Étiopathogenèse de la scoliose idiopathique de l'adolescent : implication de la mélatonine et de l'ostéopontine

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est une maladie dont la cause est encore inconnue, et qui génère des déformations complexes du rachis, du thorax et du bassin. La prévalence est de 4% dans la population adolescente au Québec. Cette pathologie affecte surtout les filles durant leur poussée de croissance pubertaire. Parmi plusieurs hypothèses émises, l’hypothèse neuroendocrinienne, impliquant une déficience en mélatonine comme agent étiologique de la SIA a suscité beaucoup d’intérêt. Cette hypothèse découle du fait que l’ablation de la glande pinéale chez le poulet produit une scoliose ressemblant sous plusieurs aspects à la pathologie humaine. La pertinence biologique de la mélatonine dans la scoliose est controversée, étant donné que la majorité des études chez l’homme n’ont pu mettre en évidence une diminution significative des niveaux de mélatonine circulante chez les patients scoliotiques. Nous avons démontré un dysfonctionnement dans la signalisation de la mélatonine au niveau des tissus musculo-squelettiques chez une série de patients atteints de SIA (Moreau & coll. 2004). Nous avons confirmé ce défaut chez un plus grand nombre de patients ainsi qu’en utilisant une nouvelle technologie (spectroscopie cellulaire diélectrique) n’ayant pas recours à un prétraitement des cellules donnant ainsi des résultats plus précis. Cette technique a montré la présence des mêmes groupes fonctionnels identifiés auparavant par la technique d’AMPc. Le dysfonctionnement de la signalisation de la mélatonine est dû à une phosphorylation accrue des protéines G inhibitrices. Ce défaut pourrait être causé par un déséquilibre de l’activité des kinases et phosphatases capables de réguler la phosphorylation des protéines Gi. Parmi ces kinases, PKCd a suscité initialement notre intérêt vu qu’elle peut phosphoryler les protéines Gi. Nous avons démontré que cette kinase interagit avec le récepteur de la mélatonine MT2 et que cette interaction varie selon le groupe fonctionnel auquel un patient SIA appartient. Par la suite nos travaux se sont dirigés vers la découverte d’effecteurs cellulaires régulés par la mélatonine et plus spécifiquement l’ostéopontine (OPN), compte tenu de son rôle présumé comme mécanorécepteur et dans certaines structures jouant un rôle dans la proprioception, le contrôle postural et la fonction vestibulaire. L’OPN a été identifiée initialement par sa surexpression au niveau protéique et de l’ARNm dans la musculature paraspinale uniquement chez les poulets scoliotiques. Nous avons également utilisé un autre modèle animal, la souris C57Bl/6 naturellement déficiente en mélatonine. Nous avons généré des souris bipèdes en amputant les membres antérieurs de souris OPN KO, des souris CD44 KO ainsi que des souris contrôles C57Bl/6. Nos résultats ont montré qu’aucune souris OPN KO (n=50) ou CD44 KO (n=60) ne développe la maladie, contrairement aux souris contrôles C57Bl/6 (n=50) dont 45% deviennent scoliotiques. Ces résultats nous ont poussés à investiguer le rôle de cette protéine dans l’étiopathogenèse de la maladie chez l’humain. Nos résultats ont montré une augmentation des niveaux circulants d’OPN chez les patients atteints de la SIA et que l’élevation en OPN corrélait avec la sévérité de la maladie. Nos études chez les enfants asymptomatiques nés de parents scoliotiques et qui sont plus à risque de développer la maladie ont aussi démontré des différences significatives au niveau des concentrations en OPN en comparaison avec les sujets sains. En effet, plusieurs enfants à risque présentaient des niveaux d’OPN supérieurs à 800ng/ml suggérant un plus grand risque de développer une scoliose indiquant aussi que l’augmentation des niveaux en OPN précède le début de la maladie.

Optimization Studies to Improve MSC-based Cardiac Cell Therapy : Cytokine Preconditioning and Nanoparticle Coupling

Contexte: La cardiopathie ischémique (IHD) reste une cause majeure de mortalité en Amérique du Nord. La thérapie cellulaire cardiaque (CCT) a émergé comme une thérapie prometteuse pour aider à guérir certaines malades cardiaques. Parmi les cellulaires avec propriétés pluripotentes, les cellules stromales mésenchymateuses (MSC) sont prometteuses. Cependant, plusieurs questions demeurent non résolues et certaines défis empêchent l'application clinique de la CCT se dans l'IHD, tels que le faible taux de rétention cellulaire in situ, le suivi des cellules in vivo post-implantation et post-acheminements et l`apoptose. Ici, le traitement préliminaire des MSC avec des facteurs de croissance et leur couplage avec des nanoparticules (NP) seront étudiés comme des méthodes pour optimiser MSC. Méthodes: Des MSCs provenant du rat (rMSC) et du cochon (pMSC) ont été isolés à partir de moelle osseuse. Les rMSC ont été préconditionnées avec SDF-1a, TSG-6 et PDGF-BB, et ensuite soumises à une hypoxie, une privation de sérum et a un stress oxydatif. Des études de cicatrisation ont également été effectués avec rMSCs préconditionnées. En parallèle, de nouvelles NP ferromagnétiques liées aux silicones ont été synthétisées. Les NPs ont été couplées aux pMSCs suivant leur fonctionnalisation avec l`anticorps, CD44, un antigène de surface du MSC bien connu. Par la suite, les études de biocompatibilité ont été réalisées sur pMSC-NP et en incluant des tests des processus cellulaires tels que la migration, l'adhésion, la prolifération et les propriétés de la différenciation. Résultats: Parmi toutes les cytokines testées, PDGF-BB a démontré la plus grande capacité à améliorer la survie de MSC dans des conditions d'hypoxie, de privation de sérum et en reponse au stress oxydatif. La conjugaison de NP a atténué la migration et la prolifération des pMSCs, mais n`a pas changé leur capacité de différenciation. Enfin, la complexe du MSC-NP est détectable par IRM. Conclusion: Nos données suggèrent que de nouvelles stratégies, telles que traitement préliminaire de PDGF-BB et le couplage des nanoparticules ferromagnétiques, peuvent être considérés comme des avenues prometteuse pour optimiser les MSCs pour la CCT.

Rôle de la tolérance centrale et périphérique des lymphocytes T autoréactifs dans deux nouveaux modèles murins double transgéniques

Les maladies autoimmunes sont des affections chroniques, le plus souvent invalidantes, qui touchent plus de 5% de la population dans les pays développés. L’autoimmunité résulte de la rupture des mécanismes de tolérance du système immunitaire vis-à-vis des autoantigènes exprimés par les tissus de l’organisme, entraînant la destruction d’un ou de plusieurs organes-cibles par les lymphocytes T et/ou B. L’hépatite autoimmune et le diabète autoimmun se caractérisent par la destruction sélective des hépatocytes et des cellules beta pancréatiques, respectivement. De plus en plus d’arguments suggèrent une implication des lymphocytes T CD8+ dans le déclenchement, la progression et la régulation des réponses associées à plusieurs maladies autoimmunes. Dans ce projet, nous avons suivi l’évolution de clones de lymphocytes T CD8+ spécifiques à un antigène particulier dont le site d’expression différait. Pour ce faire, nous avons développé deux nouveaux modèles murins double transgéniques par croisement entre une lignée de souris exprimant un TCR transgénique spécifique à la nucléoprotéine (NP) du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), et une souris exprimant cette NP-LCMV : 1) uniquement dans les hépatocytes (modèle d’hépatite autoimmune), ou 2) simultanément dans le thymus et le pancréas (modèle de diabète autoimmun). L’avidité fonctionnelle des lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP chez les souris TCR transgéniques était inversement proportionnelle au niveau d’expression du TCR. Le répertoire lymphocytaire dans le thymus, la rate, les ganglions et le sang périphérique a été caractérisé pour chacune des lignées de souris double transgéniques, de même que la capacité fonctionnelle et le phénotype (marqueurs d’activation/mémoire) des lymphocytes T CD8+ autoréactifs. Chacun des deux nouveaux modèles présentés dans cette étude ont montré que les lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP sont aptes à briser la tolérance centrale et périphérique et à provoquer une réaction d’autoimmunité spontanée. Dans le modèle d’hépatite autoimmune, où l’expression de l’autoantigène était restreinte au foie, la surexpression du TCR transgénique a entraîné une délétion thymique quasi-totale des lymphocytes T CD8+ spécifiques à la NP prévenant le développement d’une hépatite spontanée. alors qu’un niveau de TCR comparable à celui d’une souris de type sauvage a permis une sélection positive des lymphocytes autoréactifs qui se sont accumulés dans le foie où ils se sont activés pour provoquer une hépatite autoimmune spontanée. Dans le modèle de diabète autoimmun, où l’autoantigène était exprimé dans le pancréas et le thymus, les souris des deux lignées double transgéniques ont montré une délétion thymique partielle, peu importe le niveau d’expression du TCR. Seuls les mâles adultes développaient un diabète spontané et une partie de leurs lymphocytes T CD8+ exprimaient une combinaison particulière de marqueurs d’activation/mémoire (CD44, CD122, PD-1). Cette population lymphocytaire était absente chez les souris femelles et les mâles sains. L’étude de la tolérance des lymphocytes T CD8+ autoréactifs dans nos deux nouveaux modèles murins double transgéniques a permis d’identifier des mécanismes alternatifs possiblement impliqués dans la tolérance et l’activation, et de mieux comprendre le rôle des lymphocytes T CD8+ autoréactifs dans le processus autoimmun menant à l’hépatite autoimmune et au diabète autoimmun. Ces découvertes seront utiles pour développer de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les lymphocytes T CD8+ autoréactifs.

Donor bone marrow cells play a role in the prevention of accelerated graft rejection induced by semi-allogeneic spleen cells in transplantation

Spleen or spleen plus bone marrow cells from (BALB/c x C57Bl/6)F1 donors were transferred into BALB/c recipients 21 days before skin or cardiac transplantation. Prolonged graft survival was observed on recipients treated with the mixture of donor-derived cells as compared to those treated with spleen cells alone. We evaluated the expression of CD45RB and CD44 by splenic CD4(+) and CD8(+) T cells 7 and 21 days after donor cell transfer. The populations of CD8(+)CD45RB(low) and CD8(+)CD44(high) cells were significantly decreased in mice pre-treated with donor spleen and bone marrow cells as compared to animals treated with spleen cells only, although these cells expanded in both groups when compared to an earlier time-point. No differences were observed regarding CD4+ T cell population when recipients of donor-derived cells were compared. An enhanced production of IL-10 was observed seven days after transplantation in the supernatants of spleen cell cultures of mice treated with spleen and bone marrow cells. Taken together these data suggest that donor-derived bone marrow cells modulate the sensitization of the recipient by semi-allogeneic spleen cells in part by delaying the generation of activated/memory CD8(+) T cells leading to enhanced graft survival. (c) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

Early modulation of inflammation by mesenchymal stem cell after acute kidney injury

Therapy with stem cells has showed to be promising for acute kidney injury (AKI), although how it works is still controversial. Modulation of the inflammatory response is one possible mechanism. Most of published data relies on early time and whether the protection is still maintained after that is not known. Here, we analyzed whether immune modulation continues after 24 h of reperfusion. MSC were obtained from male Wistar rats. After 3-5 passages, cells were screened for CD73, CD90, CD44, CD45, CD29 and CD 31. In addition, MSC were submitted to differentiation in adipocyte and in osteocyte. AKI was induced by bilaterally clamping of renal pedicles for 60 min. Six hours after injury, MSC (2 x 105 cells) were administered intravenously. MSC-treated animals presented the lowest serum creatinine compared to non-treated animals (24 h: 1.3 +/- 0.21 vs. 3.23 +/- 0.89 mg/dl, p<0.05). The improvement in renal function was followed by a lower expression of IL-1b, IL-6 and TNF-alpha and higher expression of IL-4 and IL-10. However, 48 h after reperfusion, this cytokine profile has changed. The decrease in Th1 cytokines was less evident and IL-6 was markedly up regulated. PCNA analysis showed that regeneration occurs faster in kidney tissues of MSC-treated animals than in controls at 24 h. And also ratio of Bcl-2/Bad was higher at treated animals after 24 and 48 h. Our data demonstrated that the immunomodulatory effects of MSC occur at very early time point, changing the inflammation profile toward a Th2 profile. (C) 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.

Caracterização de células-tronco mesenquimais de camundongos normais e do modelo murino de MPS I

Existe um interesse crescente pelo controle das condições de cultivo necessárias para a expansão de células-tronco de indivíduos adultos devido ao grande potencial para o desenvolvimento de pesquisa básica e de aplicações terapêuticas apresentado pelas mesmas. Atualmente, a literatura apresenta poucos trabalhos que detalhem a biologia da célula-tronco mesenquimal (MSC) de camundongo, revelando a necessidade de estudos voltados para este tema. Quatro culturas de longa duração foram produzidas com células da medula óssea de camundongos normais e IDUA knock-out através de técnicas de cultivo relativamente simples. Estas culturas puderam ser mantidas por até 40 passagens, e demonstraram ser morfologicamente homogêneas. Células dessas culturas puderam ser induzidas a diferenciarem-se ao longo de vias de diferenciação adipogênica e osteogênica, e revelaram ser capazes de suportar o crescimento e a proliferação de células-tronco hematopoiéticas. Por apresentarem tais características funcionais, essas populações celulares foram operacionalmente definidas como MSCs. Quando o repertório de marcadores de superfície dessas células foi observado por meio de citometria de fluxo, verificou-se que elas eram positivas para Sca-1, CD29, CD44 e CD49e, e eram negativas para CD11b, CD13, CD18, CD19, CD31, CD45, CD49d e Gr-1 Este perfil de moléculas de superfície assemelha-se àquele descrito para a MSC humana, e indica ausência de contaminantes hematopoiéticos. Uma verificação preliminar da freqüência da MSC na medula óssea de camundongo foi realizada, trazendo a estimativa de que uma MSC está presente numa faixa de 11.000 – 27.000 células. Finalmente, os dados revelaram que não há diferenças imediatamente perceptíveis entre camundongos normais e do modelo murino de MPS I no tocante à MSC, o que indica que os trabalhos futuros visando à correção da deficiência de α-L-iduronidase neste modelo utilizando a MSC são viáveis. O estabelecimento da metodologia para o cultivo e expansão da MSC murina através de técnicas simples vem preencher uma lacuna existente no campo dos modelos experimentais animais, trazendo novas perspectivas para o desenvolvimento de estratégias de terapia celular/genética em modelos experimentais murinos.

Papel dos gangliosídios de células estromais sobre a proliferação e sobrevivência de células precursoras mielóides

A mielopoiese depende do estroma mielossuportivo tanto no que diz respeito a produção de fatores de crescimento como de proteoglicanos de heparan-sulfato. O ambiente intercelular formado entre células do estroma e células progenitoras mielóides possui características ácidas, conferidas por moléculas carregadas negativamente e sensíveis a sialidase. Gangliosídios, glicoesfingolipídios contendo pelo menos uma molécula de ácido siálico, têm sido relacionados à modulação de fatores de crescimento e à diferenciação de células hematopoiéticas. Neste trabalho, estudamos a produção, a distribuição e o papel dos gangliosídios em um modelo experimental in vitro de mielopoiese dependente do estroma derivado de fígado fetal murino AFT-024. Utilizamos como sistema de resposta para o monitoramento da disponibilidade e atividade local de GM-CSF a linhagem celular precursora mielóide FDC-P1, a qual é dependente de GM-CSF para sua sobrevivência e proliferação. O GM3 foi o principal gangliosídio produzido pelo estroma, mas não pelas células mielóides, sendo requerido para que a função mielossuoprtiva do estroma seja ótima. Este gangliosídio foi liberado para o sobrenadante de cultura das células AFT-024 e seletivamente incorporado pelas células progenitoras mielóides, onde foi segregado em rafts e colocalizou-se com a cadeia α do receptor de GM-CSF. Além disso, o gangliosídio GM3 foi encontrado na fração insolúvel de células AFT-024 tratadas com Triton X-100 a 4°C, estando presente também nas frações menos densas do fracionamento em gradiente de sacarose, indicando sua presença em rafts. O GM3 captado pelas células FDC-P1 foi metabolizado, gerando gangliosídios das séries a e b, da mesma forma que o GM3 endógeno. Nestas células, o GM1 é o principal gangliosídio, também sendo encontrado na interface entre estroma e células mielóides, mas com colocalização apenas parcial com a cadeia α do receptor de GM-CSF. As imagens de imunocitoquímica ainda revelaram que o GM1 não apresenta colocalização significante com a cadeia β do receptor de GM-CSF, com o gangliosídio GM3, ou com CD44. Em um outro grupo de experimentos, analisamos o perfil de síntese e shedding de gangliosídios em um estroma derivado de medula óssea, a linhagem celular S17; na linhagem celular GRX, derivada de células estreladas hepáticas isoladas de reação fibro-granulomatosa inflamatória; e em cultivos primários de fibroblasto de pele murinos. Além disso, comparamos a habilidade destes estromas para sustentar a sobrevivência e a proliferação das células precursoras mielóides. A concentração de ácido siálico reflete a capacidade mielossuportiva dos estromas. Embora os diferentes estromas sintetizem os mesmos gangliosídios, existem diferenças no conteúdo relativo de cada gangliosídio. Aparentemente, o GM3 é o principal gangliosídio envolvido na modulação da atividade dos fatores de crescimento. O shedding foi similar ao perfil de síntese de gangliosídios, mas a atividade mielossuportiva dos sobrenadantes foi diferente entre os tipos celulares e em relação a sustentação por contato. No entanto, a proliferação das células FDC-P1 diminuiu em todos os sobrenadantes obtidos de células estromais em que a síntese de gangliosídios foi inibida e onde o gangliosídio GM3 foi neutralizado pelo anticorpo monoclonal anti-GM3. As diferenças encontradas na capacidade de sustentação da proliferação de células progenitoras mielóides por fator de crescimento solúvel ou apresentado podem estar relacionadas a diferenças na concentração de gangliosídios inseridos na membrana plasmática ou liberados para o meio de cultura. Sendo assim propomos que as células do estroma mielossuportivo produzem e secretam os fatores de crescimento necessários e seus cofatores, tais como proteoglicanos de heparan-sulfato. O estroma também fornece gangliosídios, os quais são transferidos do estroma para as célulasalvo, onde geram domínios de membrana específicos contendo complexos macromoleculares que incluem os receptores para fatores de crescimento.

Isolation and immunophenotypic characterization of mesenchymal stem cells derived from equine species adipose tissue

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco mesenquimais do líquido amniótico equino obtido em diferentes idades gestacionais

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Diferenciação in vitro de células-tronco mesenquimais da medula óssea de cães em precursores osteogênicos

O objetivo principal da nossa pesquisa foi avaliar o potencial de diferenciação osteogênica de células-tronco mesenquimais (MSC) obtidas da medula óssea do cão. As MSC foram separadas pelo método Ficoll e cultivadas sob duas condições distintas: DMEM baixa glicose ou DMEM/F12, ambos contendo L-glutamina, 20% de SFB e antibióticos. Marcadores de MSC foram testados, confirmando células CD44+ e CD34- através da citometria de fluxo. Para a diferenciação osteogênica, as células foram submetidas a quatro diferentes condições: Grupo 1, as mesmas condições utilizadas para a cultura de células primárias com os meios DMEM baixa glicose suplementado; Grupo 2, as mesmas condições do Grupo 1, mais os indutores de diferenciação dexametasona, ácido ascórbico e b-glicerolfosfato; Grupo 3, células cultivadas com meios DMEM/F12 suplementado; e Grupo 4, nas mesmas condições que no Grupo 3, mais indutores de diferenciação de dexametasona, ácido ascórbico e b-glicerolfosfato. A diferenciação celular foi confirmada através da coloração com alizarin red e da imunomarcação com o anticorpo SP7/Osterix. Nós observamos através da coloração com alizarin red que o depósito de cálcio foi mais evidente nas células cultivadas em DMEM/F12. Além disso, usando a imunomarcação com o anticorpo SP/7Osterix obtivemos positividade em 1:6 células para o Meio DMEM/F12 comparada com 1:12 para o meio DMEM-baixa glicose. Com base nos nossos resultados concluímos que o meio DMEM/F12 é mais eficiente para a indução da diferenciação de células-tronco mesenquimais caninas em promotores osteogênicos. Este efeito provavelmente ocorre em decorrência da maior quantidade de glicose neste meio, bem como da presença de diversos aminoácidos.

Antitumor effects in vitro and in vivo and mechanisms of protection against melanoma B16F10-Nex2 cells by fastuosain, a cysteine proteinase from Bromelia fastuosa

In the present work, the antitumor effect of fastuosain, a cysteine proteinase from Bromelia fastuosa, was investigated. In the intravenous model of lung colonization in C57Bl/6 mice, fastuosain and bromelain injected intraperitoneally were protective, and very few nodules of B16F10-Nex2 melanoma cells were detected. Tumor cells treated with fastuosain showed reduced expression of CD44 and decreased invasion through Matrigel, lost their cytoplasmic extensions and substrate adherence, and became round and detached, forming strongly bound cell clusters in suspension. Peritoneal cells recruited and activated by fastuosain treatment ( mainly monocytic cells and lymphocytes) migrated to the lung, where pulmonary melanoma metastases grew. Adoptive transference of peritoneal cells recruited by fastuosain had no protective effect against lung metastases in recipient mice. Treatment of green fluorescent protein - chimeric animals with fastuosain did not change the number of cells that migrated to the lung, compared to PBS-injected control mice, but the number of positive major histocompatibility complex class II cells increased with fastuosain treatment. Murine antibodies against fastuosain, bromelain, and cathepsins B and L cross-reacted in ELISA and recognized surface and cytoplasmic components expressed on B16F10-Nex2 cells. Anti-fastuosain antibodies were cytotoxic/lytic to B16F10-Nex2 cells. Antitumor effects of fastuosain involve mainly the direct effect of the enzyme and elicitation of protective antibodies.

Immunophenotypic, immunocytochemistry, ultrastructural, and cytogenetic characterization of mesenchymal stem cells from equine bone marrow

The aim of this study was to isolate, culture, and characterize mesenchymal stem cells (MSCs) from horse bone marrow (BM) using the techniques of flow cytometry, immunocytochemistry, cytogenetics, and electron microscopy. Immunophenotypic analysis revealed the presence of MSCs with high expression of the CD90 marker, lower expression of the CD44 marker, and absent expression of the CD34 marker. In assays of differentiation, the positive response to osteogenic (OST), chondrogenic (CDG), and adipogenic (ADP) differentiation signals was observed and characterized by deposition of calcium-rich extracellular matrix (OST), proteoglycans and collagen II (CDG) and intracellular deposition of fat drops (ADP). In immunocytochemical characterization, MSCs were immunopositive for CD44, vimentin, and PCNA, and they were negative for CD13. In the ultrastructural analysis of MSCs, the most outstanding characteristic was the presence of rough endoplasmic reticulum with very dilated cisterns filled with a low electrodensity material. Additionally, MSCs had normal karyotypes (2n=64) as evidenced by cytogenetic analysis, and aneuploidy in metaphase was not observed. The protocols for isolating, culturing, and characterizing equine MSCs used in this study were shown to be appropriate for the production of a cell population with a good potential for differentiation and without aneuploidy that can be used to study future cellular therapies. © 2013 Wiley Periodicals, Inc.

Avaliação da população de células tronco tumorais nas neoplasias da glândula mamária em cadelas

Pós-graduação em Ciência Animal - FMVA

Implante de células-tronco mesenquimais autólogas, associadas ao plasma rico em plaquetas em tendinites experimentais de equinos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Coleta, processamento, caracterização fenótipa das células-tronco mesenquimais e sua viabilidade de aplicação por via intratecal em equinos

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)