Caracterização fisiológica, patogênica e análise isoenzimática de isolados monospóricos e multispóricos de Colletotrichum gloeosporioides

Foram caracterizados isolados monospóricos, obtidos de seis isolados multispóricos de Colletotrichum gloeosporioides, de cajueiro e mangueira, quanto à morfologia das colônias, crescimento micelial em BDA, patogenicidade e análise isoenzimática. As colônias dos isolados multispóricos apresentaram diversidade quanto à cor e aspecto, mas não foram observadas variações expressivas na morfologia dos 60 isolados monospóricos, quando comparados aos respectivos multispóricos, e apenas em dois isolados foi possível observar características morfológicas diferentes. Os isolados estudados exibiram bom crescimento em BDA, aos seis dias de incubação. Alguns isolados monospóricos, obtidos de quatro multispóricos de cajueiro e mangueira, foram heterogêneos no crescimento micelial. A patogenicidade foi o parâmetro que melhor caracterizou a variação entre isolados monospóricos e multispóricos de C. gloeosporioides. Diferentes níveis de agressividade foram observados entre e dentro dos isolados monospóricos e multispóricos. Os padrões eletroforéticos de isoesterases demonstraram que não houve variação, quanto à análise isoenzimática, entre os isolados monospóricos e os multispóricos dos quais foram originados. Os resultados deste trabalho sugerem que a escolha do tipo de isolado de C. gloeosporioides para estudos em cajueiro e mangueira deve ser precedida da comparação entre isolados monospóricos e multispóricos com base no crescimento micelial e patogenicidade.

Diversidade populacional de Colletotrichum sublineolum em seis localidades no Brasil

Foi objetivo deste trabalho caracterizar a população de Colletotrichum sublineolum Henn. por meio da avaliação da virulência de 289 isolados monospóricos do patógeno. Foram utilizadas como diferenciadoras 10 linhagens elites do programa de melhoramento genético de sorgo da Embrapa Milho e Sorgo. Os isolados de C. sublineolum foram obtidos de folhas de sorgo provenientes de Palmeira de Goiás e Goiânia, GO, Sete Lagoas, Ipiaçu e Uberlândia, MG, e Jardinópolis, SP e designados de acordo com um sistema binário de classificação de raças. As populações foram também caracterizadas quanto à diversidade fenotípica, por meio de índices de Shannon, de Gleason e de Simpson, e de um índice de complexidade, e quanto a sua distribuição e freqüência nas seis localidades. Somente a raça 31.04 foi encontrada nos seis locais avaliados e foi a raça mais freqüente em Uberlândia, Ipiaçu e Palmeira de Goiás. A raça mais complexa, 31.31, foi a mais freqüente em Sete Lagoas e Goiânia e não foi observada somente em Palmeira de Goiás. Verificou-se que as raças mais freqüentes em cada localidade apresentaram-se, em sua maioria, bem distribuídas nas seis regiões avaliadas. O local com maior diversidade fenotípica foi Jardinópolis, de acordo com os índices de Shannon, Simpson e Gleason. O maior índice de complexidade de raças foi encontrado em Sete Lagoas e Goiânia, seguidas por Jardinópolis, Ipiaçu, Uberlândia e Palmeira de Goiás, respectivamente. Houve correlação entre os índices de Shannon e Gleason, mas não entre os índices de diversidade e de complexidade.

Efeito de extratos de plantas medicinais no controle de Colletotrichum acutatum, agente causal da flor preta do morangueiro

A flor preta do morangueiro, causada por Colletotrichum acutatum, acarreta sérios problemas à cultura. Com o objetivo de verificar a utilização de extratos vegetais no controle da doença, testes "in vitro" foram realizados com 11 extratos vegetais hidroalcoólicos produzidos de plantas utilizadas na medicina popular. Os extratos foram preparados a partir de diferentes partes da planta, de acordo com a espécie, utilizando água e álcool no processo de extração por maceração. Foi verificada a influência dos extratos no crescimento micelial, esporulação e germinação de esporos de C. acutatum, e também no controle do patógeno em folhas e frutos destacados. De acordo com a metodologia utilizada, os extratos vegetais que apresentaram maior eficiência foram os de folha e ramos de Ruta graveolens, Artemisia absinthium e bulbos de Allium sativum, indicando ter essas plantas potencial fungitóxico para o controle de C. acutatum.

Eventos do processo de infecção de Colletotrichum gloeosporioides inoculados em folhas de Coffea arabica L

O presente trabalho teve por objetivo obter informações sobre os eventos de pré-penetração, penetração e colonização de isolados de C. gloeosporioides, obtidos de mangueira e cafeeiro, quando inoculados em folhas de cafeeiros (Coffea arabica L.) da cultivar Catucaí Vermelho. As folhas foram selecionadas, padronizadas e lavadas, demarcando-se áreas circulares de 0,5 cm de diâmetro na face abaxial, inoculando-se uma alíquota de 20 µL da suspensão de conídios. Utilizou-se um isolado obtido de mangueira e dois isolados obtidos de cafeeiro com mancha manteigosa. Realizaram-se avaliações com 3, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 144 e 240 horas após a inoculação (hai). Todos os materiais foram processados e observados em microscópico eletrônico de varredura. Os conídios de todos os isolados aderiram freqüentemente nas depressões das células da epiderme e células-guarda dos estômatos, formando septo antes da germinação. A penetração, na maior parte, se deu por via direta e algumas vezes por estômatos. Isolados de cafeeiro germinaram em folhas de 6 a 8 hai, produzindo apressórios 12 hai e acérvulos de 96 a 144 hai. O isolado de mangueira germinou de 6 a 8 hai com formação de apressório de 8 a 12 hai e produziu novos conídios diretamente em hifas conidiogênicas. Não foi observada a formação acérvulos para este isolado.

Efeito de diferentes níveis de Colletotrichum gossypii South var. cephalosporioides Costa, em plantas de algodão no campo e sua incidência nas sementes

A transmissão planta-semente de Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides, agente causal da ramulose do algodoeiro, não tem sido correlacionada com a severidade da doença no campo. Entretanto, baixos níveis de incidência têm, muitas vezes, resultado em altos índices de infecção das sementes pelo patógeno. Esse fato induz o cancelamento de campos de produção de sementes em algumas regiões produtoras. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de níveis de inóculo inicial, constituído de plantas com sintomas da doença, em relação à incidência da ramulose quando 70% das maçãs estavam formadas, período considerado como de maior suscetibilidade à infecção, bem como a transmissão planta-semente em relação aos níveis de incidência da doença no campo. O experimento foi conduzido durante os anos agrícolas de 2006 e 2007, com níveis de inóculo inicial de 0,0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 e 1,6% de plantas com sintomas aos 40 dias após a emergência, em blocos casualizados com quatro repetições e parcelas com oito linhas de 15 m. A incidência da ramulose foi avaliada quando 70% das maçãs estavam formadas, em 200 plantas, nas quatro fileiras centrais. Após a colheita, as sementes foram submetidas ao teste de sanidade pelo método do papel de filtro. Observou-se correlação significativa entre os níveis de inóculo inicial e a incidência da doença quando 70% das maçãs estavam formadas, bem como entre os níveis de incidência no campo e a incidência do patógeno nas sementes, sendo esta correlação altamente significativa no ano de 2006. Campos de produção com incidência de ramulose acima de 5% podem induzir níveis elevados de infecção nas sementes.

Variabilidade genética entre isolados de Colletotrichum gossypii do algodoeiro

O algodoeiro é atacado por Colletotrichum gossypii (CG) e C. gossypii var. cephalosporioides (CGC). Ambos os patógenos são transmitidos pela semente e sua distinção morfológica é extremamente difícil e inconsistente. Tentativas foram feitas no presente trabalho para verificar a variabilidade genética entre CG e CGC através de RAPD-PCR, ERIC- e REP-PCR e PCR-RFLP da região ITS rDNA. Foram utilizados 53 isolados coletados de sementes e folhas de plantas de diferentes cultivares nos estados do Paraná, São Paulo, Mato Grosso, Minas Gerais, e Paraiba, entre 1999 e 2003. Baseado em testes de patogenicidade, vinte e um isolados foram classificados como CG e 32 como CGC. Os resultados obtidos por RAPD-PCR, utilizando-se oito primers, revelaram dois grupos distintos sendo que o primeiro foi formado por 94% dos isolados de sementes e o segundo por 95% dos isolados de folhas. Na análise de ERIC- e REP-PCR, resultados semelhantes a RAPD foram obtidos, sendo que o primeiro grupo foi formado por 93% dos isolados provenientes das sementes e o segundo por 78% dos isolados provenientes das folhas. Quando o produto de amplificação da região ITS rDNA foi digerido com oito enzimas de restrição, um perfil de bandas semelhante para todos os isolados foi obtido. Resultados de RAPD, ERIC- e REP-PCR demonstraram que existem diferenças genéticas entre os isolados provenientes das sementes e aqueles provenientes de parte aérea, e esses dois grupos foram claramente distintos. Estudos futuros devem ser realizados utilizando outras técnicas moleculares para a obtenção de marcadores capazes de distinguir entre isolados de CG e CGC.

Incidência de Colletotrichum graminicola em colmos de genótipos de milho

A podridão do colmo, causada por Colletotrichum graminicola, é uma das mais severas doenças da cultura do milho no Brasil, principalmente se ocorrer após a fase de florescimento, por causar perdas significativas na produtividade. A melhor alternativa para o controle da doença é a utilização de cultivares geneticamente resistentes. O objetivo deste trabalho foi avaliar a incidência da podridão de colmo em híbridos comerciais de milho, tendo em vista a pouca disponibilidade de informações que permitam a utilização da resistência genética como estratégia para o controle desta doença. Foram avaliados 18 híbridos comerciais de milho, em três ensaios conduzidos nos anos de 2005, 2006 e 2007 na área experimental da Embrapa Milho e Sorgo, sob condições de inóculo natural. Em cada parcela foram coletados fragmentos do colmo de três plantas, sendo: o segundo entrenó acima do solo, o entrenó de inserção da espiga e o entrenó localizado abaixo do pendão. Quatro fragmentos de cada parte foram desinfestados e transferidos para placas de Petri contendo meio de farinha de aveia - ágar (FAA). As placas foram mantidas em câmara de incubação sob luz fluorescente contínua à temperatura de 25 ºC, seguindo-se a identificação e quantificação do patógeno após três a quatro dias de incubação. As menores incidências (abaixo de 30%) foram observadas nos híbridos BR201 e BR206 e a maior incidência (acima de 60%) detectada no híbrido BRS1010. O patógeno foi detectado em todos os segmentos do colmo analisados, predominando, entretanto, no terço médio superior para a maioria dos híbridos avaliados. Apesar da variação observada entre os genótipos quanto à incidência da antracnose no colmo, nenhum híbrido pôde ser considerado como de altamente resistente ao patógeno.

Differentiation of Colletotrichum gloeosporioides isolates by using total proteins and esterase electrophoretic patterns and extracellular enzymes production

Isolates of Colletotrichum gloeosporioides (ISO-1, ISO-2, ISO-3, ISO-4, ISO-5 and ISO-6), the causal agent of anthracnose disease on mango fruits, were characterized by electrophoretic patterns of total proteins and esterase in polyacrylamida gel, and also, by production of extracellular enzymes on specific solid substrate. The electrophoretic analysis showed variation in number, intensity of coloration and position of the bands in the gel at each studied system tested. In contrast to the monomorphic behavior to total proteins, high esterase polymorfism was observed indicating difference among isolates. All isolates showed the activity of extracellular enzymes such as amylase, lipase, and protease with some variation among them. The proteolitic activity seemed to be more accentuated than the two other enzymes studied.

Diversidad genética de aislamientos de Bacillus subtilis con potencial para el control biológico de Colletotrichum acutatum y Guignardia citricarpa

El sector citrícola enfrenta serios problemas representados por enfermedades en las flores y en frutos jóvenes que además de disminuir la productividad, devalúan los frutos por el aspecto que le dan a los mismos. Tales enfermedades están representadas, principalmente, por la mancha negra de los frutos cítricos (MNC) y por la caída prematura de los frutos cítricos (CPFC), donde la medida predominante de control es la pulverización con productos químicos. Entretanto, los costos financieros y ambientales de las aplicaciones con estés productos químicos, sumado a las crecientes restricciones de la presencia de residuos, están a exigir el estudio de nuevas alternativas de control. Entre estas, el control biológico surge como una alternativa importante. Estudios fueron anteriormente realizados, bajo condiciones de laboratorio y de campo, con el objetivo de determinar la potencialidad de aislados de Bacillus subtilis en el control de las enfermedades mencionadas arriba, puesto que, uno aislado, el ACB-69 fue el que presentó la mejor eficiencia de control. Frente a lo anteriormente expuesto y, sabiendo que, el conocimiento de la biodiversidad de los seres es importante para la determinación de sus funciones potenciales, el presente proyecto de investigación tuvo como objetivo estudiar la diversidad genética, a través de marcadores moleculares AFLP, de 32 aislamientos de B. subtilis con la finalidad de se encontrar, dentro los mismos, uno (o más aislados) que presentase mayor semejanza con el ACB-69 y que cuando testado, bajo condiciones naturales de ocurrencia de las enfermedades, si puede encontrar similar control. En función de los resultados experimentales obtenidos, se concluyo que: (a) los aislados de B. subtilis estudiados se agruparon en el filograma de distancia genética, independiente de la procedencia o del huésped; (b) los aislados ACB-69 y ACB-83, con potencial para el control de la caída prematura de los frutos cítricos, comparten la misma ancestralidad, lo que puede ser evaluado por la metodología aplicada; c) en términos biológicos, el aislado ACB-83 merece mas estudios cuanto a la viabilidad de control de las enfermedades caída prematura de los frutos cítricos y de la mancha negra, bajo condiciones de campo.

Atividade do óleo de Eucalyptus citriodora e Azadirachta indica no controle de Colletotrichum acutatum em morangueiro

A flor-preta é uma das doenças mais importantes do morangueiro e a busca por alternativas de controle tem sido uma constante, principalmente em áreas de cultivo orgânico. Assim, objetivou-se avaliar a eficiência, in vitro e in vivo, dos óleos de Eucalyptus citriodora e Azadirachta indica no controle de Colletotrichum acutatum em morangueiro. No experimento in vitro determinou-se a inibição do crescimento micelial quando o fungo foi submetido aos extratos nas concentrações de 0; 0,25; 0,5; 1,0 e 1,5%. No campo, avaliou-se o controle da doença com a aplicação dos óleos nas concentrações de 0, 0,5 e 1,0%, pulverizados em intervalos de 7, 15 e 30 dias, em plantas inoculadas com suspensão de 10(6) conídios/mL. As avaliações foram realizadas semanalmente, observando-se a ocorrência e tamanho de lesões no pedúnculo e nos frutos, abortamento floral, produtividade, e ocorrência natural da doença. In vitro todos os tratamentos apresentaram redução significativa do crescimento micelial do fungo quando comparados ao controle. No campo, apenas o óleo de nim apresentou efeito significativo, reduzindo o abortamento floral e a ocorrência de frutos doentes advindos de flores inoculadas. Porém, maior ocorrência natural de doença foi observada quando a dosagem de 1,0% foi aplicada semanalmente.

Diversidade fenotípica e patogênica de Colletotrichum, agente causal da antracnose em mangueira, e identificação de espécie

O presente trabalho teve como objetivo estudar a diversidade fenotípica e patogênica de 40 isolados de Colletotrichum obtidos de mangueira no Nordeste do Brasil e identificar diferentes espécies desse fitopatógeno, agente causal de antracnose, através da análise da seqüência da região ITS do rDNA. Quanto à caracterização morfológica e cultural, as colônias dos isolados apresentaram diversidade em relação à cor e aspecto, sendo mais comum à cor branco-cinza, característica de Colletotrichum gloeosporioides. Não foram observadas variações expressivas na morfologia dos 40 isolados. Os conídios apresentaram-se, predominantemente, hialinos e unicelulares, com formato variando de bastonete para cilíndrico. Todos os isolados produziram apressórios variados em formato e quantidade e apenas 10 isolados apresentaram setas. Para efeito do crescimento micelial e taxa de crescimento foi possível classificar os isolados em sete grupos. Vinte e dois isolados exibiram taxa de crescimento >10mm/dia, considerada típica da espécie C. gloeosporioides. Os isolados foram patogênicos em folhas destacadas de mangueira, induzindo sintomas de antracnose, na forma de manchas escuras levemente deprimidas, e apresentando variações quanto à agressividade. Na identificação específica, baseada na análise da seqüência ITS do DNA ribossomal, 36 isolados amplificaram com o oligonucleotídeos CgInt, específico para C. gloeosporioides e o ITS4, Os isolados CM1, CM4, CM5 e CM10, não amplificaram produtos para nenhum dos oligonucleotídeos específicos, sendo identificados como Colletotrichum spp. Os resultados desse trabalho demonstraram que isolados de Colletotrichum, obtidos de mangueira, apresentam ampla variabilidade morfofisiológica e patogênica. E que, possivelmente, existe mais de uma espécie de Colletotrichum que causa antracnose em mangueira no Nordeste do Brasil.

Potencial antifúngico de extratos de plantas e de basidiomicetos nativos sobre Colletotrichum acutatum, Alternaria solani e Sclerotium rolfsii

O emprego de fungicidas na agricultura, principalmente quando utilizados de forma inadequada, tem provocado danos tanto ao homem como ao ambiente. O presente trabalho teve por objetivo o estudo in vitro da eficácia de extratos de três plantas e de dois basidiomicetos nativos do Brasil no controle dos fungos Alternaria solani e Colletotrichum acutatum, causadores de graves prejuízos às culturas de tomate e morango, respectivamente, além de Sclerotium rolfsii, considerado como patógeno polífago. No trabalho foram avaliados: a) a inibição de crescimento micelial dos três fitopatógenos, b) inibição da germinação de conídios de A. solani e C. acutatum e c) inibição da germinação de escleródios de S. rolfsii. Os melhores resultados foram obtidos com o extrato de Oudemansiella canarii, que proporcionou os menores valores de crescimento micelial dos três patógenos, além inibir totalmente a germinação de conídios de A. solani e C. acutatum e de escleródios de S. rolfsii. O extrato de Irpex lacteus inibiu parcialmente o crescimento micelial dos patógenos estudados e o extrato de Avicennia schaueriana promoveu apenas 16 % de inibição do crescimento micelial de S. rolfsii. Nenhum efeito sobre os patógenos foi verificado com os extratos de Senna spectabilis e Senna multijuga nas condições em que foram realizados os experimentos.

Detecção in situ de espécies reativas de oxigênio em feijoeiro tratado com extratos de Pycnoporus sanguineus e inoculado com Colletotrichum lindemuthianum

Este trabalho teve como objetivo detectar in situ a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO'S), particularmente peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical superóxido (O2.- ), em plantas de feijão tratadas com extrato aquoso de micélio e de basidiocarpo de Pycnoporus sanguineus, em concentração de 5% (p/v), e inoculadas após 3 dias com Colletotrichum lindemuthianum. As avaliações foram realizadas às 48, 96 e 192 h após a inoculação (hai). Água destilada, azoxystrobin (40 mg i.a. L-1 ) e acibenzolar-S-metil (75 mg i.a. L-1 ) foram utilizados como tratamentos controle. Foi detectada formação de H2O2 em 48 hai apenas para o tratamento com extrato de basidiocarpo. Para O2. , foi detectada a formação principalmente para o tratamento com extrato de micélio em 48 hai. Em 192 hai todos os tratamentos apresentaram reação para H2O2 e O2.- nas células epidérmicas e do mesófilo, provavelmente em decorrência do processo infeccioso. Estes resultados indicam o potencial dos extratos de P. sanguineus na indução de ERO's em feijoeiro no início da infecção, o que pode contribuir para a redução da severidade de antracnose.