor type were obtained by questionnaire. The positivity was 66.7% (20 cases) for intestinal parasites and/or commensals. The helminths were Ascaris lumbricoides (36.7%), Hookworms (20%) and Hymenolepis diminuta (3.3%). Among the highlights are protozoan Giardia lamblia (46.7%), Entamoeba coli (6.7%), E. histolytica /dispar (3.3%), Endolimax nana (3.3%) and Iodameba butschlii (3.3%). The high frequency of intestinal parasites and/or commensals in the neoplastic patients can be attributed to poor personal hygiene and lack of immunity to reinfection and poor knowledge of the prophylaxis of infection by protozoa and helminths. The results indicate the necessity of adopting a new criterion for neoplastic patients undergoing chemotherapy, primarily performing parasitological diagnosis, treatment and monitoring of cure of intestinal parasitic infections in this risk group.

Diagnóstico parasitológico de horticultures no monitoramento da contaminação parasitária em ambientes rurais

The objective of this study was to detect possible carriers of parasites and/or commensals between the horticulturists of Fair of the Producer from Upper Paranaiba, Minas Gerais. A total of 30 horticulturists were instructed to collect three stool samples on alternate days during the months of August and September 2007. Horticulturists were positive 40% for one or more parasite and / or dinner, and found: Giardia lamblia (3.5%), Entamoeba histolytica / E. dispar (7%), Entamoeba coli (13%), Endolimax nana (13%) and Ascaris lumbricoides (3.5%). Stool of gardeners is of importance in monitoring parasite sanitary conditions of vegetables sold in urban environments.

Infecções parasitárias na gravidez: prevalência e auto medicação com plantas medicinais na região de Araraquara -São Paulo - Brasil

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Parasitological risk assessment from wastewater reuse for disposal in soil in developing countries

The purpose of this work is to analyze the parasitological risks of treated wastewater reuse from a stabilization pond in the city of Piracicaba, in the State of Sao Paulo (Brazil), and the level of treatment required to protect public health. Samples were taken from raw and treated wastewater in stabilization ponds and submitted to a parasitological, microbiological and physicochemical analysis. The study revealed on treated wastewater the presence of Ascaris sp. and Entamoeba coli with an average density of 1 cysts L-1 and 6 eggs L-1, respectively. For Ascaris, the annual risks of infection due to the accidental ingestion of wastewater irrigation were 7.5 x 10(-2) in 208 days and 8.7 x 10(-2) in 240 days. For Total Coliforms and Escherichia coli in treated wastewater, the average density was 1.0 x 10(5) MPN/100 ml and 2.7 x 10(4) MPN/100 ml respectively, representing 99% and 94% removal efficiency, respectively. For BOD, COD, TS and TSS removal efficiency was 69, 80, 50 and 71%, respectively. The removal efficiency for nitrogen; ammonia nitrogen and total phosphate was 24, 19 and 68%, respectively. The average density of helminths eggs in treated wastewater is higher compared to the density of the limit value of <= 1 egg L-1 and tolerable risk is above the level recommended by the World Health Organization. Multiple barriers are necessary for the reduction of organic matter, chemical contaminants and parasites from treated wastewater. Standards for the sanitary control of treated wastewater to be reused in agricultural irrigation areas should be compiled for developing countries in order to minimize public health risks.

Is H. pylori infection associated with diarrhea in a cohort of 3- to 8-year-old Colombian children?

The Estudio Comunitario sobre la Salud del Niño cohort study followed 326 3- to 8-year-old Colombian children for 4 years to observe the natural history of Helicobacter pylori infection and identify risk factors for acquisition, recurrence and persistence. Acute H. pylori infection during childhood may predispose to other enteric infections and therefore increase the risk of diarrheal disease. This dissertation aimed to estimate the effect of H. pylori infection on the occurrence of diarrhea and parasitic co-infections. The analysis used Generalized Estimating Equations to obtain odds ratios to estimate relative risks for diarrhea and the Zhang-Yu algorithm to estimate relative risks for on parasitic infections. Andersen-Gill models were used to estimate rate ratios for the effect of H. pylori status on the recurrence of parasitic infections. H. pylori status was classified for the entire follow-up duration in 1 of 3 categories: persistently positive, intermittently positive, and persistently negative. Multivariable models included child’s sex, age, symptoms, medication use, and socio-environmental factors. H. pylori infection was weakly and imprecisely associated with diarrheal disease, which occurred at an unexpectedly low frequency in this study. Persistently H. pylori-positive children had a somewhat higher incidence of reported diarrhea than intermittently positive or persistently negative children. Stratified analysis revealed that the presence of specific helminthes modified the effect of persistent H. pylori infection on diarrhea. The incidence of any parasitic infections was higher in children with persistent H. pylori infection relative to those with intermittent or persistently negative status, but this association did not hold when adjusted for the full set of selected covariates. The effects of H. pylori persistent status were similar for the occurrence or recurrence of Giardia duodenalis, Entamoeba histolytica, and Ascaris lumbricoides. These results show that H. pylori frequently co-exists with other parasites in Andean children and suggest that intermittently H. pylori–positive children might be at a lower risk of parasitic infections than persistently positive children. The relationship of H. pylori infection, helminthic infection and diarrheal disease should be further explored in studies that devote more intensive resources to accurate ascertainment of diarrhea.^

Presence of a mitochondrial-type 70-kDa heat shock protein in Trichomonas vaginalis suggests a very early mitochondrial endosymbiosis in eukaryotes

Molecular phylogenetic analyses, based mainly on ribosomal RNA, show that three amitochondriate protist lineages, diplomonads, microsporidia, and trichomonads, emerge consistently at the base of the eukaryotic tree before groups having mitochondria. This suggests that these groups could have diverged before the mitochondrial endosymbiosis. Nevertheless, since all these organisms live in anaerobic environments, the absence of mitochondria might be due to secondary loss, as demonstrated for the later emerging eukaryote Entamoeba histolytica. We have now isolated from Trichomonas vaginalis a gene encoding a chaperone protein (HSP70) that in other lineages is addressed to the mitochondrial compartment. The phylogenetic reconstruction unambiguously located this HSP70 within a large set of mitochondrial sequences, itself a sister-group of α-purple bacteria. In addition, the T. vaginalis protein exhibits the GDAWV sequence signature, so far exclusively found in mitochondrial HSP70 and in proteobacterial dnaK. Thus mitochondrial endosymbiosis could have occurred earlier than previously assumed. The trichomonad double membrane-bounded organelles, the hydrogenosomes, could have evolved from mitochondria.

A nuclear gene of eubacterial origin in Euglena gracilis reflects cryptic endosymbioses during protist evolution.

Genes for glycolytic and Calvin-cycle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) of higher eukaryotes derive from ancient gene duplications which occurred in eubacterial genomes; both were transferred to the nucleus during the course of endosymbiosis. We have cloned cDNAs encoding chloroplast and cytosolic GAPDH from the early-branching photosynthetic protist Euglena gracilis and have determined the structure of its nuclear gene for cytosolic GAPDH. The gene contains four introns which possess unusual secondary structures, do not obey the GT-AG rule, and are flanked by 2- to 3-bp direct repeats. A gene phylogeny for these sequences in the context of eubacterial homologues indicates that euglenozoa, like higher eukaryotes, have obtained their GAPDH genes from eubacteria via endosymbiotic (organelle-to-nucleus) gene transfer. The data further suggest that the early-branching protists Giardia lamblia and Entamoeba histolytica--which lack mitochondria--and portions of the trypanosome lineage have acquired GAPDH genes from eubacterial donors which did not ultimately give rise to contemporary membrane-bound organelles. Evidence that "cryptic" (possibly ephemeral) endosymbioses during evolution may have entailed successful gene transfer is preserved in protist nuclear gene sequences.

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Caracterização anatomopatológica, microbiológica e parasitológica de ratos Wistar (Rattus norvegicus) em diferentes idades

Os ratos Wistar são amplamente empregados como modelo animal na pesquisa biomédica e o controle sanitário dos biotérios é essencial para garantir a qualidade dos experimentos. O objetivo do estudo foi a caracterização do estado sanitário da colônia de ratos Wistar em sistema de criação convencional e para tanto determinar as bactérias, fungos, virus e parasitos, bem como caracterizar as lesões anatomopatológicas do sistema respiratório. Foram utilizados 273 ratos (N), machos (M) e fêmeas (F), das faixas etárias 4, 8, 12, 16 a 20 semanas e entre 12 a 18 meses, para as determinações de peso e condição corpórea (N=273, 140M, 133F); avaliação bacteriológica de orofaringe, mucosa intestinal e lavado traqueobrônquico (N=40, 20M, 20F); determinação de anticorpos para vírus e bactérias (N=20, 10M, 10F); exame parasitológico (N=60, 30M, 30F); identificação molecular de Mycoplasma pulmonis em amostras de pulmão (N=25, 15M, 10F), e caracterização anatomopatológica da cavidade nasal, orofaringe, laringe, traqueia e pulmão (N=106, 53M, 53F). Foram realizadas ainda avaliações microbiológicas das salas dos ratos em três períodos com isolamento de Micrococcus spp., Staphylococcus spp., Bacillus spp., Aspergillus spp. e Penicillium spp. O peso se mostrou homogêneo dentro da faixa etária e gênero, com apenas sete animais magros (2,56%) e nove em sobrepeso (3,30%). Não foram isoladas bactérias patogênicas na orofaringe, mucosa intestinal e lavado traqueobrônquico por cultivo. Mycoplasma pulmonis foi determinado em 72% das amostras pulmonares e em 100% dos soros testados. Em 35% foram detectados anticorpos para Reovirus tipo III e em 100% para bacilos associados ao epitélio respiratório ciliado. Syphacia muris foi diagnosticada em 91,67%, Eimeria spp. em 3,33% e Entamoeba muris em 1,67%. Lesões relacionadas a infecção por agentes exógenos foram observadas em cavidade nasal e na orofaringe, laringe e traqueia a partir da 4 semanas de idade e, em pulmão desde as 12 semanas, com aumento de frequência de ocorrência e do grau de progressão, com o avançar da idade, nos vários segmentos estudados. Concluímos que a caracterização do estado sanitário dos ratos permite conhecer as particularidades do modelo biológico utilizado e compor base de dados para auxiliar no desenho e na interpretação experimental dos pesquisadores, além de garantir uma base para o programa de monitorização sanitária de biotérios em condições similares

Clinical amoebiasis

Bibliography: p. [137]-160.

Utilización del extracto Arrabidaea chica (Mashashte) para el diagnóstico de laboratorio clínico de estructuras morfológicas de microorganismos en Microbiología Médica.

Objetivos del estudio: Encontrar propiedades de la Planta Natural Arrabidae chica para el diagnóstico de laboratorio de estructuras morfológicas de microorganismos en Microbiología Médica. Se procedió en varias fases, la primera fase: preparación de microorganismos, como: Parásitos, Hongos y Bacterias, entre ellos: 1. Protozoos Intestinales: Quistes y Trofozoitos de Amebas, Giardia lamblia, Entamoeba coli, Trichuris trichiura; Strongyloides stercoralis, 2. Micosis: M. canis, M. gypseum, 3. Bacterias: Eschericihia coli, S. aureus, S. Epidermidis.

Estudio Comparativo de Parasitismo Intestinal, realizado en los alumnos de Primero a Tercer Grado de los Centros Escolares Cantón Ojo de Agua y colonia El Cocal del Municipio y departamento de Usulután en el periodo de junio a agosto de 2014

El parasitismo intestinal, representa un problema de salud pública de mucha importancia a nivel mundial, sobre todo en zonas rurales y urbanas de los países en desarrollo, donde un gran número de habitantes viven en hacinamiento con graves problemas sanitarios y ausencia de hábitos higiénicos. Los parásitos en los niños son causa importante de trastornos en el desarrollo físico y mental de los mismos, el mecanismo y vía de contagio varía, la mayoría de los parásitos se adquieren al ingerir agua o alimentos contaminados con sus quistes o huevecillos. No obstante; todas las personas a cualquier edad pueden ser portadores de parásitos. El Objetivo del presente estudio fue comparar el porcentaje de alumnos de primero a tercer grado que presentan parasitismo intestinal en los Centros Escolares Cantón Ojo de Agua y Colonia El Cocal del Municipio y Departamento de Usulután en el periodo de junio a agosto de 2014. Metodología es una investigación de tipo prospectivo, transversal, comparativa, descriptiva y de laboratorio; la investigación incluyó a todos los alumnos de los grados antes mencionados en ambos Centros Escolares, se aplicaron criterios de inclusión y exclusión para establecer la población, además se administró una cédula de entrevista a los responsables de los niños para recopilar la información necesaria acerca de las condiciones de vida, hábitos higiénicos y alimenticios de los niños incluidos en el estudio. Se realizó el examen general de heces para poder observar la presencia de parásitos intestinales. Se utilizó una hoja de reporte de examen general de heces lo cual permitió realizar la tabulación de datos. Resultados: De un total de 83 niños estudiados en ambos Centros Escolares 44 (53.1%) resultaron negativos, 39 (46.9%) resultaron positivos para algún parasito; en el Centro Escolar Cantón Ojo de Agua ubicado en la zona rural 51 alumnos se sometieron al estudio de estos 26 (50.9%) resultaron con parasitismo intestinal, mientras que en el Centro Escolar Colonia Cocal se analizaron 32 muestras de heces de las cuales 13 (40.6%) resultaron con parásitos. De los 39 casos positivos de ambos Centros Escolares, 22 (56.4%) resultaron con un solo tipo de parásito y 17 (43.6%) con multiparasitismo. Los parásitos encontrados con mayor frecuencia fueron: Endolimax nana (51.3%) y Entamoeba histolytica (48.7%), el parasito encontrado con menor frecuencia fue: Iodamoeba butschlii (7.7%). Conclusión: Estadísticamente el porcentaje de parasitismo intestinal de los alumnos del Centro Escolar Cantón Ojo de Agua fue igual que el de los alumnos del Centro Escolar Colonia El Cocal.

Determinación de la frecuencia de infección por helicobacter pylori y parasitosis en preescolares de 2 a 4 años que acuden a los centros de desarrollo infantil del municipio de la ciudad de Cuenca julio, 2015

El presente estudio se enfocó en la determinación de la frecuencia de Helicobacter pylori y parasitosis intestinal en los niños y niñas de 2 a 4 años que asisten a los Centros de Desarrollo Infantil del Municipio de la ciudad de Cuenca. Las muestras de heces fueron receptadas en los Centros de Desarrollo Infantil con la colaboración de los padres de familia y los educadores. Los exámenes coprológicos se llevaron a cabo en el Laboratorio Clínico del Centro de Diagnóstico de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Cuenca cumpliendo normas de control de calidad y bioseguridad. La identificación de los parásitos intestinales se realizó a través del examen coproparasitario en fresco y la técnica inmunocromatográfica se empleó para la determinación cualitativa de Helicobacter pylori. Los resultados del estudio evidenciaron una prevalencia de 26,1% de infección por Helicobacter pylori y de 19,3% para parasitosis intestinal en los Centros. En las parasitosis infantiles, el quiste de Entamoeba histolytica se identificó como el agente etiológico en el 58,8% de los casos.