Nicked-site substrates for a serine recombinase reveal enzyme–DNA communications and an essential tethering role of covalent enzyme–DNA linkages

To analyse the mechanism and kinetics of DNA strand cleavages catalysed by the serine recombinase Tn3 resolvase, we made modified recombination sites with a single-strand nick in one of the two DNA strands. Resolvase acting on these sites cleaves the intact strand very rapidly, giving an abnormal half-site product which accumulates. We propose that these reactions mimic second-strand cleavage of an unmodified site. Cleavage occurs in a synapse of two sites, held together by a resolvase tetramer; cleavage at one site stimulates cleavage at the partner site. After cleavage of a nicked-site substrate, the half-site that is not covalently linked to a resolvase subunit dissociates rapidly from the synapse, destabilizing the entire complex. The covalent resolvase–DNA linkages in the natural reaction intermediate thus perform an essential DNA-tethering function. Chemical modifications of a nicked-site substrate at the positions of the scissile phosphodiesters result in abolition or inhibition of resolvase-mediated cleavage and effects on resolvase binding and synapsis, providing insight into the serine recombinase catalytic mechanism and how resolvase interacts with the substrate DNA.

Demanda, oferta e perspectiva do ensino médio na região da 7. CRE : Passo Fundo-RS

Estudo de natureza descritiva, analítica e interpretativa de elementos quantitativos e qualitativos, com finalidade de compreender o processo histórico-político da Educação e do Ensino Médio e de apresentar um quadro conjuntural de demanda e oferta da etapa final da Educação Básica no âmbito da 7ª Coordenadoria Regional de Educação do rio Grande do Sul, Brasil, com sede em Passo Fundo, a no período 1987-1999. A região geo-educacional abrange 32 municípios, sobre os quais foram compilados dados estatísticos relativos a escolaridade da população, matrículas, aprovação X reprovação e evasão escolar, por série do Ensino Médio, inclusive com análises comparativas e de cohortes. Adicionalmente, no Volume II, são apresentadas tabulações por unidade escolar, segundo o município. Como contextualização, resenha-se a história da educação escolar brasileira, concentrando a atenção no Ensino Médio, da época da colonização até a atualidade. A seguir, uma leitura do atual ordenamento constitucional e legal nacional, destacando os artigos 35 e 36 da Lei de Diretrizes e Bases da Educação Nacional, a Lei nº 9394/96, embasa a problematização central da dissertação, que é o direito à Educação Básica, que gera progressiva, mas ainda não plenamente atendida demanda de Ensino Médio. Além do exame dos dados estatísticos, trata-se da reforma do Ensino Médio proposta no país em 1998, cujas diretrizes redefinem objetivos e organização curricular (Resolução CEB/CNE 03/98). Sobre esta, sem pretender dar conta da amplitude e da profundidade da matéria, a autora posiciona-se com o olhar de quem está do lado de dentro da escola média, vivenciando o cotidiano nas unidades escolares, em parte compreendendo a necessidade de mudanças, porém conhecendo as limitações institucionais Na aproximação do objeto geo-educacional, faz-se a contextualização histórica da educação escolar no estado do Rio Grande do Sul, para chamar atenção aos condicionantes culturais e políticos que levam à atual configuração de direitos restritos à Educação, na ambigüidade de deveres do Estado federativo. Assim, situa-se que a expansão das oportunidades de escolarização, com a criação de novas escolas e do Ensino Médio, é processo político e burocrático complexo, em que não basta a óbvia evidência de população sem acesso progressivo aos níveis mais elevados de ensinos para que sejam tomadas as providências adequadas em termos de localização e infra-estrutura da escola ou de recursos humanos e pedagógicos de acordo com as normas vigentes. As solicitações da comunidade e os encaminhamentos aos órgãos competentes, na estrutura centralizada, encontram sucessivas negativas e atendimentos com autorizações sob condições precárias, como ilustram dados do período e região estudada. A análise principal, sobre os dados estatísticos dos municípios da região da 7ª CRE, subdivide as escolas de Ensino Médio segundo as responsabilidades de manutenção e administração: as escolas públicas, que são todas estaduais, à exceção de uma Escola Agrotécnica Federal (dados de 1987 a 2000); e as escolas privadas, de diversas mantenedoras. Para estimar a demanda à 1ª série do Ensino Médio são também considerados os concluintes do Ensino Fundamental; as matrículas do Ensino Médio são tabuladas por série e segundo alunos evadidos, aprovados, repetentes, novos e. Há uma síntese por município, referente a cada um dos indicadores mencionados O Capítulo V, oferece uma aproximação ainda mais detalhada à realidade, com dados de cada escola estadual e privada do município de Passo Fundo, o pólo da região. Nas considerações finais, relatam-se os principais resultados encontrados. Em síntese, no período e na região estudada, os dados indicam que a matrícula do Ensino Médio expandiu-se, a evasão diminuiu e o aproveitamento escolar parece melhorar; mas, paradoxalmente, o número de alunos concluintes do ensino Médio diminuiu. Por isso, cabe destacar à sociedade e às autoridades educacionais que, embora a evasão tenha cedido e o aproveitamento alcançado índices mais positivos, ainda há muita atenção a ser dispensada às escolas, no sentido de mudar o quadro de evasão e aproveitamento, bem como de incluir uma grande parcela da população, em todos os municípios da região que, ainda não tem acesso ao Ensino Médio de Passo Fundo-RS.

Escala de coping religioso-espiritual (escala CRE) : tradução, adaptação e validação da escala rcope, abordando relações com saúde e qualidade de vida

OBJETIVOS: A importância do coping religioso espiritual (CRE) nas áreas da saúde e qualidade de vida (QV), e a falta de instrumentos brasileiros para avalia-lo são apontadas pela literatura científica. Este estudo objetivou realizar a versão brasileira da RCOPE Scale, gerando a Escala de Coping Religioso Espiritual (Escala CRE), e examinar a relação entre CRE, saúde e QV. MÉTODO: A primeira fase deste estudo compreendeu: tradução por especialistas da RCOPE, adaptação à cultura brasileira, teste piloto com 50 estudantes de nível médio e superior. A segunda abrangeu teste de campo e processo de validação. Os 616 participantes [65% mulheres, 13-DQRV p=18,44)], foram acessados em um dos seguintes locais que freqüentavam: instituições religiosas ou grupos espirituais (74,4%), universidades (13,5%), clínicas para tratamento de saúde (9,1%) e Web Mail (2,9%). Eles completaram vários instrumentos: Consentimento Livre/Esclarecido, Questionário Geral (questões demográficas, socioeconômicas, religiosas, de saúde), Escala CRE, Escala de Atitude Religiosa e WHOQOL-bref. RESULTADOS: Análises fatoriais geraram uma Escala CRE com duas dimensões: CRE Positivo (CREP) (8 fatores, 66 itens) e CRE Negativo (CREN) (4 fatores, 21 itens). Foram criados quatro índices principais para avaliar os respondentes: as médias CREP e CREN, os escores de CRE TOTAL e Razão CREN/CREP. A Escala CRE demonstrou validade de construto, critério, conteúdo e bons níveis de fidedignidade. Testes Qui-quadrado para Classificação Subjetiva de Saúde (7categorias) mostraram problemas de saúde (PS) físicos relacionados a altos escores de CRE TOTAL e baixos de Razão CREN/CREP; PS emocionais, acrescidos ou não de PS físicos, mostraram resultado inverso. Ainda, QV e CRE TOTAL estiveram positiva e significativamente correlacionados. O CREN esteve negativamente correlacionado à QV em grau maior do que o CREP esteve positivamente correlacionado com QV. Usando Testes t de Student, aqueles que tiveram altos escores de CRE TOTAL mostraram maiores níveis de QV em todos os domínios do WHOQOL-bref, além de maior Classificação Objetiva de Saúde (Likert 5-pontos). Ademais, aqueles que tiveram altos níveis de QV demonstraram maior uso de CREP e menor de CREN. CONCLUSÕES: A Escala CRE é válida e fidedigna, permite aplicação clínica e em pesquisas em locais para tratamento de saúde públicos ou privados. PS físicos podem ser motivadores e educadores do uso do CRE. PS emocionais podem dificultar um melhor uso do CRE, sugerindo que intervenções psicológicas poderiam facilitar o processo. Além disso, CRE e QV são construtos correlacionados. Uma proporção mínima de 2CREP:1CREN (Razão CREN/CREP menor/igual 0,5) foi proposta para se obter um efeito benéfico geral do CRE na QV. Evidências sugerem que intervenções focadas no processo de CRE poderiam ser benéficas e efetivas para agentes de saúde pública pelo seu potencial de reduzir custos de intervenções e pelo seu impacto significante na saúde e QV da população. Os próximos passos seriam: utilização de metodologias experimentais longitudinais para melhor avaliar os efeitos do CRE na saúde e na QV, elaboração de uma Escala CRE Abreviada, investigação aprofundada da influência da variável idade na relação CRE-Saúde e testes de proporção e causais, para verificar a direção da correlação, entre CRE e QV.

Redes bayesianas aplicadas à modelagem de fraudes em cartão de crédito

Modelos para detecção de fraude são utilizados para identificar se uma transação é legítima ou fraudulenta com base em informações cadastrais e transacionais. A técnica proposta no estudo apresentado, nesta dissertação, consiste na de Redes Bayesianas (RB); seus resultados foram comparados à técnica de Regressão Logística (RL), amplamente utilizada pelo mercado. As Redes Bayesianas avaliadas foram os classificadores bayesianos, com a estrutura Naive Bayes. As estruturas das redes bayesianas foram obtidas a partir de dados reais, fornecidos por uma instituição financeira. A base de dados foi separada em amostras de desenvolvimento e validação por cross validation com dez partições. Naive Bayes foram os classificadores escolhidos devido à simplicidade e a sua eficiência. O desempenho do modelo foi avaliado levando-se em conta a matriz de confusão e a área abaixo da curva ROC. As análises dos modelos revelaram desempenho, levemente, superior da regressão logística quando comparado aos classificadores bayesianos. A regressão logística foi escolhida como modelo mais adequado por ter apresentado melhor desempenho na previsão das operações fraudulentas, em relação à matriz de confusão. Baseada na área abaixo da curva ROC, a regressão logística demonstrou maior habilidade em discriminar as operações que estão sendo classificadas corretamente, daquelas que não estão.

Regulation of glycogen metabolism by the CRE-1, RCO-1 and RCM-1 proteins in Neurospora crassa. The role of CRE-1 as the central transcriptional regulator

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Generierung eines BAC-transgenen Mausstamms zur Analyse von Melanomen

Da Tumorerkrankungen ein enormes Gesundheitsproblem in der westlichen Welt darstellen, wird eine Vielzahl neuer Behandlungsstrategien entwickelt. Neuartige Tumor-Therapeutika werden jedoch üblicherweise zunächst an Tiermodellen evaluiert, bevor sie am Menschen angewandt werden.rnIn der vorliegenden Arbeit wurde ein BAC-transgenes Mausmodell generiert, welches als autochthones Melanommodell zur Anwendung kommen sollte.rnZunächst wurde dafür ein DNA-Konstrukt erzeugt. Dieses enthält die Melanom-Onkogene BrafV600E, Cdk4R24C und Mitf deren Expression durch die Tamoxifen-induzierbare Rekombinase CreERT2 kontrollierbar sein sollte. Die Verwendung des Tyrosinasepromoters sollte die melanozytenspezifische Expression der eingebrachten Gene gewährleisten. Ein weiterer Bestandteil des Konstrukts ist ein Luziferase-Gen, welches die Lokalisierung Onkogen-exprimierender Zellen durch in vivo-Biolumineszenz-Imaging erlaubt, da die Onkogen- und Luziferase-Expression durch 2A-Sequenzen gekoppelt sind.rnVor der Generierung der transgenen Tiere sollten in vitro Analysen die Funktionalität des Konstruktteils, bestehend aus den Onkogenen und der Luziferase, klären. Zu diesem Zweck wurde die Zelllinie C22 mit einem Expressionsvektor transfiziert, welcher den genannten Konstruktteil enthielt. Es konnte ein Anstieg der Braf- und Cdk4-Expression auf Protein Ebene, das Vorhandensein von Luziferase-Aktivität und die Aktivierung des MAP-Kinase-Signalwegs nachgewiesen werden. Die Funktionalität des untersuchten Konstruktteils war damit nahegelegt und die Generierung der transgenen Tiere wurde fortgesetzt.rnDie Pronukeus-Injektion resultierte schließlich in 3 Founder-Tieren, die mittels PCR und Southern Blot identifiziert wurden und die Bezeichnung „B6 tg Tyr iOnkogene“ (TyriOn) erhielten. Durch Verkreuzen der Founder-Tiere mit C57BL/6 Mäusen wurden im weiteren Verlauf 3 Linien erzeugt. Bei in vivo Biolumineszenz-Messungen zeigten Tiere der Linie D einen gewissen Grad an Hintergrund-Luziferase-Aktivität, die jedoch durch Tamoxifen-Injektionen verstärkt werden konnte. In den Folgegenerationen ging diese Tamoxifen-induzierte Verstärkung der Luziferase-Aktivität teilweise verloren. Es wurde die Vermutung angestellt, dass funktionelle und nicht-funktionelle Varianten des Transgens an unterschiedlichen Stellen im Genom von Founder D integriert hatten, und sich in den folgenden Generationen auf die Nachkommen verteilten. Die mangelnde Induzierbarkeit betroffener Tiere konnte nicht auf fehlende Integrität der Sequenz „iOnkogene“ in diesen Tieren oder auf nicht-funktionelle loxP-Stellen im Konstrukt zurückgeführt werden.rnTamoxifen-Injektionen führten in TyriOn-D Tieren im Laufe von 15 Monaten nicht zur Entwicklung von Tumoren. Ebenso wenig konnten in TyriOn-D / Cre del Tieren, welche die eingebrachten Onkogene maximal exprimieren sollten, Tumoren detektiert werden. Um zu analysieren, ob die eingebrachten Onkogene die Bildung von Tumoren begünstigen, wurden TyriOn-D Tiere mit dem Melanom-anfälligen Stamm MT/ret verkreuzt. Hierzu konnte im Rahmen dieser Arbeit noch kein Ergebnis erzielt werden. Allerdings konnte in Melanomen von TyriOn-D / MT/ret Tieren Luziferase-Aktivität bei in vivo Biolumineszenz-Messungen und CreERT2 RNA durch RT-PCR detektiert werden.rnTyriOn-D / MT/ret Tiere werden im weiteren Verlauf dieses Projektes nicht nur der Analyse der Melanomentwicklung dienen. Deren Tumore ermöglichen außerdem weitere Untersuchungen bezüglich der Funktionalität des Konstrukts, die teilweise in TyriOn Tieren keine Resultate ergaben.

Nuclear proteins interacting with an AP-1/CRE-like promoter sequence in the human TNF$\alpha$ gene

Monocyte developmental heterogeneity is reflected at the cellular level by differential activation competence, at the molecular level by differential regulation of gene expression. LPS activates monocytes to produce tumor necrosis factor-$\alpha$ (TNF). Events occurring at the molecular level necessary for TNF regulation have not been elucidated, but depend both on activation signals and the maturation state of the cell: Peripheral blood monocytes produce TNF upon LPS stimulation, but only within the first 72 hours of culture. Expression of c-fos is associated with monocytic differentiation and activation; the fos-associated protein, c-jun, is also expressed during monocyte activation. Increased cAMP levels are associated with down regulation of macrophage function, including LPS-induced TNF transcription. Due to these associations, we studied a region of the TNF promoter which resembles the binding sites for both AP-1(fos/jun) and CRE-binding protein (or ATF) in order to identify potential molecular markers defining activation competent populations of monocytic cells.^ Nuclear protein binding studies using extracts from THP-1 monocytic cells stimulated with LPS, which stimulates, or dexamethasone (Dex) or pentoxyfilline (PTX), which inhibit TNF production, respectively, suggest that a low mobility doublet complex may be involved in regulation through this promoter region. PTX or Dex increase binding of these complexes equivalently over untreated cells; approximately two hours after LPS induction, the upper complex is undetectable. The upper complex is composed of ATF2 (CRE-BP1); the lower is a heterodimer of jun/ATF2. LPS induces c-jun and thus may enhance formation of jun-ATF2 complexes. The simultaneous presence of both complexes may reduce the amount of TNF transcription through competitive binding, while a loss of the upper (ATF2) and/or gain of the lower (jun-ATF2) allow increased transcription. AP-1 elements generally transduce signals involving PKC; the CRE mediates a cAMP response, involving PKA. Thus, this element has the potential of receiving signals through divergent signalling pathways. Our findings also suggest that cAMP-induced inhibition of macrophage functions may occur via down regulation of activation-associated genes through competitive binding of particular cAMP-responsive nuclear protein complexes. ^

Field-Applicable Recombinase Polymerase Amplification Assay for Rapid Detection of Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae.

Contagious caprine pleuropneumonia (CCPP) is a highly contagious disease caused by Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae that affects goats in Africa and Asia. Current available methods for the diagnosis of Mycoplasma infection, including cultivation, serological assays, and PCR, are time-consuming and require fully equipped stationary laboratories, which make them incompatible with testing in the resource-poor settings that are most relevant to this disease. We report a rapid, specific, and sensitive assay employing isothermal DNA amplification using recombinase polymerase amplification (RPA) for the detection of M. capricolum subsp. capripneumoniae. We developed the assay using a specific target sequence in M. capricolum subsp. capripneumoniae, as found in the genome sequence of the field strain ILRI181 and the type strain F38 and that was further evidenced in 10 field strains from different geographical regions. Detection limits corresponding to 5 × 10(3) and 5 × 10(4) cells/ml were obtained using genomic DNA and bacterial culture from M. capricolum subsp. capripneumoniae strain ILRI181, while no amplification was obtained from 71 related Mycoplasma isolates or from the Acholeplasma or the Pasteurella isolates, demonstrating a high degree of specificity. The assay produces a fluorescent signal within 15 to 20 min and worked well using pleural fluid obtained directly from CCPP-positive animals without prior DNA extraction. We demonstrate that the diagnosis of CCPP can be achieved, with a short sample preparation time and a simple read-out device that can be powered by a car battery, in <45 min in a simulated field setting.

La implementación del Pro.Cre.Ar en La Plata : El caso de la ordenanza 11094/13

En el año 2012 es lanzado el Programa de Crédito Argentino del Bicentenario para la Vivienda Unica Familiar (Pro.Cre.Ar) una ambiciosa política de viviendas que es, además, una estrategia neokeynesiana destinada a dar impulso a la industria de la construcción y el empleo. Sin embargo el lanzamiento de la línea Construcción comenzó a generar ciertos procesos especulativos en relación al precio del suelo urbano y la construcción en general, que luego se potenciaron y generalizaron con el lanzamiento de la línea Compra de Terreno y construcción, la cual dejó en evidencia la falta de suelo urbano en donde emplazar la demanda financiada. Frente a esto el Estado nacional ensayo distintas respuestas destinadas a frenar los procesos especulativos, como así también lo hicieron -al menos con esa intención inicial- distintos municipios, destinatarios directos de la problemática. En esta tesina estudiaremos el modo en que la Municipalidad de La Plata procesó las demandas urbanísticas surgidas a nivel local como producto de una política de nivel nacional. Para ello nos centraremos en la sanción de la ordenanza 11094/13 -orientada a rezonificar tierra rural en tierra urbana- y en el lugar que en su impulso jugaron los beneficiaros del crédito organizados en diálogo con el gobierno municipal. Nos detendremos específicamente en la vía 2 de esta ordenanza, donde los beneficiarios pueden ellos mismos promover un loteo. Finalmente emplazaremos nuestra temática en el marco de las reformas estatales sucedidas a partir de 1985, su repercusión en el rol de los municipios y su impacto -junto a la globalización- en la estructura urbana, como es el patrón de crecimiento disperso y la tendencia a la segregación

La implementación del Pro.Cre.Ar en La Plata : El caso de la ordenanza 11094/13

En el año 2012 es lanzado el Programa de Crédito Argentino del Bicentenario para la Vivienda Unica Familiar (Pro.Cre.Ar) una ambiciosa política de viviendas que es, además, una estrategia neokeynesiana destinada a dar impulso a la industria de la construcción y el empleo. Sin embargo el lanzamiento de la línea Construcción comenzó a generar ciertos procesos especulativos en relación al precio del suelo urbano y la construcción en general, que luego se potenciaron y generalizaron con el lanzamiento de la línea Compra de Terreno y construcción, la cual dejó en evidencia la falta de suelo urbano en donde emplazar la demanda financiada. Frente a esto el Estado nacional ensayo distintas respuestas destinadas a frenar los procesos especulativos, como así también lo hicieron -al menos con esa intención inicial- distintos municipios, destinatarios directos de la problemática. En esta tesina estudiaremos el modo en que la Municipalidad de La Plata procesó las demandas urbanísticas surgidas a nivel local como producto de una política de nivel nacional. Para ello nos centraremos en la sanción de la ordenanza 11094/13 -orientada a rezonificar tierra rural en tierra urbana- y en el lugar que en su impulso jugaron los beneficiaros del crédito organizados en diálogo con el gobierno municipal. Nos detendremos específicamente en la vía 2 de esta ordenanza, donde los beneficiarios pueden ellos mismos promover un loteo. Finalmente emplazaremos nuestra temática en el marco de las reformas estatales sucedidas a partir de 1985, su repercusión en el rol de los municipios y su impacto -junto a la globalización- en la estructura urbana, como es el patrón de crecimiento disperso y la tendencia a la segregación

La implementación del Pro.Cre.Ar en La Plata : El caso de la ordenanza 11094/13

En el año 2012 es lanzado el Programa de Crédito Argentino del Bicentenario para la Vivienda Unica Familiar (Pro.Cre.Ar) una ambiciosa política de viviendas que es, además, una estrategia neokeynesiana destinada a dar impulso a la industria de la construcción y el empleo. Sin embargo el lanzamiento de la línea Construcción comenzó a generar ciertos procesos especulativos en relación al precio del suelo urbano y la construcción en general, que luego se potenciaron y generalizaron con el lanzamiento de la línea Compra de Terreno y construcción, la cual dejó en evidencia la falta de suelo urbano en donde emplazar la demanda financiada. Frente a esto el Estado nacional ensayo distintas respuestas destinadas a frenar los procesos especulativos, como así también lo hicieron -al menos con esa intención inicial- distintos municipios, destinatarios directos de la problemática. En esta tesina estudiaremos el modo en que la Municipalidad de La Plata procesó las demandas urbanísticas surgidas a nivel local como producto de una política de nivel nacional. Para ello nos centraremos en la sanción de la ordenanza 11094/13 -orientada a rezonificar tierra rural en tierra urbana- y en el lugar que en su impulso jugaron los beneficiaros del crédito organizados en diálogo con el gobierno municipal. Nos detendremos específicamente en la vía 2 de esta ordenanza, donde los beneficiarios pueden ellos mismos promover un loteo. Finalmente emplazaremos nuestra temática en el marco de las reformas estatales sucedidas a partir de 1985, su repercusión en el rol de los municipios y su impacto -junto a la globalización- en la estructura urbana, como es el patrón de crecimiento disperso y la tendencia a la segregación