Otimização de protocolo para análise de AFLP em Lolium multiflorum Lam.

ESTABELECIMENTO DE METODOLOGIA PARA ANÁLISE MOLECULAR DE AZEVÉM ANUAL COM MARCADORES AFLP. O uso de marcadores moleculares no manejo de bancos de germoplasma tem sido cada vez mais expressivo. Entre os diferentes tipos de marcadores moleculares, o AFLP, Amplified Fragment Length Polymorphism, apresenta algumas vantagens para uso na caracterização de recursos genéticos, como a detecção de grande número de bandas informativas por reação, com ampla cobertura do genoma e considerável reprodutibilidade, além de não necessitar de dados de seqüenciamento prévio da espécie para a construção de primers. Embora a análise de AFLP seja freqüentemente utilizada em estudos de variabilidade genética em diferentes espécies, o uso da técnica em Lolium multiflorum ainda é incipiente. Com a finalidade de estabelecer um protocolo para o emprego da técnica de AFLP em azevém anual foi conduzido este trabalho. Foram avaliadas as concentrações iniciais de DNA genômico de 100 e 250 ng, a digestão do DNA com 1,25 e 1U das enzimas EcoRI e MSe, e os respectivos tempos de reação de digestão: 3, 6 e 12 horas. Também foram avaliadas quatro concentrações da solução resultante da ligação dos adaptadores: solução sem diluição; diluída 1:5; 1:10 e 1:20 e duas diluições após a reação de pré-amplificação, de 1:25 e 1:50. Como resultado, foi estabelecido como melhor protocolo, no qual foi obtido um maior número e qualidade de fragmentos, o que utiliza a concentração inicial de DNA genômico de 100 ng, num volume final de reação de digestão 10 ?l, com 1U de cada enzima EcoRI e MseI e tempo de reação de 12h a 37°C, com reação de ligação de adaptadores realizada com a adição da solução de ligação de adaptadores, do Kit AFLP? Analysis System I (InvitroGen Life Technologies, Carlsbad, Calif., USA), e 0,4 U de T4 DNA ligase em um volume final de 10?l, por 2h a 20°C. Após a ligação de adaptadores a diluição deverá ser de 1:5. A reação de pré-amplificação deverá ocorrer a partir de 1?l desta última solução (diluída 1:5), 1,0 X PCR buffer com Mg Plus [Tris-HCl (pH 7.6) 20 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM], BSA 0,003% e 1 U de Taq DNA polimerase, completando com mix de pré-amplificação do Kit AFLP? Analysis System I até alcançar o volume final de 11?l. O produto da pré-amplificação deverá ser diluído 1:25 antes de ser procedida à amplificação seletiva, a qual deve ser realizada utilizando 2,5 ?l da solução de DNA pré-amplificado (diluído 1:25), 1 X PCR buffer com Mg Plus [Tris-HCl (pH 8,4) 20 mM, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM], BSA (0,003%), 1 U de Taq DNA polimerase, 10 ng de primer EcoRI, 1,5 ng de primer MseI, 0,4mM de DNTps e H2O MilliQ? até completar o volume final de 10?l. Com este protocolo uma única combinação de primers permitiu identificar 58 bandas polimórficas na análise de duas populações de azevém anual.

Resumos...

Custo do controle químico da ferrugem asiática da soja na safra 2006/07; Estimativa do custo de produção de semente de soja no Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba safra 2006/07; Programa de difusão de cultivares de soja desenvolvida pela Embrapa Soja, para os Estados do Paraná, de Santa Catarina, do Mato Grosso do Sul e de São Paulo - safra 06/07; Índices fisiológicos de cultivares de soja em diferentes épocas de semeadura no oeste da Bahia; Acúmulo de matéria seca e área foliar de cultivares de soja em diferentes épocas de semeadura no oeste da Bahia; Resistência à penetração, densidade e umidade de um latossolo vermelho distroférrico sob diferentes sistemas de produção; Monitoramento de insetos-pragas na cultura da soja, no Estado do Tocantins; Efeito de diferentes práticas de controle de pragas sobre a população de lagartas, percevejos e seus inimigos naturais, na cultura da soja; Avaliação de inseticidas e enxofre no controle de percevejo castanho e de corós, na cultura da soja; Diferentes inseticidas e doses no controle da lagarta falsa medideira (Pseudoplusia includens Walker, 1857), na cultura da soja; Eficiência de inseticidas/acaricidas no controle do ácaro verde, Mononychellus planki, na cultura da soja; Seletividade do inseticida flubendiamide e dos inseticidas spirotetramat & imidacloprid m mistura de pronto uso sobre artropodos predadores naturalmente encontrados no agroecossistema soja; Principais problemas fitossanitários detectados na cultura da soja no nordeste paraense - safra 2006/2007; Quais as causas da soja louca? Avaliação da reação de genótipos de soja ao nematóide das lesões radiculares; Avaliação da reação de espécies vegetais ao nematóide das lesões radiculares; Efeito do tratamento de sementes + aplicação foliar de fungicidas no manejo da ferrugem asiática da soja; Eficiência de fluquinconazole, via tratamento de sementes, no controle da ferrugem asiática da soja; Tratamento de sementes de soja com fluquinconazole associado à pulverização de fungicidas visando o controle da ferrugem asiática e da mancha parda; Aplicação aérea de tebuconazole + benzimidazol para o controle da ferrugem asiática da soja; Eficiência de triazóis nos ensaios em rede para controle da ferrugem asiática da soja (Phakopsora pachyrhizi); Eficiência de estrobilurinas, misturas de triazóis e estrobilurinas e triazóis e benzimidazóis nos ensaios em rede para controle da ferrugem asiática da soja (Phakopsora pachyrhizi); Resultados sumarizados dos ensaios em rede para controle da mela da soja (Rhizoctonia solani AG1); BRS Charrua RR: cultivar de soja indicada para o sul do Estado de Mato Grosso do Sul; ? BRS Pampa RR: cultivar de soja indicada para o sul do Estado de Mato Grosso do Sul; BRS 232: extensão de indicação para a região sul do Estado de Mato Grosso do Sul; BRS 243RR: extensão de indicação para a região sul do Estado de Mato Grosso do Sul; BRS 245RR: extensão de indicação para a região sul do Estado de Mato Grosso do Sul; BRS 246RR: extensão de indicação para a região sul do Estado de Mato Grosso do Sul; Recomendação da cultivar de soja CD 224 para os Estados do Paraná, São Paulo e região sul do Estado do Mato Grosso do Sul; Recomendação da cultivar de soja CD 225RR para o Estado do Paraná ; Recomendação da cultivar de soja CD 226RR para o Estado do Paraná e região sul do Estado do Mato Grosso do Sul; Recomendação da cultivar de soja CD 227 para os Estados de Goiás e Minas Gerais e região sul e norte do Estado do Mato Grosso; Extensão da cultivar de soja CD 219RR para o Estado da Bahia; Cultivar de soja BRSMG 810C; Cultivar de soja BRSMG 850GRR: indicação para o Estado de Goiás e Distrito Federal; Cultivar de soja BRSMG 750SRR: indicação para os estados de São Paulo, Goiás e Distrito Federal; Análise discriminante na caracterização de novos descritores em soja [Glycine max (L.) Merrill]; Influência do tamanho de semente na caracterização de descritores adicionais de soja; ? Estimativa de repetibilidade da avaliação de resistência ao oídio em genótipos de soja adaptados ao Estado de Goiás; Indicação da cultivar de soja BRSGO Graciosa para os Estados de Goiás e Distrito Federal; Reação de genótipos de soja à síndrome da morte súbita, causada pelo fungo Fusarium solani f. sp. Glicynes; Reação de genótipos de soja à ferrugem asiática, causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow; Indicação da cultivar de soja EMGOPA 302 RR,para o Estado de Goiás e Distrito Federal; Indicação da cultivar de soja emgopa 315 RR, para o Estado de Goiás e Distrito Federal; Indicação da cultivar de soja EMGOPA 316 RR, para o Estado de Goiás e Distrito Federal; GT - 8901: nova cultivar de soja para os Estados de Goiás e Distrito Federal; GT - 8901: nova cultivar de soja para as regiões norte e nordeste; Comportamento de cultivares de soja sob condições de várzea irrigada no sul do Estado do Tocantins, entressafra 2005; Extensão de indicação da cultivar BRS Barreiras para o Piauí, sul do Maranhão e norte de Tocantins; Cultivar de soja BRS 270RR: descrição, comportamento e indicação para cultivo; Cultivar de soja BRS 271RR: descrição, comportamento e indicação para cultivo; Extensão de indicação da cultivar BRS 252 para cultivo no cerrado de Roraima; Extensão de indicação da cultivar BRS Carnaúba para cultivo em cerrado de Roraima; Produtividade e qualidade de sementes de genótipos de soja hortaliça em cerrado de Roraima 2006/2007; Influência da adubação potássica e umidade do solo na produção da soja; Resposta da cultura de soja a diferentes níveis de adubação potássica em cobertura; Teores de potássio em amostras foliares de soja obtidos por digestão nitroperclórica e por extração com água; Nível crítico de manganês trocável no solo, para soja em latossolo vermelho de textura argilosa do Mato Grosso; Nível crítico de manganês trocável no solo, para a soja, em latossolo vermelho de textura argilosa do Maranhão; Nível crítico de manganês trocável no solo, para a soja em latos-solo vermelho amarelo de textura média do Maranhão; Aplicação foliar de soluções de ácidos húmicos sobre a produ-tividade de soja; Avaliação de extratores de boro em solos cultivados com soja; Fontes e doses de molibdênio para enriquecimento de sementes e seus efeitos no rendimento da soja; Monitoramento de plantas daninhas na cultura da soja no Estado do Tocantins; Manejo de plantas daninhas em cultivos orgânicos de soja por meio de descarga elétrica; Controle de plantas daninhas em soja orgânica com uso da roçadeira articulada; Estudo da interação entre glifosato, micronutrientes e fungicida em soja RR; BRS Juliana RR - variação da cor do hilo de sementes de soja; Desperdícios na colheita mecânica da soja no Paraná e no Brasil na safra 2006/07; Efeito da antecipação e do retardamento de colheita na qualidade fisiológica e nos teores de óleo e proteina das sementes de soja cultivar Valiosa RR; Antecipação de colheita de sementes de soja com dessecação em pré-colheita; Efeito da aplicação de glyphosate como dessecante em pré-colheita sobre a qualidade de semente de soja; Aplicação de glyphosate como dessecante em pré-colheita em semente de soja: efeito sobre a produtividade; Suscetibilidade de genótipos de soja à produção de semente esverdeada, produzidos em condições de estresses hídrico e térmico; Qualidade e produtividade de sementes de soja em função de doses de potássio produzidas em cerrado de Roraima em 2006; Qualidade e produtividade de sementes de soja produzidas em cerrado de Roraima, em plantio direto sobre braquiária; Desempenho fisiológico de semente de soja em função do volume de calda no seu tratamento.

Decomposição da matéria orgânica de compostos de lixo urbano e posterior preparo de extratos nítrico-perclórico.

Pré-digestão de amostras de compostos. Desempenhos dos Pré tratamentos de Amostras: Peróxido de Hidrogênio ( H2O2) Versus aquecimento em mufla a 550ºC. Digestão Nítrico-perclórica de compostos de lixo urbano. Resultados analíticos de compostos de lixo usando-se a técnica de eliminação da fração orgânica e a digestão Nítrico-perclórica propostas. Metodologia Padronizada por Silva (1999), Recomendada pela Embrapa. Pré-digestão da amostra de composto utilizando-se H²O² a 30%

A Doença Celíaca

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Branqueamento Dentário

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Autofagia

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Nanopartículas lipídicas na promoção da absorção oral de fármacos

Projeto de Pós-Graduação/Dissertação apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

Study of oxidation and non-enzymatic glycosylation posttranslational modifications using a proteomic approach

A glicosilação não-enzimática e o stress oxidativo representam dois processos importantes visto desempenharem um papel importante no que respeita às complicações de vários processos patofisiológicos. No presente, a associação entre a glicosilação não-enzimática e a oxidação de proteínas é reconhecida como sendo um dos principais responsáveis pela acumulação de proteínas não-funcionais que, por sua vez, promove uma contínua sensibilização para um aumento do stress oxidativo ao nível celular. Embora esteja disponível bastante informação no que respeita aos dois processos e suas consequências ao nível estrutural e funcional, permanecem questões por esclarecer acerca do que se desenvolve ao nível molecular. Com o objectivo de contribuir para uma melhor compreensão da relação entre a glicosilação não-enzimática e a oxidação, proteínas modelo (albumina, insulina e histonas H2B e H1) foram submetidas a sistemas in vitro de glicosilação não-enzimática e oxidação em condições controladas e durante um período de tempo específico. A identificação dos locais de glicosilação e oxidação foi realizada através de uma abordagem proteómica, na qual após digestão enzimática se procedeu à análise por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa tandem (MALDI-TOF/TOF). Esta abordagem permitiu a obtenção de elevadas taxas de cobertura das sequências proteicas, permitindo a identificação dos locais preferenciais de glicosilação e oxidação nas diferentes proteínas estudadas. Como esperado, os resíduos de lisina foram os preferencialmente glicosilados. No que respeita à oxidação, além das modificações envolvendo hidroxilações e adições de oxigénio, foram identificadas deamidações, carbamilações e conversões oxidativas específicas de vários aminoácidos. No geral, os resíduos mais afectados pela oxidação foram os resíduos de cisteína, metionina, triptofano, tirosina, prolina, lisina e fenilalanina. Ao longo do período de tempo estudado, os resultados indicaram que a oxidação teve início em zonas expostas da proteína e/ou localizadas na vizinhança de resíduos de cisteína e metionina, ao invés de exibir um comportamente aleatório, ocorrendo de uma forma nãolinear por sua vez dependente da estabilidade conformacional da proteína. O estudo ao longo do tempo mostrou igualmente que, no caso das proteínas préglicosiladas, a oxidação das mesmas ocorreu de forma mais rápida e acentuada, sugerindo que as alterações estruturais induzidas pela glicosilação promovem um estado pro-oxidativo. No caso das proteínas pré-glicosiladas e oxidadas, foi identificado um maior número de modificações oxidativas assim como de resíduos modificados na vizinhança de resíduos glicosilados. Com esta abordagem é realizada uma importante contribuição na investigação das consequências do dano ‘glico-oxidativo’ em proteínas ao nível molecular através da combinação da espectrometria de massa e da bioinformática.

Trophic plasticity in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis

Coral reefs are of utmost ecological and economical importance but are currently in global decline due to climate change and anthropogenic disturbances. Corals, as well as other cnidarian species, live in symbiosis with photosynthetic dinoflagellates of the genus Symbiodinium. This relationship provides the cnidarian host with alternative metabolic pathways, as the symbionts translocate photosynthetic carbon to the animal. Besides this autotrophic nutrition mode, symbiotic cnidarians also take up organic matter from the environment (heterotrophy). The nutritional balance between auto- and heterotrophy is critical for the functioning, fitness and resilience of the cnidariandinoflagellate symbiosis. New methodological approaches were developed to better understand the role of auto- and heterotrophy in the ecophysiology of cnidarians associated with Symbiodinium, and the ecological implications of this trophic plasticity. Specifically, the new approaches were developed to assess photophysiology, biomass production of the model organism Aiptasia sp. and molecular tools to investigate heterotrophy in the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Using these approaches, we were able to non-invasively assess the photophysiological spatial heterogeneity of symbiotic cnidarians and identify spatial patterns between chlorophyll fluorescence and relative content of chlorophyll a and green-fluorescent proteins. Optimal culture conditions to maximize the biomass production of Aiptasia pallida were identified, as well as their implications on the fatty acid composition of the anemones. Molecular trophic markers were used to determine prey digestion times in symbiotic cnidarians, which vary between 1-3 days depending on prey species, predator species and the feeding history of the predator. This method was also used to demonstrate that microalgae is a potential food source for symbiotic corals. By using a stable isotope approach to assess the trophic ecology of the facultative symbiotic Oculina arbuscula in situ, it was possible to demonstrate the importance of pico- and nanoplanktonic organisms, particularly autotrophic, in the nutrition of symbiotic corals. Finally, we showed the effects of functional diversity of Symbiodinium on the nutritional plasticity of the cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Symbiont identity defines this plasticity through its individual metabolic requirements, capacity to fix carbon, quantity of translocated carbon and the host’s capacity to feed and digest prey.

Characterisation of ZG16p, a unique mammalian lectin from pancreatic zymogen granules

The mechanisms of secretory granule biogenesis and regulated secretion of digestive enzymes in pancreatic acinar cells are still not well understood. To shed light on these processes, which are of biological and clinical importance (e.g., pancreatitis), a better molecular understanding of the components of the granule membrane, their functions and interactions is required. The application of proteomics has largely contributed to the identification of novel zymogen granule (ZG) proteins but was not yet accompanied by a better characterization of their functions. In this study we aimed at a) isolation and identification of novel membrane-associated ZG proteins; b) characterization of the biochemical properties and function of the secretory lectin ZG16p, a membrane-associated protein; c) exploring the potential of ZG16p as a new tool to label the endolysosomal compartment. First, we have performed a suborganellar proteomics approach by combining protein analysis by 2D-PAGE and identification by mass spectrometry, which has led to the identification of novel peripheral ZGM proteins with proteoglycan-binding properties (e.g., chymase, PpiB). Then, we have unveiled new molecular properties and (multiple) functions of the secretory lectin ZG16p. ZG16p is a unique mammalian lectin with glycan and proteoglycan binding properties. Here, I revealed for the first time that ZG16p is highly protease resistant by developing an enterokinase-digestion assay. In addition I revealed that ZG16p binds to a high molecular weight complex at the ZGM (which is also protease resistant) and forms highly stable dimers. In light of these findings I suggest that ZG16p is a key component of a predicted submembranous granule matrix attached to the luminal side of the ZGM that fulfils important functions during sorting and packaging of zymogens. ZG16p, may act as a linker between the matrix and aggregated zymogens due to dimer formation. Furthermore, ZG16p protease resistance might be of higher importance after secretion since it is known that ZG16p binds to pathogenic fungi in the gut. I have further investigated the role of ZG16p binding motifs in its targeting to ZG in AR42J cells, a pancreatic model system. Point mutations of the glycan and the proteoglycan binding motifs did not inhibit the targeting of ZG16p to ZG in AR42J cells. I have also demonstrated that when ZG16p is present in the cytoplasm it interacts with and modulates the endo-lysosomal compartment. Since it is known that impaired autophagy due to lysosomal malfunction is involved in the course of pancreatitis, a potential role of ZG16p in pancreatitis is discussed.

Development of a Piggybac based direct reprogramming system for derivation of integration free induced pluripotent stem cells

Induced pluripotent stem cells (iPSc) have great potential for applications in regenerative medicine, disease modeling and basic research. Several methods have been developed for their derivation. The original method of Takahashi and Yamanaka involved the use of retroviral vectors which result in insertional mutagenesis, presence in the genome of potential oncogenes and effects of residual transgene expression on differentiation bias of each particular iPSc line. Other methods have been developed, using different viral vectors (adenovirus and Sendai virus), transient plasmid transfection, mRNA transduction, protein transduction and use of small molecules. However, these methods suffer from low efficiencies; can be extremely labor intensive, or both. An additional method makes use of the piggybac transposon, which has the advantage of inserting its payload into the host genome and being perfectly excised upon re-expression of the transposon transposase. Briefly, a policistronic cassette expressing Oct4, Sox2, Klf4 and C-Myc flanked by piggybac terminal repeats is delivered to the cells along with a plasmid transiently expressing piggybac transposase. Once reprogramming occurs, the cells are re-transfected with transposase and subclones free of tranposon integrations screened for. The procedure is therefore very labor intensive, requiring multiple manipulations and successive rounds of cloning and screening. The original method for reprogramming with the the PiggyBac transposon was created by Woltjen et al in 2009 (schematized here) and describes a process with which it is possible to obtain insert-free iPSc. Insert-free iPSc enables the establishment of better cellular models of iPS and adds a new level of security to the use of these cells in regenerative medicine. Due to the fact that it was based on several low efficiency steps, the overall efficiency of the method is very low (<1%). Moreover, the stochastic transfection, integration, excision and the inexistence of an active way of selection leaves this method in need of extensive characterization and screening of the final clones. In this work we aime to develop a non-integrative iPSc derivation system in which integration and excision of the transgenes can be controlled by simple media manipulations, avoiding labor intensive and potentially mutagenic procedures. To reach our goal we developed a two vector system which is simultaneously delivered to original population of fibroblasts. The first vector, Remo I, carries the reprogramming cassette and GFP under the regulation of a constitutive promoter (CAG). The second vector, Eneas, carries the piggybac transposase associated with an estrogen receptor fragment (ERT2), regulated in a TET-OFF fashion, and its equivalent reverse trans-activator associated with a positive-negative selection cassette under a constitutive promoter. We tested its functionality in HEK 293T cells. The protocol is divided in two the following steps: 1) Obtaining acceptable transfection efficiency into human fibroblasts. 2) Testing the functionality of the construct 3) Determining the ideal concentration of DOX for repressing mPB-ERT2 expression 4) Determining the ideal concentration of TM for transposition into the genome 5) Determining the ideal Windows of no DOX/TM pulse for transposition into the genome 6) 3, 4 and 5) for transposition out of the genome 7) Determination of the ideal concentration of GCV for negative selection We successfully demonstrated that ENEAS behaved as expected in terms of DOX regulation of the expression of mPB-ERT2. We also demonstrated that by delivering the plasmid into 293T HEK cells and manipulating the levels of DOX and TM in the medium, we could obtain puromycin resistant lines. The number of puromycin resistant colonies obtained was significantly higher when DOX as absent, suggesting that the colonies resulted from transposition events. Presence of TM added an extra layer of regulation, albeit weaker. Our PCR analysis, while not a clean as would be desired, suggested that transposition was indeed occurring, although a background level of random integration could not be ruled out. Finally, our attempt to determine whether we could use GVC to select clones that had successfully mobilized PB out of the genome was unsuccessful. Unexpectedly, 293T HEK cells that had been transfected with ENEAS and selected for puromycin resistance were insensitive to GCV.

Screening of process conditions for the production of biogas from diluted organic waste streams using microreactors

Dissertação de Mestrado, Engenharia Biológica, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015

Peroxide-based hybrid and prodrug antimalarials to deliver cysteine protease inhibitors into the parasitic food vacuole

Tese de doutoramento, Farmácia (Química Farmacêutica e Terapêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2014

Malaria and tuberculosis co-infection:role for hemozoin immunosuppression?

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Microbiologia e Parasitologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014

O Comportamento de consumo de Vinho do Porto dos portugueses – recomendações para o aumento da procura interna

Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Contabilidade e Administração do Porto para a obtenção do grau de Mestre em Marketing Digital, sob orientação de Doutor António Correia de Barros