Cyclodextrine als molekulare Reaktionsgefäße

Zusammenfassung:In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch die Anwendung von Cyclodextrinen in der Polymerchemie ein neuer Weg gefunden wurde, Homo- und Copolymerisationen von hydrophoben, fluorophilen sowie ionischen Monomeren in wässrigem Medium durchzuführen, die bislang nur durch den Einsatz von Emulgatoren oder in organischen Lösemittelgemischen möglich waren. Standardmonomere wie z.B. Styrol konnten erfolgreich aus wässriger Phase in Gegenwart von Cyclodextrin polymerisiert werden; unter Anwendung des Zulauf-Verfahrens wurden stabile Latices mit monodisperser Teilchengrössenverteilung erhalten. Durch Verwendung von Cyclodextrinen als Löslichkeitsvermittler konnten fluorierte Methacrylate in wässriger Lösung in fast quantitativer Ausbeute homo- bzw. mit Styrol copolymerisiert werden, während bei Abwesenheit von Cyclodextrin keine bzw. nur geringe Umsätze erzielt wurden. Weiterhin ließen sich auch sehr unterschiedliche Monomerpaare wie 1H,1H,2H,2H-Perfluordecylacrylat mit Stearylmethacrylat in wässriger Phase unter Verwendung von Cyclodextrin copolymerisieren. Ein ebenfalls gegensätzliches Monomerenpaar, das sich als Cyclodextrin-Komplex in hohen Ausbeuten und zu hohen Molekulargewichten copolymerisieren ließ, war Natrium-4-(acrylamido)-phenyldiazosulfonat und Styrol, dessen Copolymerisation bislang nur in org. Lösemittelgemischen möglich war. In der Synthese leitfähiger Polymere konnte ein neuer, umweltfreundlicher Weg zur Herstellung von Polyheterocyclen durch oxidative Polymerisation der komplexierten Monomere in Wasser, wie z.B. 3,4-Ethylendioxythiophen oder Pyrrol, die ihre Anwendung zur Herstellung leitfähiger Polymere finden, erarbeitet werden.Zur Variation der Polymereigenschaften wurde auch erstmalig die neue Substanzklasse von 2H-Benzo[5,6][1,4]dioxino[2,3-c]pyrrol-Derivaten synthetisiert.

Nukleon-Nukleon Korrelationen in 12 C

Am Mainzer Mikrotron MAMI wurden Messungen zur Untersuchungvon Korrelationenzwischen Nukleonen im Atomkern unternommen. Dazu wurden miteinem hochauflösendenSpektrometer zusammen mit einer 4-Pi BGO-Kristallkugel diehadronischenEndzust'ande direkt vermessen. Der inklusiveWirkungsquerschnitt der Reaktion12C(e,e') wurde im Bereich 30 MeV <= omega <= 480 MeVvollst'andig vermessen.Im Energie'ubertragsbereich 170 MeV <= omega <= 280 MeV (DipRegion)wurden Wirkungsquerschnitte der Reaktionen12C(e,e'p) und 12C(e,e'pp) gemessen und mit den Rechnungender kerntheoretischen Gruppender Universit'aten Gent und Valencia verglichen.Die Messungen der Reaktion 12C(e,e') und 12C(e,e'p) zeigten,da's die Absorption desvirtuellen Photons an einem Proton-Neutron-Paar und diePionproduktiongen'ugen, um die Hauptst'arke des Wirkungsquerschnitts inder Dip Region zubeschreiben.Die Messungen der Reaktion 12C(e,e'pp) wiesen dasHerausschlagen zweier Protonenaus den Schalen von 12C nach, und zeigten, da's daskorrelierte Protonenpaar im Kern als S-Zustand vorliegt. Eswurden aber auchHinweise auf Einfl'usse der Reaktion des initialen Paaresmit demRestkern erkannt. Die Messungen zeigten weiterhin, da's dieh'ochsteSensitivit'at f'ur Korrelationsmodelle in dersuperparallelen Kinematikerreicht wird. Die beste 'Ubereinstimmung mit den Datenlieferte dabei eineRechnung basierend auf einer G-Matrix Korrelationsfunktion.

Identifikation des Gruppe I Introns CDISt1 in offenen Leserastern des Clostridium difficile Genoms und dessen Charakterisierung als chimäres genetisches Element

Im tcdA-Gen des Clostridium difficile Stammes C34 wurde eine Insertion mit einer Größe von 1975 bp lokalisiert. Der als CdISt1 bezeichneten Insertion konnten charakteristische Merkmale von Gruppe I Introns und von Insertionselementen zugewiesen werden. Dem im 5’ Bereich gelegenen Anteil ließen sich die Intron-spezifischen Eigenschaften zuordnen, im 3’ Anteil wurden zwei offene Leseraster gefunden, die hohe Homologien zu Transposasen der IS605 Familie hatten. Funktionelle Analysen belegten die Spleißaktivität des chimären Ribozymes. CdISt1 konnte in mehren Kopien in allen untersuchten C. difficile Stämmen nachgewiesen werden. In anderen clostridialen Spezies konnte das Gruppe I Intron bislang nicht vorgefunden werden. Der Integrationsort in C. difficile war in allen untersuchten Fällen immer ein offenes Leseraster. Bislang waren Gruppe I Introns noch nie in bakteriellen offenen Leserastern beschrieben worden. Es kann angenommen werden, dass der chimäre Aufbau des Ribozymes die Integration in bakterielle offene Leseraster ermöglicht. Dabei wäre für die Spleißaktivität der Gruppe I Intron Anteil maßgeblich, die Mobilität würde über den IS Element Anteil vermittelt. Im Rahmen der Dissertationsarbeit konnten erste experimentelle Hinweise erbracht werden, dass das chimäre Ribozym an der evolution clostridialer Proteine beteiligt sein kann, wovon seinen Wirt C. difficile entsprechend profitieren würde.An insertion of 1975 bp is situated in the tcdA-gene of Clostridium difficile strain C34. The insertion was designated as CdISt1 and it had characteristics of group I introns and insertion elements. The group I characteristcs could be found in the 5’ area of the genetic element, in the 3’ area two open reading frames were located with high homologies to transposases of the IS605 family. Functional studies could proof the splicing activity of the ribozyme. CdISt1 could be found in several copies in all C. difficile strains examined so far. It was absent in other examined clostridial species. In all cases, the integration site in C. difficile was an open reading frame. Up to now, group I introns never were discovered in bacterial open reading frames. It can be assumed that the chimeric characteristics of the ribozyme permit an integration in bacterial open reading frames. The group I intron part would be responsible of the splicing activity, the IS element part could mediate the mobility of the genetic element. First experimental evidences point to a possible involvement of the chimeric ribozyme in the evolution of clostridial proteins, so the host C. difficile could benefit from its presence.

Synthese, 11 C- und 18 F-Markierung und Evaluierung von Repaglinid-Derivaten zur Quantifizierung der pankreatischen beta-Zell-Masse in vivo mittels PET

Diabetes mellitus umfasst eine heterogene Gruppe von Stoffwechselfunktionsstörungen, die durch hohe Blut-Glukose-Werte gekennzeichnet sind. Zwei Haupttypen von Diabetes mellitus wurden definiert: Typ 1- und Typ 2-Diabetes. Repaglinid ist ein neuer, schnell wirksamer, bei Typ 2-Diabetikern eingesetzter prandialer Glukose-Regulator mit einer kurzen Plasmahalbwertszeit (<1 Stunde) und der erste Vertreter der Carbamoylmethylbenzoesäure Familie, der in klinischen Studien getestet wurde. Die 18F- und 11C-markierten Repaglinid-Derivate (S)-2-(2-[18F]Fluorethoxy)-4-((3-methyl-1-(2-piperidin-1-yl-phenyl)-butylcarbamoyl)-methyl)-benzoesäure ([18F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinid) und (S)-2-([11C]Methoxy)-4-([3-methyl-1-(2-piperidin-1-yl-phenyl)-butyl-carba-moyl]-benzoesäure ([11C]Methoxy-desethoxy-Repaglinid) wurden als potentielle Tracer für die nicht-invasive Quantifizierung des Sulfonylharnstoffrezeptor-Typ1-Status (SUR-1) der Insulin-sezernierenden -Zellen mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) synthetisiert. [18F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinide konnte in einer radiochemischen Ausbeute (RCA) von 20% nach 135 Minuten mit einer radiochemischen Reinheit >98% unter Verwendung des sekundären Markierungsvorläufers 2-[18F]Fluorethyltosylat erhalten werden. Die spezifische Aktivität lag im Bereich von 50-60 GBq/µmol. Für die radioaktive Synthese des [11C]Methoxy-desethoxy-Repaglinids wurde der sekundäre Markierungsvorläufer [11C]Methyliodid verwendet. Der 11C-Radiotracer wurde in einer RCA von 35% (bezogen auf [11C]CO2) mit einer spezifischen Aktivität von 40-70 GBq/µmol erhalten. Um die Eigenschaften des fluorierten sowie des methoxylierten Repaglinids zu charakterisieren, wurde die Affinität beider Verbindungen zum humanen SUR-1 evaluiert. [19F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinid und Methoxy-desethoxy-Repaglinid induzierten Verdrängungskurven mit Hill-Koeffizienten nahe 1 und ergaben Dissotiationskonstanten (KD) von 142 nM beziehungsweise 83 nM - vergleichsweise geringe Verluste relativ zu Original-Repaglinid. Die biologische Aktivität wurde mittels Insulin-Sekretionstests an isolierten Ratten-Inselzellen gezeigt und war ebenfalls mit der des Repaglinids vergleichbar. Schließlich wurde die Biodistribution des [18F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinids in gesunden Sprague-Dawley-Ratten durch Messung der Konzentration der Verbindung in verschiedenen Organen nach intravenöser Injektion untersucht. Das pankreatische Gewebe zeigte im Zeitintervall zwischen 10 und 30 Minuten nach Injektion eine stabile Akkumulation von etwa 0.12% der injizierten Dosis. 50% dieser Tracer-Akkulmulation konnten durch zusätzliche Injektion von nicht-radioaktiv-markiertem Repaglinid verdrängt werden, was auf eine mögliche Eignung des [18F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinids für in vivo-Untersuchungen mittels PET schließen lässt. Eine erste humane PET-Studie zeigte zwar ebenfalls eine stabile, allerdings nur geringere Akkumulation von [18F]Fluorethoxy-desethoxy-Repaglinid im Pankreas und eine überproportional hohe Aktivitätsanreicherung in der Leber. Die Radioaktivitäts-akkumulation im Blut fiel nach wenigen Minuten unter die des Pankreas.

Structural and functional analysis of the hepatitis C virus non-structural protein 5A

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein umhülltes RNA Virus aus der Familie der Flaviviridae. Sein Genom kodiert für ein ca. 3000 Aminosäuren langes Polyprotein, welches co- und posttranslational in seine funktionellen Einheiten gespalten wird. Eines dieser viralen Proteine ist NS5A. Es handelt sich hierbei um ein stark phosphoryliertes Protein, das eine amphipatische α-Helix im Amino-Terminus trägt, welche für die Membran-Assoziation von NS5A verantwortlich ist. Welche Rolle die Phosphorylierung für die Funktion des Proteins spielt, bzw. welche Funktion NS5A überhaupt ausübt, ist zur Zeit noch unklar. Beobachtungen lassen Vermutungen über eine Funktion von NS5A bei der Resistenz infizierter Zellen gegenüber Interferon-alpha zu. Weiterhin wird vermutet, das NS5A als Komponente des membranständigen HCV Replikasekomplexes an der RNA Replikation beteiligt ist. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Funktion von NS5A für die RNA Replikation zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde eine Serie von Phosphorylierungsstellen-Mutanten generiert, die auf Ihre Replikationsfähigkeit und den Phosphorylierungsstatus hin untersucht wurden. Wir fanden, dass bestimmte Serin-Substitutionen im Zentrum von NS5A zu einer gesteigerten RNA Replikation führten, bei gleichzeitig reduzierter NS5A Hyperphosphorylierung. Weiterhin studierten wir den Einfluß von Mutationen in der Amino-terminalen amphipatischen α-Helix von NS5A auf die RNA-Replikation, sowie Phosphorylierung und subzelluläre Lokalisation des Proteins. Wir fanden, dass geringfügige strukturelle Veränderungen der amphipatischen Helix zu einer veränderten subzellulären Lokalisation von NS5A führten, was mit einer reduzierten oder komplett inhibierten RNA Replikation einherging. Zudem interferierten die strukturellen Veränderungen mit der Hyperphosphorylierung des Proteins, was den Schluß nahe legt, dass die amphipatische Helix eine wichtige strukturelle Komponente des Proteins darstellt, die für die korrekte Faltung und Phosphorylierung des Proteins essentiell ist. Als weitere Aspekte wurden die Trans-Komplementationsfähigkeit der verschiedenen viralen Komponenten des HCV Replikasekomplexes untersucht, sowie zelluläre Interaktionspartner von NS5A identifiziert. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit, dass NS5A eine wichtige Rolle bei der RNA-Replikation spielt. Diese Funktion wird wahrscheinlich über den Phosphorylierungszustand des Proteins reguliert.

Regulation der Zeaxanthin- und der Diatoxanthin-Epoxidase in Chlorophyll a/b- und Fucoxanthin-Chlorophyll a/c-haltigen Pflanzen

In der vorliegenden Arbeit wird der Vx-Zyklus und der Ddx-Zyklus unterschiedlicher Pflanzen hinsichtlich ihrer Regulation untersucht. Es konnte an Hand von in vivo Messungen gezeigt werden, dass bei zwei Kieselalgen unterschiedlicher Ordnung (Pennales bzw. Centrales) und einer Haptophyte mit Ddx-Zyklus die Dtx-Epoxidase delta-pH-reguliert ist. Im Gegensatz dazu steht die nicht-regulierte Zx-Epoxidase des Vx-Zyklus einer Raphidophyceae, einer Grünalge und einer aquatischen Höheren Pflanze. Es konnte gezeigt werden, dass der Grund für diese unterschiedliche Regulation der beiden Epoxidasen die verschiedenen Quench-Eigenschaften der Pigmente Dtx bzw. Zx ist. Durch parallele Messungen des NPQ und des De-Epoxidierungsgrads wurde deutlich, dass Zx zum Aufbau eines Quenching direkt den im Licht aufgebauten delta-pH benötigt, während Dtx alleine ausreichend ist, um ein Quenching zu verursachen. Bei diesen in vivo Messungen wurde außerdem deutlich, dass die Aktivitäten der untersuchten Epoxidasen große Unterschiede aufweisen. Diese sind abhängig von der entsprechenden Pigmentierung des jeweiligen Lichtsammelsystems, stehen also in Zusammenhang mit den Carotinoidbiosynthesen. Es konnte gezeigt werden, dass bei allen untersuchten Organismen, die eine Xanthophyll-dominierte Antenne mit Fx als Massenpigment enthielten, die Umsatzraten der Epoxidase sehr hoch waren, im Gegensatz zu Chl-dominierten Antennen. Nach diesen Erkenntnissen wurde die Dtx-Epoxidase weiter untersucht und so erstmalig durch Western-Blotting identifiziert. Es ergaben sich, allerdings erst nach zusätzlicher Proteinstabilisierung, zwei Signale, eins bei 60 kDa, das andere bei 57 kDa. Hierbei ist nach wie vor unklar, warum das Antiserum zwei Signale lieferte und ob es sich dabei um Isoformen, um anderweitige Modifizierungen, oder um eine Kreuzreaktion handelt. Auch der Mechanismus der delta-pH-Regulation der Dtx-Epoxidase konnte trotz in vivo und in vitro durchgeführter Studien nicht endgültig geklärt werden. Allerdings konnten verschiedene Mechanismen, wie z.B. eine direkte pH-Abhängigkeit des Enzyms, eine Regulation durch Reduktion und Oxidation oder durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung, auf Grund der Daten falsifiziert werden. Es konnte schließlich die Regulation mit Hilfe eines transmembranen Rezeptors als das einzige, mit allen Daten konsistente Regulationsmodell vorgeschlagen werden.

RNA-Strukturen im Hepatitis-C-Virus und ihre Bedeutung für Translation und Replikation

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist ein umhülltes Virus aus der Familie der Flaviviridae. Es besitzt ein Plusstrang-RNA Genom von ca. 9600 Nukleotiden Länge, das nur ein kodierendes Leseraster besitzt. Das Genom wird am 5’ und 3’ Ende von nicht-translatierten Sequenzen (NTRs) flankiert, welche für die Translation und vermutlich auch Replikation von Bedeutung sind. Die 5’ NTR besitzt eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), die eine cap-unabhängige Translation des ca. 3000 Aminosäure langen viralen Polyproteins erlaubt. Dieses wird ko- und posttranslational von zellulären und viralen Proteasen in 10 funktionelle Komponenten gespalten. Inwieweit die 5’ NTR auch für die Replikation der HCV RNA benötigt wird, war zu Beginn der Arbeit nicht bekannt. Die 3’ NTR besitzt eine dreigeteilte Struktur, bestehend aus einer variablen Region, dem polyU/UC-Bereich und der sogenannten X-Sequenz, eine hochkonservierte 98 Nukleotide lange Region, die vermutlich für die RNA-Replikation und möglicherweise auch für die Translation benötigt wird. Die genuae Rolle der 3’ NTR für diese beiden Prozesse war zu Beginn der Arbeit jedoch nicht bekannt. Ziel der Dissertation war deshalb eine detaillierte genetische Untersuchung der NTRs hinsichtlich ihrer Bedeutung für die RNA-Translation und -Replikation. In die Analyse mit einbezogen wurden auch RNA-Strukturen innerhalb der kodierenden Region, die zwischen verschiedenen HCV-Genotypen hoch konserviert sind und die mit verschiedenen computer-basierten Modellen vorhergesagt wurden. Zur Kartierung der für RNA-Replikation benötigten Minimallänge der 5’ NTR wurde eine Reihe von Chimären hergestellt, in denen unterschiedlich lange Bereiche der HCV 5’ NTR 3’ terminal mit der IRES des Poliovirus fusioniert wurden. Mit diesem Ansatz konnten wir zeigen, dass die ersten 120 Nukleotide der HCV 5’ NTR als Minimaldomäne für Replikation ausreichen. Weiterhin ergab sich eine klare Korrelation zwischen der Länge der HCV 5’ NTR und der Replikationseffizienz. Mit steigender Länge der 5’ NTR nahm auch die Replikationseffizienz zu, die dann maximal war, wenn das vollständige 5’ Element mit der Poliovirus-IRES fusioniert wurde. Die hier gefundene Kopplung von Translation und Replikation in der HCV 5’ NTR könnte auf einen Mechanismus zur Regulation beider Funktionen hindeuten. Es konnte allerdings noch nicht geklärt werden, welche Bereiche innerhalb der Grenzen des IRES-Elements genau für die RNA-Replikation benötigt werden. Untersuchungen im Bereich der 3’ NTR ergaben, dass die variable Region für die Replikation entbehrlich, die X-Sequenz jedoch essentiell ist. Der polyU/UC-Bereich musste eine Länge von mindestens 11-30 Uridinen besitzen, wobei maximale Replikation ab einer Länge von 30-50 Uridinen beobachtet wurde. Die Addition von heterologen Sequenzen an das 3’ Ende der HCV-RNA führte zu einer starken Reduktion der Replikation. In den hier durchgeführten Untersuchungen zeigte keines der Elemente in der 3’ NTR einen signifikanten Einfluss auf die Translation. Ein weiteres cis aktives RNA-Element wurde im 3’ kodierenden Bereich für das NS5B Protein beschrieben. Wir fanden, dass Veränderungen dieser Struktur durch stille Punktmutationen die Replikation hemmten, welche durch die Insertion einer intakten Version dieses RNA-Elements in die variable Region der 3’ NTR wieder hergestellt werden konnte. Dieser Versuchsansatz erlaubte die genaue Untersuchung der für die Replikation kritischen Strukturelemente. Dadurch konnte gezeigt werden, dass die Struktur und die Primärsequenz der Loopbereiche essentiell sind. Darüber hinaus wurde eine Sequenzkomplementarität zwischen dem Element in der NS5B-kodierenden Region und einem RNA-Bereich in der X-Sequenz der 3’ NTR gefunden, die eine sog. „kissing loop“ Interaktion eingehen kann. Mit Hilfe von gezielten Mutationen konnten wir zeigen, dass diese RNA:RNA Interaktion zumindest transient stattfindet und für die Replikation des HCV essentiell ist.

Endogene DNA-Schädigung als Ursache genetischer Instabilität

Zusammenfassung Diese Arbeit beschreibt Untersuchungen über die zellulären Mechanismen, die zur Bildung dieser DNA-Schäden führen, sowie über die biologischen Auswirkungen dieser Schäden. Die Untersuchungen zu Uracil in der DNA wurden in ung-knockout-MEFs und Mäusen durchgeführt, die es erlauben, die Konsequenzen eines Ausfalls der wichtigsten Reparaturglykosylase für Uracil zu beleuchten. Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Akkumulation von Uracil in den ung-/--Mausfibroblasten im Vergleich zum Wildtyp. In frisch isolierten Leber- und Milzzellen der Mäuse konnte dieser genotypspezifische Unterschied, wenn auch weniger ausgeprägt, ebenso beobachtet werden, nicht jedoch in reifen Spermien. Dieser gewebespezifische Unterschied und die quantitativ stärker ausgeprägte Akkumulation in ung-/--Mausfibroblasten im Vergleich zu den Mäusegeweben gab Anlass zur Vermutung, dass die Proliferation der Zellen für den Haupteintrag an Uracil in die DNA verantwortlich ist. Erstmals konnte in Versuche mit konfluenten (nicht mehr proliferierenden) ung-/--Mausfibroblasten gezeigt werden, dass nicht die spontane hydrolytische Desaminierung von Cytosin, sondern der Fehleinbau von dUMP während der DNA-Replikation die Hauptquelle für Uracil in der DNA von Säugerzellen darstellt. Da der Uracilmetabolismus ein wichtiges Target in der Chemotherapie ist, lag es nahe, das zur Verfügung stehende ung-knockout-Modell der MEFs zur Untersuchung mit Fluorpyrimidinen, die als Zytostatika verwendet werden, einzusetzen. Da bisher die Ursachen der beobachteten Apoptose der Tumorzellen und aller anderen metabolisch hochaktiven Zellen eines behandelten Organismus noch nicht vollständig verstanden ist, wurden diese Zellen mit verschiedenen Fluorpyrimidinen behandelt, die als Thymidylatsynthasehemmer die de novo Synthese von Thymidin unterbinden. Es konnte gezeigt werden, dass ung-/- Mausfibroblasten, im Gegensatz zu ung+/+ Mausfibroblasten, verstärkt Uracil in der DNA akkumulieren. Obwohl die ung+/+ Mausfibroblasten keine erhöhten Uracil-Spiegel in der DNA aufwiesen, zeigten sie bei Inkubation mit einem der beiden Thymidylatsynthasehemmern, 5-Fluoruracil (5-FU), die gleiche Sensitivität in einem nachfolgenden Proliferationsversuch wie die ung-/- Mausfibroblasten. Dies lässt darauf schließen, dass weder Reparatur noch Einbau von Uracil in die DNA für die beobachtete Toxizität dieser Zytostatika notwendig sind. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung des DNA-schädigenden Potenzials endogener ROS, die aus dem Fremdstoffmetabolismus stammen. Dazu wurden V79-Zellen verwendet, die mit dem humanen Enzym Cytochrom 2E1 (CYP2E1) transfiziert wurden (V79 CYP2E1) sowie Zellen, die ebenfalls durch Transfektion das humane Enzym Cytochromreduktase (auch Oxidoreduktase genannt) überexprimieren (V79 hOR). Beide Enzyme sind zusammen an der Hydroxylierung von Fremdstoffen beteiligt, bei der die Reduktion von molekularem Sauerstoff durch Übertragung von zwei Elektronen notwendig ist. Wird anstatt zweier Elektronen in Folge nur eines auf den Sauerstoff übertragen, so führt dieser von der Substratoxygenierung enkoppelte Vorgang zur Bildung von Superoxid. Daher galt es zu klären, ob das so erzeugte Superoxid und daraus gebildete ROS in der Lage sind, die DNA zu schädigen. Es konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von CYP2E1 nicht zu einem erhöhten basalen Gleichgewichtsspiegel oxidativer DNA-Schäden führt und die Metabolisierung von Ethanol durch dieses Enzym ebenfalls keine DNA-Modifikationen verursacht. Die Überexpression der Cytochromreduktase hingegen führte gegenüber dem Wildtyp zu einem erhöhten basalen Gleichgewichtsspiegel oxidativer Basenmodifikationen nach Depletion von Glutathion, einem wichtigen zellulären Antioxidans. Im Mikrokerntest, der gentoxische Ereignisse wie Chromosomenbrüche in Zellen aufzeigt, zeigte sich schon ohne Glutathion-Depletion eine doppelt so hohe Mikrokernrate im Vergleich zum Wildtyp. In weiteren Versuchen wurden die V79-hOR-Zellen mit dem chinoiden Redoxcycler Durochinon inkubiert, um zu untersuchen, ob das vermutlich durch die Reduktase vermittelte Redoxcycling über Generierung von ROS in der Lage ist, einen oxidativen DNA-Schaden und Toxizität zu verursachen. Hier zeigte sich, dass die Überexpression der Reduktase Voraussetzung für Toxizität und den beobachteten DNA-Schaden ist. Die Wildtyp-Zellen zeigten weder einen DNA-Schaden noch Zytotoxizität, auch eine zusätzliche Glutathion-Depletion änderte nichts an dem Befund. Die V79-hOR-Zellen hingegen reagierten auf die Inkubation mit Durochinon mit einer konzentrationsabhängigen Zunahme der Einzelstrangbrüche und oxidativen Basenmodifikationen, wobei sich der DNA-Schaden durch vorherige Glutathion-Depletion verdoppeln ließ.

Die 18 F-Fluorierung verschiedener Aminosäuren als Tracer für die Tumor-Diagnostik mittels Positronen-Emissions-Tomographie

Die Zielsetzung dieser Arbeit war die Synthese und Markierung, sowie die in vitro- und in vivo-Evaluierung zweier markierter Aminosäure. Es wurden die PET-Tumor-Tracer C1-(2-[18F]Fluoreth- ylamino)-asparagin und S-2-Amino-4-[18F]fluor-butansäure synthetisiert. Die Markierung zum C1-(2-[18F]Fluorethylamino)-asparagin wurde mit 2-[18F]Fluorethylamin als Precursor durchgeführt. Ausgehend von N,N-Dibenzyl-(2-bromethyl)-amin wurde zunächst N,N-Dibenzyl-(2-[18F]fluorethyl)-amin in einer nukleophilen Substiution mit [18F]Fluorid in Acetonitril bei 80 °C mit einer Reaktionsdauer von 5 min dargestellt. Zur Abtrennung überschüssigen [18F]Fluorids wurde das Roh-Produkt auf einer Sep-Pak Plus Kartusche (C18) fixiert und mit Acetonitril eluiert. Die Abspaltung der Benzyl-Schutzgruppen erfolgte durch die Zugabe von Pd/C zu dem eluierten N,N-Dibenzyl-(2-[18F]fluorethyl)-amin und Behandelung der Lösung im leichten Wasserstoffstrom. Im finalen Aufreinigungsschritt wird der Katalysator Pd/C mittels eines Membranfilters abgetrennt. Das 2-[18F]Fluorethylamin wird im Sauren in das Amino-Salz überführt und im Vakuum vom Lösungsmittel befreit. Die Markierung zum C1-(2-[18F]Fluorethylamino)-asparagin wurde in DMF durchgeführt. Die höchsten Ausbeuten werden nach 4 min bei 60 °C erhalten. Die Abspaltung der Schutzgruppe erfolgt durch Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur in 8 min. Die Aufreinigung des C1-(2-[18F]Fluorethylamino)-asparagin mittels HPLC und Festphasenextraktion liegt das Produkt in einer isotonischne isotonischen Kochsalzlösung vor. Die in vitro-Versuche wurden mit C1-(2-[18F]Fluorethylamino)-asparagin an 5 verschiedenen Zelllinen durchgeführt, 3 Plattenepitele und 2 Melanome. Hierbei konnte eine erhöhte Akkumulation von C1 -(2-[18F]Fluorethylamino)-asparagin beobachtet werden, die innerhalb von 20 min einen konstanten Wert erreicht. Ein Blockade-Experiment zeigte, dass sich die Aufnahme von C1 -(2-[18F]Fluorethylamino)-asparagin durch gesättinge Asparagin-Lösung bei den Plattenepitelen gar nicht und bei den Melanomen nur leicht vermindern ließ. Da die Aufnahme von C1-(2-[18F]Fluorethylamino)-asparagin in die Zellen höher war als bei FDG bei dem gleichen Versuchsaufbau, wurden in vivo-Versuche angesetzt. Die in vivo-Versuche an Sprague Dawley Ratten mit C1-(2-[18 F]Fluorethylamino)-asparagin zeigten keine messbare Anreicherung von C1-(2-[18F]Fluorethylamino)-asparagin in Tumoren. Fast die komplette Aktivität wurde in der Niere und Blase wiedergefunden. Die Synthese von S-2-Amino-4-[18F]fluor-butansäure wurde über stereodirigierende Auxilliare realisiert. Dazu wurden die geeignetsten Auxillare ausgewählt und auf ihre Eignung verglichen. Der Vergleich der stereodirigierenden Auxilare zeigte, dass das (1R,2R,5R)-2-Hydroxy-2,6,6-trimethyl- bicyclo[3.1.1]hept-3-ylidenamino)-essigsäure tert.-butylester (Laue-Auxillar) am geeignetesten ist. Die 18F-Markierung von S-2-Amino-4-[18F]fluor-butansäure wurde so optimiert, dass eine möglichst hohe stereochemische Reinheit des Produktes erzielt wird. Die optische Reinheit von S-2-Amino-4-[18 F]fluor-butansäure wurde mit > 93 % ee berechnet. Die Synthese des Markierungsvorläufers wurde ausgehend vom Laue-Auxilliar aufgebaut. Als Abgangsgruppe hat sich die Tosylgruppe besonders bewährt. Sie lässt sich unter besonders schonenden Bedingungen in den säurelabilen (1R,2R,5R)-4-Hydroxy-2-(2-hydroxy-2,6,6-trimethyl-bi- cyclo[3.1.1]hept-3-ylidenamino) butansäure tert.-butylester einführen. Bei der 18F-Markierung von S-2-Amino-4-[18F]fluor-butansäure mittels n.c.a. [18F]Fluorid hat sich die Wahl des Basensystems als besonders wichtig erwiesen. Die maximale Ausbeuten von 55% wurde mit Oxalat als Basensystem in Acetonitril bei 80 °C und einer Reaktionszeit von 15 min erzielen. Die Abspaltung der Schutzgruppen und die Abtrennung des Produktes wird in mehreren Schritten durchgeführt einschließlich einer HPLC-Abtrennung. Es wird nach 150 min Synthesedauer das gereinigte S-2-Amino-4-[18F]fluor-butansäure in isotonischer Kochsalzlösung mit einer Ausbeute von > 10 % RCA erhalten. Bei in vivo-Versuchen an Sprague Dawley Ratten reicherte sich der Hauptteil der Aktivität in der Niere an und nur weniger als ein halbes Prozent der applizierten Aktivität fand sich in den Tumoren wieder. Nach 10 min wurde ein maximaler Wert erreicht, der sich bis zum Ende der Messung nicht verändert. Das Verhältnis von Tumoraktivität zu unspezifisch-gebundener Aktivität betrug 2,2. Damit liegt das Verhältnis im Bereich der meisten klinisch eingesetzten PET-Tumor-Tracer wie dem des O-(2-[18F]Fluorethyl)-L-tyrosin mit 1,5.

Struktur- und Funktionsuntersuchungen des C 4-Dicarboxylat-Sensors DcuS von Escherichia coli

Das Zweikomponentensystem DcuSR reguliert die Expression der Gene der anaeroben Fumaratatmung in E. coli in Abhängigkeit von externen C4-Dicarbonsäuren. Die membranständige Histidinkinase DcuS detektiert den Reiz und leitet ihn über die Membran an den Responseregulaor DcuR weiter, der die Aktivität der Zielgene reguliert. Das Substratspektrum von DcuS wurde näher untersucht und strukturelle Eigenschaften der Substrate sowie ihre Affinität zu DcuS bestimmt. Es wird vermutet, dass Histidinkinasen im aktiven Zustand als Dimere oder höhere Oligomere vorliegen. Der Oligomerisierungszustand von DcuS in der Membran wurde mittels EPR-Spektroskopie untersucht. Es wurden funktionelle Cysteinmutanten von DcuS hergestellt, die nur an bestimmten Positionen der periplasmatischen Domäne Cysteinreste, aber sonst keine weiteren Cysteinreste, enthielten. Die Proteine wurden isoliert, über die Cysteinreste mit Nitroxiden markiert und in Liposomen rekonstituiert. Erste EPR-Messungen zeigten, dass rekonstituiertes DcuS in einem geordneten Zustand in der Membran vorliegt, der diskrete Abstände zwischen den Monomeren aufweist. Die Struktur von rekonstituiertem DcuS in der Membran soll durch Festkörper-NMR aufgeklärt werden. Ein geeignetes C-terminal verkürztes Konstrukt, DcuS-PD/PAS wurde zu diesem Zweck hergestellt. Das Protein ließ sich in hoher Reinheit isolieren und konnte wieder in Liposomen rekonstituiert werden. Vorbereitende NMR-Messungen zeigten, dass eine Strukturaufklärung an diesem Protein möglich ist. Weitere Strukturuntersuchungen werden zur Zeit durchgeführt.

Carrier und Regulatoren des Tartrat- und C 4-Dicarboxylatstoffwechsels von Escherichia coli

In E. coli dient L-Tartrat als Elektronenakzeptor während des anaeroben Wachstums und wird schließlich zu Succinat umgesetzt. Der sekundäre Carrier TtdT (YgjE) von E. coli ist ein Antiporter, der die Aufnahme von L-Tartrat im elektroneutralen Austausch gegen intrazelluläres Succinat katalysiert. TtdT besitzt eine hohe Substratspezifität und katalysiert den Transport von L-Tartrat und Succinat, nicht aber von meso- und D-Tartrat. Das Gen ttdT (ygjE) bildet mit den Genen ttdA und ttdB, welche für die L-Tartratdehydratase kodieren, ein Operon. Das benachbarte Gen ttdR (ygiP) kodiert für TtdR (YgiP), einen Tartrat-spezifischen Regulator vom LysR-Typ. TtdR reguliert die L-Tartratfermentation direkt durch Induktion des ttdABT-Operons und durch Autoregulation. TtdR stellt damit den Tartrat-spezifischen Regulator dar, der auf die Expression des ttdR ttdABT-Genclusters spezialisiert ist. Dagegen reguliert DcuSR, das Zweikomponentensystem für C4-Dicarboxylate, die L-Tartratfermentation indirekt durch die Regulation der Gene für die Fumaratatmung. YfaV und YeaV sind weitere potentielle Tartrattransporter. YfaV katalysiert vermutlich den Transport von C4-Dicarboxylaten, einschließlich Tartrat, unter aeroben und anaeroben Bedingungen. YeaV wird nur in Anwesenheit von L- und meso-Tartrat und unter aeroben Bedingungen gebildet. Die yeaUVWX-Gene unterliegen der trankriptionellen Regulation durch YeaT, dessen Gen yeaT vor yeaU liegt. YeaT ist wie TtdR ein Tartrat-spezifischer Regulator und besitzt eine signifikante Ähnlichkeit zu TtdR.

Optimised polyolefin branch quantification by 13 C NMR spectroscopy

Quantitative branch determination in polyolefins by solid- and melt-state 13C NMR has been investigated. Both methods were optimised toward sensitivity per unit time. While solid-state NMR was shown to give quick albeit only qualitative results, melt-state NMR allowed highly time efficient accurate branch quantification. Comparison of spectra obtained using spectrometers operating at 300, 500 and 700 MHz 1H Larmor frequency, with 4 and 7~mm MAS probeheads, showed that the best sensitivity was achieved at 500 MHz using a 7 mm 13C-1H optimised high temperature probehead. For materials available in large quantities, static melt-state NMR, using large diameter detection coils and high coil filling at 300 MHz, was shown to produce comparable results to melt-state MAS measurements in less time. While the use of J-coupling mediated polarisation transfer techniques was shown to be possible, direct polarisation via single-pulse excitation proved to be more suitable for branch quantification in the melt-state. Artificial line broadening, introduced by FID truncation, was able to be reduced by the use of π pulse-train heteronuclear dipolar decoupling. This decoupling method, when combined with an extended duty-cycle, allowed for significant improvement in resolution. Standard setup, processing and analysis techniques were developed to minimise systematic errors contributing to the measured branch contents. The final optimised melt-state MAS NMR method was shown to allow time efficient quantification of comonomer content and distribution in both polyethylene- and polypropylene-co-α-olefins. The sensitivity of the technique was demonstrated by quantifying branch concentrations of 8 branches per 100,000 CH2 for an industrial ‘linear’ polyethylene in only 13 hours. Even lower degrees of 3–8 long-chain branches per 100,000 carbons were able to be estimated in just 24 hours for a series of γ-irradiated polypropylene homopolymers.

Synthese, 18 F-Markierung, 11 C-Markierung und Evaluierung Hydantoin-substituierter Indolcarbonsäuren zur Visualisierung des NMDA-Rezeptorstatus mittels der Positronen-Emissions-Tomographie (PET)

Der N-methyl-D-aspartat-Rezeptor (NMDA), als Vertreter ionotroper Glutamat-Rezeptoren, ist essentiell für physiologische Lern- und Gedächtnisvorgänge und eine krankhafte Überaktivierung wird als potentielle Ursache für eine Reihe von akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen angesehen. Hierbei sind für die akuten Erkrankungen vor allem der Schlaganfall und für die chronischen Erkrankungen Morbus Parkinson sowie die Alzheimer´sche Demenz zu nennen. Durch seine einzigartige spannungsabhängige Mg2+-Blockade und der Notwendigkeit der gleichzeitigen Anwesenheit der endogenen Liganden Glutamat und Glycin zur Rezeptoraktivierung, stellt dieser Rezeptorkomplex daher ein sehr interessantes molekulares Target dar. NMDA-Rezeptor-Antagonisten der Glycin-Bindungsstelle und der verschiedenen allosterischen Bindungsstellen könnten als Neuroprotektiva bei den verschiedenen Krankheiten eine symptomatische Verbesserung bewirken und zur Therapie eingesetzt werden. Eine visuelle Darstellung des Rezeptors im Rahmen von Vorsorgeuntersuchungen ist jedoch derzeit nicht möglich. Zur Visualisierung dieser Prozesse mittels der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) wurden basierend auf einer Hydantoin-substituierten Indol-2-carbonsäure als Leitstruktur, im Rahmen dieser Arbeit Fluorethoxy- und Methoxy-substituierte Derivate dargestellt und in pharmazeutischen und radiopharmazeutischen Studien evaluiert. Dazu wurde die Affinität und Spezifität zum Rezeptor in einem [3H]MDL-105,519 Rezeptorbindungsassay und die Lipophilie als Parameter für die Hirngängigkeit ermittelt. Anhand dieser Resultate wurden geeignete Markierungsvorläufer synthetisiert, welche eine phenolische Hydroxylfunktion besitzen und eine radioaktive Markierung mit den sekundären Markierungsvorläufern 2-[18F]Fluorethyltosylat ([18F]FETos) und [11C]Methyliodid ([11C]CH3I) ermöglichen. Unter Verwendung von 4,6-Dichlor-3-((3-(4-hydroxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäure wurde in einer Einstufenreaktion mit [18F]FETos die Zielverbindung 4,6-Dichlor-3-((3-(4-(2-[18F]fluorethoxy)phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäure in radiochemischen Ausbeuten von 6 % erhalten. Daher wurde eine alternative Markierung des Ethylester-geschützten Derivates 4,6-Dichlor-3-((3-(4-hydroxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäureethylester in einer Zweistufensynthese mit [18F]FETos und [11C]CH3I untersucht. Unter Verwendung dieser Strategie wurden unter optimierten Bedingungen 4,6-Dichlor-3-((3-4-(2-[18F]fluorethoxy)phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäureethylester und 4,6-Dichlor-3-((3-(4-[11C]methoxy-phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)-methyl)-indol-2-carbonsäureethylester in radiochemischen Ausbeuten von 27 – 38 % erhalten. Die anschließende Entfernung der Schutzgruppe führte unter Bildung von Neben- und Zersetzungsreaktionen zu 4,6-Dichlor-3-((3-(4-(2-[18F]fluorethoxy)-phenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäure und 4,6-Dichlor-3-((3-(4-[11C]methoxyphenyl)-2,4-dioxoimidazolidin-1-yl)methyl)-indol-2-carbonsäure in radiochemischen Gesamtausbeuten von 5 – 7 %. Die Überprüfung des biochemischen Konzepts in vivo durch µ-PET-Studien und durch autoradiographische Experimente an Rattenhirnschnitten, deuten auf eine niedrige in vivo-Aktivität hin, welche sich auf eine nicht ausreichende Passage der Blut-Hirn-Schranke zurückführen lässt.

Elaeocarpacae-Alkaloide: flexible Synthese optisch aktiver (-) Elaeokanin C Schlüsselbausteine

Kurzzusammenfassung Elaeocarpacae-Alkaloide: flexible Synthesen optisch aktiver (-) Elaeokanin C Schlüsselbausteine Im Tier- und Pflanzenreich sind Alkaloide weit verbreitet und werden von der Biogenese her als Produkte des Aminosäure-Stoffwechsels angesehen. Die Elaeocarpacae-Alkaloide zählen zu den Indolizidinen, welche durch ein Azabicyclo-[4.3.0]-nonan Grundgerüst charakterisiert sind und erstmals Ende der 60er Jahre des letzten Jahrhunderts aus den Blättern der in Neu Guinea beheimateten Ölbaumgewächse isoliert wurden. Für verschiedene Vertreter dieses Alkaloid-Typs wurden sowohl racemische als auch asymmetrische Totalsynthesen entwickelt. Während für das (+) Elaeokanin C bereits Totalsynthesen existieren, gibt es für das (-) Elaeokanin C bis heute keine asymmetrische Synthese. Als Fernziel der vorliegenden Arbeit wurde die erste Totalsynthese von (-) Elaeokanin C ausgewählt. Der Syntheseplan sieht zunächst den diastereoselektiven Aufbau eines optisch aktiven Schlüsselbausteins mit Naturstoff-Stereotriade im Sinne einer konvergenten ex-chiral-pool Synthese vor. Im Rahmen dieser Arbeit konnte dies durch die Aza-Claisen-Umlagerung realisiert werden. Ausgehend von diesem Schlüsselbaustein wurden verschiedene Synthesewege verfolgt um sowohl das Substitutionsmuster der Seitenkette als auch das des Piperidinsegments vielfältig variieren zu können. Die Einführung der Seitenkette erwies sich durch vielfältige Nachbargruppeneffekte wie die unerwünschte 5-exo-trig Cyclisierung zu einem Pyrrolizidin Derivat als große Hürde. Eine geänderte Synthesestrategie mit einem schrittweisen Aufbau der Kette lieferte schließlich den Baustein, aus dem nun in wenigen Stufen das (-) Elaeokanin C sowie vielfältige Analoga herzustellen sein sollten.

Die Leber als Latenzort des murinen Cytomegalovirus: Identifizierung und Charakterisierung des latent infizierten Zelltyps

Die Untersuchungen der murinen Cytomegalovirus (mCMV) Infektion im BALB/c Mausmodell konzentrierten sich bislang auf die Lunge, da diese einen Hauptort der mCMV Latenz darstellt. Da latentes CMV auch häufig durch Lebertransplantationen übertragen wird, wurde in dieser Arbeit die Leber als ein weiteres medizinisch relevantes Organ der CMV Latenz und Reaktivierung untersucht. Um zunächst die zellulären Orte der mCMV Latenz in der Leber zu ermitteln, wurden verschiedengeschlechtliche Knochenmarktransplantationen (KMT) mit männlichen tdy-positiven Spendern und weiblichen, tdy-negativen Empfängern, mit anschließender mCMV Infektion durchgeführt, um latent infizierte Mäuse mit geschlechtschromosomalem Chimärismus zu generieren. Diese Chimären erlaubten eine Unterscheidung zwischen tdy-positiven Zellen hämatopoetischen Ursprungs und tdy-negativen stromalen und parenchymalen Gewebszellen. Die Separation von Leberzellen der Chimären mittels zentrifugaler Elutriation und anschließender DNA Quantifizierung viraler und zellulärer Genome durch eine quantitative real-time PCR ergab einen ersten Hinweis, dass Endothelzellen ein zellulärer Ort der mCMV Latenz sind. Die darauf folgende immunomagnetische Zelltrennung lokalisierte latente virale DNA in der CD31-positiven Zellfraktion. Die Koexpression von CD31 mit dem endothelzellspezifischen Oberflächenmarker ME-9F1 identifizierte die sinusoidalen Endothelzellen der Leber (LSEC) als die Zellen, die latente virale DNA beherbergen. In den zytofluorometrisch aufgereinigten CD31+/ME-9F1+ LSEC waren bei gleichzeitigem Rückgang der männlichen tdy Markergene virale Genome angereichert, was darauf hinwies, dass Zellen, die virale DNA enthalten, vom Knochenmark-Empfänger stammen. Durch zytofluorometrische Analysen isolierter LSEC konnte eine vom Spender abstammende Subpopulation MHCII+/CD11b+ LSEC identifiziert werden. Anschließende Quantifizierungen viraler DNA aus latent infizierten Mäusen detektierten eine Abnahme viraler Genome mit zunehmender Menge an tdy-positiven Zellen, was beweist, dass MHCII+/CD11b+ LSEC keinen Ort der mCMV Latenz darstellen. Die limiting dilution Untersuchungen der isolierten latent infizierten LSEC ergaben eine Frequenz von einer latent infizierten Zelle unter ~1,9x104 LSEC und eine Anzahl von 7 bis 19 viralen Genomen pro latent infizierter Zelle. Nach 24 Stunden Kultivierung der LSEC konnte mittels quantitativer real-time RT-PCR mit Gesamt-RNA aus LSEC ein Anstieg der Genexpression der immediate early Gene ie1 und ie3 sowie eine Induktion des early Gens e1 gezeigt werden. Eine Erhöhung der transkriptionellen Reaktivierung durch die Inkubation der LSEC mit unterschiedlichen HDAC Inhibitoren konnte allerdings nicht erzielt werden, da sowohl die Menge der isolierten RNA aus behandelten Kulturen, als auch die Anzahl viraler Transkripte im Vergleich zu den unbehandelten Kulturen erniedrigt war. Aufgrund der kurzen Lebensdauer isolierter LSEC in vitro konnte durch Kokultivierungen latent infizierter LSEC zusammen mit murinen embryonalen Fibroblasten keine Virusreaktivierung induziert werden. Im Gegensatz dazu wurden durch den Transfer gereinigter ME-9F1+/CD31+ LSEC aus latent infizierten Spendern in immunsupprimierte Empfänger virale Rekurrenzen in Lungenexplantatkulturen des Rezipienten detektiert. Damit konnten LSEC eindeutig als zellulärer Ort von mCMV Latenz und Reaktivierung in der Leber identifiziert werden.