Development of a harmonised method for the profiling of amphetamine

Résumé : Cette thèse de doctorat est le fruit d'un projet de recherche européen financé par le quatrième programme cadre de la Commission Européenne (DG XII, Standards, Measurement and Testing). Ce projet, dénommé SMT-CT98-2277, a été financé pour la partie suisse par l'Office Fédéral de l'Education et de la Science (OFES, Berne, Suisse). Le but de ce projet était de développer une méthode harmonisée et collaborativement testée pour le profilage des impuretés de l'amphétamine illicite par chromatographie capillaire en phase gazeuse. Le travail a été divisé en sept phases majeures qui concernaient la synthèse de l'amphétamine, l'identification d'impuretés, l'optimisation de la préparation de l'échantillon et du système chromatographique, la variabilité des résultats, l'investigation de méthodes mathématiques pour la classification et la comparaison de profils et finalement l'application de la méthode à des réels échantillons illicites. La méthode résultant de ce travail n'a pas seulement montré que les données étaient interchangeables entre laboratoires mais aussi qu'elle était supérieure en de nombreux points aux méthodes préalablement publiées dans la littérature scientifique. Abstract : This Ph.D. thesis was carried out in parallel to an European project funded by the fourth framework program of the European Commission (DG XII, Standards, Measurement and Testing). This project, named SMT-CT98-2277 was funded, for the Swiss part, by the Federal Office of Education and Science (OFES, Bern, Switzerland). The aim of the project was to develop a harmonised, collaboratively tested method for the impurity profiling of illicit amphetamine by capillary gas chromatography. The work was divided into seven main tasks which deal with the synthesis of amphetamine, identification of impurities, optimization of sample preparation and of the chromatographic system, variability of the results, investigation of numerical methods for the classification and comparison of profiles and finally application of the methodology to real illicit samples. The resulting method has not only shown to produce interchangeable data between different laboratories but was also found to be superior in many aspects to previously published methods.

Development of novel immunotherapies against bladder cancer

Le cancer de la vessie est le deuxième cancer urologique le plus fréquent dans le monde. La plupart des patients (75%) sont initialement diagnostiqués avec un cancer non musculo- invasif. Après résection trans-urétrale, ie traitement standard pour ce type de lésion chez les patients présentant un risque important de récidive/progression consiste en une série d'instillations intravésicales du Bacille de Calmette-Guerin (i.e. le vaccin BCG). Cependant cette "BCG thérapie" est associée à des effets secondaires non négligeables et s'avère inefficace dans 30% des cas, des limitations donc importantes qui soulignent la nécessité de développer des stratégies thérapeutiques alternatives. L'utilisation d'antigènes associés aux tumeurs (TAA) comme vaccin, combinée à une application locale d'immunostimulants sur le site tumoral, est une approche prometteuse en vue de maximiser les réponses immunitaires anti-tumorales localement. Nous montrons que la bactérie vivante atténuée Ty21a, issue du vaccin Vivotif® contre la fièvre typhoïde, peut être utilisée comme immunostimulant intravésical (IVES), mais ce uniquement dans le cas où la bactérie est en phase exponentielle de croissance (Vivotif exp). En effet, l'instillation IVES de Vivotif exp à la suite d'une vaccination par un TAA, un antigène mineur d'histocompatibilité mâle H-Y (Uty), permet d'augmenter de 15 fois le nombre de cellules T CD8 totales et spécifiques de l'antigène dans la vessie. Le recrutement des cellules T est TLR4-dépendent, ce qui suggère un rôle des lipopolysaccharides du Vivotif exp. Par ailleurs, en comparaison avec le contenu bactérien de la capsule de Vivotif, les bactéries en phase exponentielle de croissance permettent également une augmentation préférentielle des chemokines C5/C5a, CXCL1, CXCL2 et CXCL5 dans la vessie, mais pas du nombre de cellules T exprimant les récepteurs apparentés (C5aR et CXCR2). De plus, combiner la vaccination Uty avec le Vivotif exp en IVES permet d'améliorer la survie des souris présentant une tumeur orthotopique de la vessie exprimant l'antigène Uty (lignée tumorale murine MB49). Puisque pour certains cancers, aucun TAA - du moins exprimé à tous les stades tumoraux - n'est identifié, il est nécessaire de développer d'autres approches non vaccinales. Dans une deuxième partie de ce travail de thèse, nous avons donc investigué deux stratégies permettant d'induire une destruction des cellules tumorales, la thérapie génique par gène de suicide, d'une part, et la thérapie photodynamique dans le proche infrarouge (NIR-PDT), d'autre part. Pour appliquer ces thérapies, nous avons utilisé comme vecteur sûr et non toxique une forme non réplicative du virus du « Human Papillomavirus » (HPV) capable de "pseudo-infecter" préférentiellement les souris présentant des tumeurs vésicales (MB49). L'utilisation de pseudovirions (PsV) HPV portant comme gène suicide la thymidine kinase, une enzyme du virus de l'herpès simplex, suivi d'un traitement par la prodrogue Ganciclovir, permet de tuer 90% des cellules MB49 in-vitro ainsi que de ralentir significativement le développement des tumeurs vésicales in-vivo. Par ailleurs, l'emploi de particules pseudo- virales HPV couplées à la phtalocyanine IR700, un pigment photosensible présentant un pouvoir cytotoxique une fois activé, permet de tuer, après application d'une lumière dans le proche infrarouge, quasi 100% des cellules MB49 in-vitro et, plus important, de régresser des tumeurs in-vivo. De façon générale, ce travail de thèse présente des approches thérapeutiques innovantes et prometteuses pour le traitement des patients avec un cancer non musculo-invasif de la vessie. -- Bladder cancer is the second most common urological malignancy in the world. At initial diagnosis, non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC) accounts for 75% of bladder cancer. The standard of care of NMIBC consists of intravesical (IVES) treatments with Bacillus- Calmette-Guerin (BCG) following transurethral resections of the lesions. However, repeated BCG treatments are associated with significant side effects and treatment failure may occur in 30% of the cases, underlying the necessity of alternative therapeutic strategies. The use of tumor-associated antigens (TAA) as vaccines followed by the local application of immunostimulants where the tumor resides is a promising approach to increase anti-tumor immune responses locally. We show that live attenuated Ty21a bacteria used from the vivotif® vaccine against typhoid fever can efficiently be used as IVES immunostimulant, only if bacteria are grown to exponential phase (Vivotif exp). In this condition, IVES immunostimulation after TAA vaccination with a minor histocompatibility male antigen HY (Uty) resulted in more than 15-fold increase of both vaccine-specific and total CD8-T cells in the bladder. T cell recruitment was mediated by TLR-4 suggesting that it was mainly mediated by lipopolysaccharides of Vivotif exp. In addition, these bacteria, as compared to the bacterial content of the vivotif capsule preferentially increased C5/C5a, CXCL1, CXCL2 and CXCL5 chemokines, but not the numbers of T cells expressing the cognate receptors (C5aR and CXCR2). Combination of IVES Vivotif exp with Uty vaccination improved survival of mice with pre-established orthotopic Uty-expressing MB49 murine bladder tumors, as compared to vaccination alone. As known TAA are not identified in all cancers, or not expressed in all stages of the tumor, we further investigated two potent approaches able of initiating tumor-cell destruction, suicide-gene therapy and near-infrared (NIR) photodynamic therapy (PDT). Towards a safe and non-toxic application of these therapies, we used Human Papillomavirus (HPV) replication-defective vectors that were able to preferentially pseudo-infect MB49-tumor bearing mice. HPV pseudovirions (PsV) carrying the Herpex-Simplex virus thymidine kinase suicide-gene followed by treatment with the prodrug Ganciclovir resulted in 90% of MB49 cell-death in-vitro and was able to significantly reduce bladder tumor growth in-vivo. Furthermore, HPV virus-like particles coupled to a NIR phtalocyanine dye, IR700 in combination with specific NIR light led to almost 100% of MB49 cell-death in-vitro and more interestingly, to bladder tumors shrinkage in-vivo. Overall, in this thesis, we offer promising therapeutic approaches for application in NMIBC patients.

Novel therapeutic strategies targeting regulatory T cells and downstream TCR signaling in transplantation

Avec plus de 100000 transplantations d'organes solides (TOS) par année dans le monde, la transplantation d'organes reste actuellement l'un des meilleurs traitements disponibles pour de nombreuses maladies en phase terminale. Bien que les médicaments immunosuppresseurs couramment utilisés soient efficaces dans le contrôle de la réponse immune engendrant le rejet aigu d'une greffe, la survie du greffon à long terme ainsi que la présence d'effets secondaires indésirables restent un enjeu considérable en clinique. C'est pourquoi il est nécessaire de trouver de nouvelles approches thérapeutiques innovantes permettant de contrôler la réponse immunitaire et ainsi d'améliorer les résultats à long terme. L'utilisation des lymphocytes T régulateurs (Treg), suppresseurs naturels de la réponse inflammatoire, a fait l'objet de nombreuses études ces dix dernières années, et pourrait être considérée comme un moyen intéressant d'améliorer la tolérance immunologique de la greffe. Cependant, l'un des obstacles de l'utilisation des Treg comme agent thérapeutique est leur nombre insuffisant non seulement en conditions normales, mais en particulier lors d'une forte réponse immune avec expansion de cellules immunitaires alloréactives. En raison des limitations techniques connues pour l'induction des Treg ex-vivo ou in vitro, nous avons dédié la première partie du travail de thèse à la détermination de l'efficacité de l'induction des Treg in vivo grâce à l'utilisation d'un complexe protéique IL-2/JES6-1 (IL2c). Nous avons montré que l'expansion des Treg par IL2c permettait d'augmenter la survie du greffon sur un modèle murin de transplantation de peau avec mismatch entre le donneur et le receveur pour le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). De plus, nous avons vu qu'en combinant IL2c à une inhibition à court terme de la voie de co-stimulation CD40L-CD40 (anti-CD154/MRl, administré au moment de la transplantation) pour empêcher l'activation des lymphocytes T, il est possible d'induire une tolérance robuste à long terme. Finalement, nos résultats soulignent l'importance de cibler une voie de co-stimulation bien particulière. En effet, l'utilisation d'IL2c combinée au blocage de la co-stimulation CD28-B7.1/2 (CTLA-4 Ig) n'induit qu'une faible prolongation de la survie de la greffe et n'induit pas de tolérance. L'application chez l'humain des traitements induisant la tolérance dans des modèles expérimentaux murins ou de primates n'a malheureusement pas montré de résultats probants en recherche clinique ; une des principales raisons étant la présence de lymphocytes B et T mémoires provenant du systeme d immunité acquise. C est pourquoi nous avons testé si la combinaison d'IL2c et MR1 améliorait la survie de la greffe dans des souris pré¬sensibilisées. Nous avons trouvé qu'en présence de lymphocytes B et T mémoires alloréactifs, l'utilisation d'IL2c et MR1 permettait une amélioration de la survie de la greffe de peau des souris immunocompétentes mais comparé aux souris receveuses naïves, aucune tolérance n'a pu être induite. Toutefois, l'ajout d'un traitement anti-LFA-1 (permettant de bloquer la circulation des lymphocytes T activées) a permis d'améliorer de manière significative la survie de la greffe. Cependant, le rejet chronique, dû à la présence de lymphocytes B activés/mémoires et la production d'anticorps donneur-spécifiques, n'a pas pu être évité. Cibler l'activation des lymphocytes T est la stratégie immunothérapeutique prépondérente après une TOS. C'est pourquoi dans la deuxième partie de cette thèse nous nous sommes intéressés au système de signalisation d'un récepteur des lymphocytes T qui dépend de la paracaspase Malti en tant que nouvelle stratégie immunosuppressive pour le contrôle des lymphocytes T alloréactifs. Nous avons montré que bien que l'inhibition de la signalisation du lymphocyte T en aval de Malti induise une tolérance envers un greffon de peau avec incompatibilités antigéniques mineures, cela ne permet cependant qu'une régulation partielle de l'alloréponse contre des antigènes du CMH. Nous nous sommes aussi intéressés spécifiquement à l'activité protéolytique de Malti. L'inhibition constitutive de l'activité protéolytique de Malti chez les souris Malti-ki s'est révélée délétère pour l'induction de la tolérance car elle diminue la fonction des Treg et augmente l'alloréactivité des cellules Thl. Cependant, lors de l'utilisation d'un inhibiteur peptidique de l'activité protéase de Malti in vitro, il a été possible d'observer une atténuation de l'alloéactivité des lymphocytes T ainsi qu'un maintien de la population des Treg existants. Ces résultats nous laissent penser que des études plus poussées sur le rôle de la signalisation médiée par Malti seraient à envisager dans le domaine de la transplantation. En résumé, les résultats obtenus durant cette thèse nous ont permis d'élucider certains mécanismes immunologiques propres à de nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles dont le but est d'induire une tolérance lors de TOS. De plus, ces résultats nous ont permis de souligner l'importance d'utiliser des modèles davantage physiologiques contenant, notamment en tenant compte des lymphocytes B et T mémoires alloréactifs. -- Organ transplantation remains the best available treatment for many forms of end-stage organ diseases, with over 100,000 solid organ transplantations (SOT) occurring worldwide eveiy year. Although the available immunosuppressive (IS) drugs are efficient in controlling acute immune activation and graft rejection, the off-target side effects as well as long-term graft and patient survival remain a challenge in the clinic. Hence, innovative therapeutic approaches are needed to improve long-term outcome across immunological barriers. Based on extensive experimental data obtained over the last decade, it is tempting to consider immunotherapy using Treg; the natural suppressors of overt inflammatory responses, in promoting transplantation tolerance. The first hurdle for the therapeutic use of Treg is their insufficient numbers in non- manipulated individuals, in particular when facing strong immune activation and expanding alloreactive effector cells. Because of the limitations associated with current protocols aiming at ex-vivo expansion or in vitro induction of Treg, the aim of the first part of this thesis was to determine the efficacy of direct in vivo expansion of Treg using the IL-2/JES6- 1 immune complex (IL2c). We found that whilst IL2c mediated Treg expansion alone allowed the prolonged graft survival of fìlli MHC-mismatched skin grafts, its combination with short-term CD40L-CD40 co-stimulation blockade (anti-CD 154/MR1) to inhibit T cell activation administered at the time of transplantation was able to achieve long-term robust tolerance. This study also highlighted the importance of combining Treg based therapies with the appropriate co-stimulation blockade as a combination of IL2c and CD28-B7.1/2 co- stimulation blockade (CTLA-4 Ig) only resulted in slight prolongation of graft survival but not tolerance. The translation of tolerance induction therapies modelled in rodents into non-human primates or into clinical trials has seldom been successful. One main reason being the presence of pre-existing memory T- and B-cells due to acquired immunity in humans versus laboratory animals. Hence, we tested whether IL2c+MRl could promote graft survival in pre-sensitized mice. We found that in the presence of alloreactive memory T- and B-cells, IL2c+MRl combination therapy could prolong MHC-mismatched skin graft survival in immunocompetent mice but tolerance was lost compared to the naïve recipients. The addition of anti-LF A-1 treatment, which prevents the trafficking of memory T cells worked synergistically to significantly further enhance graft survival. However, late rejection mediated by activated/memory B cells and persistent donor-specific alloantibodies still occurred. Immunotherapeutic strategies targeting the activation of T cells are the cornerstone in the current immunosuppressive management after SOT. Therefore, in the next part of this thesis we investigated the paracaspase Malti-dependent T-cell receptor signalling as a novel immunosuppressive strategy to control alloreactive T cells in transplantation. We observed that although the inhibition of Malti downstream T signalling lead to tolerance of a minor H- mismatch skin grafts, it was however not sufficient to regulate alloresponses against MHC mismatches and only prolonged graft survival. Furthermore, we investigated the potential of more selectively targeting the protease activity of Malti. Constitutive inhibition of Malti protease activity in Malti-ki mice was detrimental to tolerance induction as it diminished Treg function and increased Thl alloreactivity. However, when using a small peptide inhibitor of Malti proteolytic activity in vitro, we observed an attenuation of alloreactive T cells and sparing of the pre-existing Treg pool. This indicates that further investigation of the role of Malti signalling in the field of transplantation is required. Collectively, the findings of this thesis provide immunological mechanisms underlying novel therapeutic strategies for the promotion of tolerance in SOT. Moreover, we highlight the importance of testing tolerance induction therapies in more physiological models with pre-existing alloreactive memory T and B cells.

Pouvoirs et attractivités de la métropole Aix-Marseille-Provence dans les réseaux mondiaux d'entreprises multinationales

En phase de construction politique et institutionnelle, la métropole Aix-Marseille-Provence (AMP) peut déjà être considérée comme un ensemble urbain cohérent pour son positionnement dans la globalisation des entreprises multinationales. Cette cohérence constitue un enjeu tant du point de vue local, que pour l'ajustement des politiques d'attractivité et de planification permettant de renforcer les synergies de ses pôles et de renouveler son économie dans la concurrence européenne et mondiale. Les concurrences et complémentarités qui se développent entre les villes se situent en effet aux niveaux des aires d'influences fonctionnelles des villes et non au sein leurs délimitations administratives, souvent transcendées par les interactions locales entre acteurs.

Molecular analysis of NOTCH2 in patients with primary open-angle glaucoma

Le glaucome est la seconde cause de cécité dans le monde après la cataracte et est caractérisé par la perte progressive de cellules ganglionnaires de la rétine allant vers la dégénérescence du nerf optique. On distingue deux formes de glaucome; le glaucome à angle fermé et le glaucome à angle ouvert. L'hérédité du glaucome est souvent sporadique, parfois autosomique dominante. Une pression intraoculaire de plus de 21 mmHg représente un facteur de risque important pour son développement. Actuellement, la mutation la plus fréquente, observée dans 5% des cas de glaucome héréditaire, est retrouvée dans le gène MYOC (trabecular meshwork inducible glucocorticoide response). À ce jour, les causes et mécanismes moléculaires sous-jacent ne sont que partiellement compris. Récemment, il a été démontré qu'une souris transgénique exprimant le gène Notch2 dans luvée, développait un glaucome. Pour cette raison, nous avons analysé le gène NOTCH2 chez l'homme afin de déterminer s'il était impliqué. NOTCH2 est composé de 34 exons sur le chromosome 1 et code une protéine transmembranaire essentielle à la prolifération, l'apoptose, la différenciation cellulaire et le destin cellulaires. L'expression du gène est localisée dans le segment antérieur de l'oeil, le segment externe du corps ciliaire et le trabéculum. Les fonctions principales de ces deux tissus sont la production et le drainage de l'humeur aqueuse. Pour mémoire, une perturbation du flux peut générer une augmentation de la pression intraoculaire. Le but de cette étude était de rechercher d'éventuelles mutations du gène NOTCH2 chez des patients souffrant de glaucome. 130 patients ont été vu à l'hôpital ophtalmique Jules- Gonin et un échantillon d'ADN a été récolté afin d'identifier l'origine moléculaire de leur pathologie. L'analyse moléculaire s'est fait étape par étape. Premièrement, j'ai séquencé l'exon 3 du gène MYOC. Deuxièment, la Chromatographie en phase liquide à haute performance a été utilisée pour l'analyse des 34 exons du gène NOTCH2. Troisièment, tous les exons présentant une courbe suspecte au chromatogramme ont été séquencés selon la méthode de Sanger. Dans la première partie de l'étude, j'ai analysé l'exon 3 du gène MYOC afin de déterminer les éventuels porteurs d'une mutation dominante. Aucune mutation pathogénique n'a été mis en évidence mais 4 patients sur les 130 étaient porteurs d'un variant connu et fréquent. Dans la deuxième partie de mon étude, j'ai analysé les 34 exons du gène NOTCH2, qui n'ont révélé aucune mutation. Bien que les méthodes utilisées dans cette étude montrent quelques limitations, il est peu probable que des mutations dans les régions codantes de NOTCH2 soient un facteur de risque important dans le glaucome primaire à angle ouvert.

Collection de titres et généalogies, formée par Charles-François BLONDEAU DE CHARNAGE († 1776). MELANGES. Français 26469 (161)

Montres d'armes et pièces militaires (1686-1690) ; — confirmation de l'hérédité aux notaires et procureurs (1690) ; — création de maréchaussées en Franche-Comté (1692) ; — création d'un président et de six notaires-secrétaires en la Chambre des comptes de Dole (1693) ; — suppression des offices de conseillers lieutenants-généraux de police, excepté à Paris, et création de nouveaux offices de conseillers lieutenants-généraux (1699) ; — création de contrôleurs des deniers patrimoniaux et d'octrois et de substituts des procureurs du roi (1694) ; — arrêt du Conseil d'État prescrivant la confection d'un état du personnel des corporations d'arts et métiers (1673) ; — procureurs du roi et greffiers des villes (1691) ; — officiers municipaux (1693) ; — notaires, procureurs, huissiers et sergents (1701) ; — détenteurs d'héritages (1711) ; — offices municipaux (1737-1738) ; — billets de monnaie (1707) ; — laines de Languedoc, de Provence et du Dauphiné (1742) ; — loterie royale (1755) ; — loterie de l'École militaire (1757) ; — récit de la victoire remportée par la flotte française à Gibraltar (1756) ; — ode sur la paix ; — mausolée de Languet de Gergy, curé de St-Sulpice ; — factum pour Jean Sarrazin contre Nicolas Le Fèvre ; — arrêt sur la péremption (1703) ; — attaque du fort St-Philippe (1756) ; — les cabriolets justifiés ; — plan d'association ; — compliment à F.-M. de Verthamon ; — conjuration à Malte (1749) ; — requête du curé de Fontenoy au roi ; — les Tronchinades ; — lettre d'un Français à un Anglais ; — pamphlet en vers contre le pape ; — Nantes (1705) ; — Constitution Unigenitus (1720-1733) ; — condamnation d'une thèse de Jean-Martin de Prades (1752) ; — arrêt en faveur du curé de St-Nicolas-des-Champs (1754) ; — arrêt contre la Lettre de M. l'évêque de Boulogne à M. le Procureur général (1754) ; — arrêt contre Laugieur de Beaurecueil, curé de Ste-Marguerite, à Paris (1755) ; — chapitre Ste-Croix d'Orléans (1755) ; — suppression de deux chambres des Enquêtes (1757) ; — officiers et affaires du Parlement (1753) ; — arrêt concernant la délivrance des prisonniers d'Orléans à l'avènement des évêques de cette ville (1753) ; — mandements de l'archevêque de Paris, des vicaires-généraux de Bourges et de l'évêque de Troyes (1756-1758) ; — règlement pour la chambre des Vacations, tenue aux Grands-Augustins (1753) ; — St-Sauveur de Lille.

Recueil de copies et de pièces imprimées concernant principalement la juridiction de la connetablie et maréchaussée de France. Ce recueil s'arrête à 1782.

Contient : 1 « Charta pro consulibus et habitatoribus villae de Florentia. Charte en faveur des habitants de la ville de Florence en la senechaussée de Toulouze. Trésor des chartes, pièce 630 du registre 80, page 396 ». Acte, en latin, du roi JEAN. Novembre 1350 ; 2 « Edit du roy HENRY IV, concernant les duels, donné à Blois, au mois d'avril 1602, registré au parlement le 7e juin suivant » ; 3 « Observations sommaires sur la jurisdiction des connetable et maréchaux de France » (fol. 19-31), suivies de reflexions sur ces observations (fol. 33-38) ; d'un relevé des édits et déclarations concernant la connétablie et la juridiction des maréchaux (fol. 39) ; d'une pièce imprimée intitulée : « Articles extraits des edits, ordonnances, declarations du roi et arrêts du conseil d'Etat, concernant les offices du point d'honneur », de 1693 à 1771 (fol. 41-44) ; d'une autre pièce imprimée, portant pour titre : « Articles extraits des ordonnances, edits et declarations, ou les Douze anciens articles fondamentaux enregistrés en la cour et publiés en la communauté des avocats et procureurs, dits vulgairement l'Ordonnance de 1356, pour la justice militaire et jurisdiction royale, civile, de police et criminelle du siege general de la connestablie et mareschaussée de France, à la table de marbre du Palais à Paris, universelle pour tout le royaume » ; 4 « Observations au sujet de l'arrêt de la cour, du 9 may 1767 », concernant les « soy-disants jésuites » ; 5 « Projet de requisitoire et de jugement de la connetablie » concernant les jésuites ; 6 « Arrest de la chambre des comptes, qui, en execution de l'ordonnance du 15 janvier 1573 et de la declaration du roi du 6 janvier 1574, enregistrées les 3 avril 1573 et 12 fevrier 1574, ordonne que les commissaires des guerres, controleurs, tresoriers, payeurs, de la gendarmerie, feront enregistrer leurs provisions au siege de la connétablie, avec déclaration de leur residence et domicile, et en outre les payeurs, les actes de leurs cautions, et fait defenses aux tresoriers, payeurs de leur payer à l'avenir leurs gages qu'en rapportant copie collationnée, pour une fois seulement, desdits enregistrements faute de quoi lesdits gages ne seront passés au jugement de leurs comptes. Du 23 août 1746 ». Pièce imprimée ; 7 « Articles extraits des anciennes ordonnances, edits et declarations, arrests et reglemens, pour etablir la necessité où sont les commissaires, controlleurs, tresoriers et payeurs generaux ou particuliers, ordinaires ou extraordinaires des guerres, de la maison du roy, de la cavalerie legère, des regimens et garnisons, et autres, de faire enregistrer au siège général de la connétablie et marechaussée de France, à la table de marbre du Palais à Paris, leurs lettres de provisions, actes de reception de caution et departement, y envoyer les roles des montres, et y declarer le lieu de leur residence et le nom de leurs cautions, sous peine de ne pouvoir être payés de leurs gages, qui ne pourront être alloués sans cette formalité, dans les comptes des tresoriers et payeurs, comme aussi l'obligation où ces officiers sont de proceder sur les actions qui leur sont intentées au sujet des fonctions dépendantes de leurs charges et maniement, de même que pour les contestations qui leur surviennent pour raison de leurs ventes d'offices, vente volontaire ou forcée par saisie reelle et adjudication en justice dans ce tribunal, où ils ont leurs causes commises exclusivement à toutes autres cours et juges, sans que le committimus ni l'evocation puisse avoir lieu, dont ils sont conseillers nés par la seance et voix deliberative qu'il a plu à Sa Majesté leur y accorder en certain cas, et dans lequel, par cette raison, leurs informations de vie et moeurs et leurs assemblées doivent se faire ». Paris, 1746. Pièce imprimée ; 8 « Arrest du conseil d'Estat du roi, qui, sans s'arrêter à l'arrêt du parlement de Besançon, du 20 novembre 1731, ni à tout ce qui s'en était ensuivi, ordonne que le procès encommencé contre les nommés Antoine Le Noir et François-Marie de La Croix, cavaliers de marechaussée, à la résidence d'Orgelet, pour raison de sommes par eux induement exigées d'un prisonnier par eux conduit dans les prisons de la conciergerie dudit parlement de Besançon, sera fait et jugé par les officiers du siège de la connétablie, conformement à la sentence dudit siège, du 13 decembre 1731, fait défense aux officiers du parlement de Besançon de prendre aucune connoissance des abus, excès et malversations commis par les officiers et archers de marechaussée dans l'exercice de leurs charges et commissions. Du 16 fevrier 1732 » ; Autre « arrêt du conseil d'Estat du roi, qui renvoye au siége de la connetablie la connoissance des accusations intentées contre le nommé Jean-Baptiste Lambert, cavalier de la marechaussée du département d'Arras, pour raison d'excès pretendus par lui commis en la personne d'un habitant de la ville de Lille en Flandre, qu'il avoit arrêté en vertu de l'ordre verbal de son lieutenant ; casse et annulle le decret de prise de corps decerné à ce sujet par les maieur et echevins de Lille, contre ledit Lambert, et leur fait défenses de rendre de pareils jugemens à l'avenir, et de connoître des fautes, abus et malversations qui pourroient être commis par les officiers de la marechaussée dans l'exercice de leurs fonctions, à peine de nullité, et de repondre en leurs propres et privés noms des dommages et intérêts desdits officiers ; ordonne que ledit arrêt sera enregistré au greffe de l'hôtel de ville. Du 12 juillet 1737 » ; 9 « Discussion elevée entre la connetablie et le parlement de Besançon, au sujet de la competence de la connetablie » ; a « Remontrance du parlement de Besançon » ; b « Observations sur les remontrances du parlement de Besançon » ; c « Projet de reponse » par JOLY DE FLEURY, procureur général au parlement de Paris, « à une consultation de M. le garde des sceaux » au sujet des remontrances susenoncées, 16 juin 1782 ; Double des pièces qui font l'objet des articles ci-dessus, cotés a, b, c ; 10 « Memoire pour le sieur Joly prévôt de la connetablie et marechaussée de France, à la suite et près la personne de feu monsieur le marechal de La Feuillade, qui traite de l'origine, des pouvoirs, fonctions, privileges et exemptions, ensemble des juges des privileges, des prevôts, officiers et archers, gardes de la prevôtés à la suite, et près la personne de chacun de messieurs les maréchaux de France, pourvus par le roi sur leur nomination » le tout rédigé par « Noirot, procureur » et publié « à Paris au Palais » en 1744. Pièce imprimée de 28 pages ; 11 « Autorités qui établissent le droit au siége de la connétablie de connoître et juger, souverainement et sans appel, les cas prévôtaux, en appellant audit siége les anciens avocats de la cour au nombre porté par l'ordonnance, et faisant juger la compétence à la Tournelle du parlement ». Les autorités citées sont comprises entre les années 1549-1647. Pièce de 8 pages in-4° imprimée « à Paris, chez P. G. Simon, imprimeur du parlement, rue Mignon Saint André des Arts, 1782 » ; 12 « Arrest de la cour du parlement, qui maintient le siège de la connetablie et marechaussée de France à la table de marbre du Palais à Paris, dans le droit de connoitre de tous cas et délits, dont la connoissance lui appartient, et dont il est en possession de connoitre, aux termes et conformément aux edits, ordonnances, declarations du roi, arrêts et reglemens concernant la jurisdiction dudit siége... Donné en notre dite cour de parlement le 2 septembre... 1767 ». Pièce de 8 pages in-4°, imprimée « à Paris, chez P.-G. Simon, imprimeur du parlement, rue de La Harpe, à l'Hercule, 1768 » ; 13 Extrait de l'« Encyclopedie », tome X, page 94, au mot Maréchal de France ; 14 « Declaration du roi... LOUIS » XIV, « donnée à Arles, au mois de janvier 1660, verifiée en parlement, le 5e fevrier, enregistrée au siège de la connestablie, le 10e du même mois de ladite année, confirmée par autre declaration du 20e août 1663, par laquelle S. M. ordonne qu'en reiterant et confirmant les edits et declarations cy devant données, concernant la jurisdiction de la connestablie et marechaussée de France à la table de marbre du Palais, à Paris, notamment celles de 1356, 1573 et 1617, portant que le privilège de committimus aux requestes du Palais et de l'Hostel, et l'attribution du scel du Chastelet ne peuvent avoir lieu contre ledit siège, et toutes saisies faites entre les mains des tresoriers de l'ordinaire et extraordinaire des guerres et cavalerie legère, et autres payeurs des gages des officiers et archers de marechaussée, sont nulles, si elles ne sont faites de l'ordonnance du lieutenant general de la connestablie »

Mélanges historiques et généalogiques.

Contient : Testament de Gauthier de Brienne, duc d'Athènes ; Donation faite par Louis de La Trémoille à Charlotte Couronneau, sa maîtresse ; Aveu rendu à Jean de Luxembourg par Guillemette de Montigny ; Testament de Jean de Langhat, évêque de Limoges, et pièces relatives à son exécution ; Donation par Charles VII à Gaston de Lyon, sénéchal de Toulouse, de biens de la famille d'Enghien, échus au roi par droit d'aubaine ; Vente par Érard de Nanteuil, à Robert, duc de Bourgogne, de ses droits à Souleaux, Villeloup, etc ; Cession par Philippe le Bel à Edmond d'Angleterre et à Blanche de Navarre, sa femme, des châtellenies de Soulaines et Lassicourt ; Notes sur la généalogie de François de Luxembourg, vicomte de Martigues ; Mémoire pour Jean, seigneur de Roye, contre Jean d'Humières, au sujet de l'héritage de Raoul de Flavy ; Approbation par l'Université de Paris, du projet de mariage entre le Dauphin Charles et Marguerite d'Autriche ; Vente par Jeanne de Sains, dame de Lagny, femme de Jean de Launay, à Guillaume de Flavy, de la seigneurie de Lagny ; Contrat de mariage de Jean de Roye et Blanche de Brosse ; Mémoire pour Antoine de Roye et Catherine de Saarebruck sa femme, contre M. et Mme d'Anthoing ; Mémoire pour Guy de Beloy, curateur aux causes d'Antoine de Roye, contre Charles de Sainte-Maure, comte de Nesle, et Catherine d'Estouteville, sa femme ; Inventaire des pièces produites devant le Parlement par Jean de Roye ; Réponse de Thibaut, Gui et Jean de Flavy, aux demandes de Jean de Roye (incomplet de la fin) ; Réplique de Jean de Roye ; Mandement de Charles VII, autorisant Pierre d'Orgemont, son échanson, à faire valoir ses droits contre les héritiers de Mahieu de Roye ; Pièces concernant la cause de Jean de Roye contre Robert d'Estouteville et Catherine de Sainte-Beuve, sa femme ; Notice d'un accord entre l'église de Soissons et Jean de Chérizy ; Aveu rendu à Jean de Roye par Regnault de Bucy, pour ses fiefs de Muret ; Extrait du dénombrement du fief tenu à Maissenin par Jean du Rosay ; Confirmation des privilèges de Notre-Dame d'Oulchy par Henri, comte de Troyes ; Procuration donnée par Phileberte de Rupt, veuve de Jean de Roye et tutrice de ses enfants, à Jacques « Cumyn » ; Compte des obsèques et du service de bout de l'an de Phileberte de Rupt, dame de Saint-Georges (morte le 9 décembre 1519) ; Pièces relatives à François et Yvon de Villeprouvée ; Testament de Marie de Roye, femme de Pierre d'Orgemont ; Privilèges accordés à divers habitants de Méry-sur-Seine ; Vente par Guillaume de Marigny à Jacques de Basson d'un étang près de Marigny ; Aveu rendu à Pons de Mortagne par Jean de Chabanais, pour ce qu'il tient au nom de Marguerite de Marcillac, sa femme ; Procès entre Catherine de Chauvigny, veuve de Charles d'Amboise, et Philippe de Lannoy et Marguerite de Chatillon, sa femme, au sujet de l'héritage de Jeanne Flote (28 février 1491-21 juillet 1494 ; Bail consenti aux religieux de Saint-Martin de Troyes par Robert Compoings, procureur de Perrette Bracque, veuve de Jacques Piedefer, conseiller au Châtelet ; Inventaire des titres du château de Juilly ; Vente d'une terre par Elyon de Mailly, seigneur d'Arc-sur-Tille, à Nicolas Godet ; Procès verbal d'examen par divers écrivains jurés de Paris, de deux lettres adressés à Semblançay par G. de Bonnivet ; Arrêt en faveur d'Hector de Rochechouart et de Catherine d'Estrabonne, sa femme, contre les religieuses de Moncel ; Extrait relatif à Christophe de Bouan ; Épitaphe de Robert de Crèvecoeur ; Accord entre Charlotte d'Aunay, dame de Plancy, et Jean Billardon, au sujet des moulins de Plancy ; Lettre de Jean de Langeac, évêque d'Avranches, à [François de Dinteville], évêque d'Auxerre (8 juin [1532] ; original) ; Lettre de Guillaume du Bellay à Pomponio Trivulcio (25 novembre 1532 ; original) ; Lettre de M. de Lespinasse à M. de Paisy (20 mars s. d. ; original) ; Lettre de François, comte de Nevers, à M. de Nemours (25 août 1555 ; original) ; Lettres écrites par le même ou en son nom aux élus de Troyes (août-septembre 1552 ; originaux) ; Serment prêté par François II, duc de Bretagne ; Liste des comtes de Rethel jusqu'en 1406 ; Règlement pour le partage des biens d'Englebert d'Enghien et Marie d'Antoing, sa femme, entre leurs enfants ; Lettres royaux pour Louis de Luxembourg, comte de Ligny ; Extraits relatifs à diverses rentes assignées par les rois de France à des princes de leur maison ; Feuillet d'un obituaire de Morien val (cf. Molinier, Obituaires français, p. 284) ; Extraits relatifs au fief de Lieuvillers ; Extraits de divers contrats de mariage et registres paroissiaux

Recueil de lettres, de pièces originales et de copies de pièces indiquées comme telles dans le dépouillement qui suit.

Contient : 1 Lettre de « JEHAN,... conte D'ESTAMPES, seigneur de Dourdan », au « conte de Nevers et de Rethel. Escript au siege devant le chastel de Pocques, le VIIe jour de juillet » ; 2 Lettre de « J. COVIN » à l'évèque d'Auxerre, confesseur du duc de Bourgogne. « Escript à Aucerre, le premier jour de juillet » ; 3 Lettre de « l'evesque d'Ausserre, confesseur de monseigneur de Bourgoingne », au « conte de Neevers et de Rethet ». Au « chatel de Varzi, vendredi second jour du mois de juilliet » ; 4 Lettre de « l'evesque d'Ausserre à Guy de Jaucour,... consellier et chanbellan de mess. de Bourgoingne et de Nevers ». Au « chatel de Varzi, le second jour de juilliet » ; 5 « Estat de la recepte generalle de Nivernois », pour « l'année commancée le premier jour d'octobre mil.IIII. C. IIII. XX. et cinq, et finissant le derrain jour de septembre mil IIII. C. IIII. XX. et VI » ; 6 Copie d'une charte latine de PHILIPPE II, duc de Bourgogne, pour les religieux de la collégiale de Saint-Pierre de Mézières. Paris, juillet 1397 ; 7 Copie d'un mandement de « CHARLES, compte de Nevers et de Rethel,... au gouverneur de » ses « terre et seigneurie en Champagne... A Rionpelles, le 27 jour de novembre, l'an de grace mil CCCC. quarante un » ; 8 Copie d'un acte de donation de « GUILLAUME DE ROICHEFFORT, chevalier, seigneur de Chastillon en Bazois », à sa femme « Bietrix de Sain Cheron ». 29 octobre 1442 ; 9 Copie d'un acte du roi LOUIS XI, concernant le comte de Nevers et de Rethel. 16 « janvier 1466 » ; 10 Copie d'un certificat de CHARLES DE NEVERS sur la reddition de la ville de Clamecy. 1444 ; 11 « Coppie de la donacion de la seigneurie de Craon », par « Marie, dame de Lebret, de Suly et de Craon », à « Charles de Lebret », son mari. Du 20 décembre 1401 ; 12 Copie d'une donation faite par « Gauchiers, cuens de Rettest,... à Bauduin d'Avenes, frere la contesse de Flandres et de Haynnau... em l'an de l'Incarnation mil CC.LI, au mois de nouvenbre » ; 13 Copie d'une commission de « JEHAN, duc DE BRABANT, de Rethel et de Neufbourg, comte de Nevers », aux « seigneur de Praslain,... Jehan de Monstier,... M. Nicolas Maury,... Nevers, l'an de grace mil quatre cens soixante trois, le XI may » ; 14 Ordonnance de corvée faite au nom du « duc de Brabant, comte de Nevers ». 1er juillet 1512 ; 15 « Copie des protestacions, requestes et offres de monseigneur le conte de Nevers,... touchant le douhaire en la communaulté de madame Françoise, dohairiere de Nevers » ; 16 Copie d'un acte par lequel « Marie,... contesse de Rehtel », reconnaît tenir « dou signeur de Champaingne en fief et hommage... la maison et la terre de Montaguillon... Ce fut faict l'an de l'Incarnation... mil deus cent et cinquante deus, au moys d'apvril, le mercredy apres Pasques » ; 17 Copie d'un acte passé le « derrenier jour de mars mil quatre cens quatre vings et dix sept, apres Pasques, es presances » des « notaires du roy », par lequel « Charles Germain, somelier d'eschançonerie de feue madame Jacqueline,... contesse de Nevers et de Rethel », fait la déclaration des objets qu'il avait en sa garde, à cause de son office, du temps que vivait ladite comtesse ; 18 Ordonnance de « JEHAN, duc DE BRABANT,... conte de Nevers », à son « receveur de Rethel ». Du « chastel de Donzy, le XIIe jour du moys de janvyer, l'an de grace mil CCCC. quatre vingt et huict » ; 19 « Genealogie de messieurs les contes et contesses d'Eu, depuys l'an mil cent cinq » ; 20 « Inventaire des tiltres du conté d'Apremont en Lorraine » ; 21 « La meta delli beni mobilli et l'antiquita adornamenti et gentilezze qualle la fu.... Isabella marsa di Mantova haveva nel luogho chiamato la Grotta, posto in la Corte Vechia nella citta di Mantova... » ; 22 « Vaisselle d'argent doré estant au cabynet du chasteaul de Nevers » ; 23 « Extraict des registres du parlement » d'un arrêt en faveur de Françoise et d'Anne d'Alençon, contre le procureur général du roi. 1546 ; 24 « Memoyre pour respondre à monsieur le procureur general du roy touchant certaine donnaison de la viconté de Nerbonne, faicte par le roy Charles VIe à messire Mathieu de Foix, conte de Cumenge,... 1539 » ; 25 Copie du « contract de mariage de monseigneur le duc de Nivernoys et de madame Marguerite de Bourbon » ; 26 « Coppie du marché faict avec Claude Pioche », receveur des aides de l'élection de Reims, « pour la fourniteure du camp, du XVIIIe septembre 1552 » ; 27 Copie de la cession faite au roi Charles V, du comté de Dreux, par « Tristan Renault, viconte de Thouars », et sa femme. 19 septembre 1378 ; 28 « Copie du tiltre de Warc annexé par le roy Charles [V] au conté de Rethel. 1380 » ; 29 Copie des provisions de la charge de « conseiller lay » au parlement de Rouen, donnée par « Françoys » Ier à « Guillaume Allard ». 1er juillet 1521 ; 30 « C'est le partaige des contez, terres et seignouries... faict... entre monseigneur le conte de Foix et de Comminges,... et madame la contesse de Nevers ». 1er juillet 1525 ; 31 Copie du contrat de mariage entre « Odet, comte de Foix et de Cominge, viconte de Fronsac, seigneur de Lautrect, d'une part », et « damoiselle Charlotte d'Alebret », fille de « Jehan d'Albret », d'autre part. 1520 ; 32 « Double des arbitraiges avec monsieur d'Asparros » ; 33 Copie de l'acte d'hommage rendu par « Hugo, primogenitus comitis Registestis », à Blanche et à Thibaut de Champagne. « Actum anno gratie M°. CC°. XIX, mense aprilis » ; 34 Copie d'une « transaction entre l'abbé de Cluny et le soubsprieur de la Charité » ; 35 Sentence rendue par la chambre des requêtes entre les sieurs « Nicole de Plancy » et « Claude de La Croix, seigneur et baron de Plancy. Paris, le XXIXe jour de septembre, l'an mil V.C. trente sept » ; 36 « Coppie du testament » du « duc FEDERICQ DE MANTHOUE » ; 37 Copie d'un mémoire en latin pour M. Menaud de Martres, évêque de Conserans, contre Jean « Carrelle », curateur de Regnauld de « Beaulne » ; 38 Copie d'un acte passé devant l'official de Reims, touchant un désaccord entre « Johannes, comes Registensis », d'une part, et son frère « Gaucherus », archidiacre de Liége, d'autre part. « Actum anno Domini M° IIC. quadragesimo tertio, mense februario » ; 39 Copie d'un acte semblable au précédent et daté de juin 1244 ; 40 Copie des lettres de « GODEFRIDUS », abbé de Blaves, pour Gaucher de Rethel, archidiacre de Liége. « Actum anno Domini millesimo ducentesimo quadragesimo octavo, mense martio » ; 41 Copie de l'acte d'hommage de « Bauduins d'Avesne » à Gaucher, comte de Rethel. « Mil CC° cinquante un » ; 42 « Copie du partage faict par le duc de Cleves, ses freres et seurs, à Engelbert de Cleves, leur frere. 1488 » ; 43 Copie d'un acte daté de mars 1524, concernant la famille d'Albret ; 44 Copie d'un acte daté de mars 1524, concernant la famille d'Albret ; 45 Copie d'un acte concernant la famille d'Albret ; 46 Copie d'une donation de « GUILLELMUS, comes Nivernensis », à l'église Saint-Etienne ; 47 « Coppie de traicté touchant la diminution et moderacion du mariage et aussi du douaire de madame Marie d'Alebret. 1457 » ; 48 Marché fait, en 1552, avec « Nicolas Le Tonnelier », pour la fourniture des munitions nécessaires aux villes d'« Ambleteul » et de « Blacquenay » ; 49 Lettre de « JEHAN DE LA CHASSAIGNE à madamoiselle d'Orval. Escript à Bourdeaulx... XIIIIe jour d'avril »

Validation des modèles de pharmacologie de sécurité et évaluation de la valeur thérapeutique de l'oxytocine dans le traitement de l'infarctus du myocarde

En février, 2009 un rapport de PHRMA (Pharmaceutical Research and Manufacturers of America) confirmait que plus de 300 médicaments pour le traitement des maladies cardiaques étaient en phase d’essais cliniques ou en révision par les agences règlementaires. Malgré cette abondance de nouvelles thérapies cardiovasculaires, le nombre de nouveaux médicaments approuvés chaque année (toutes indications confondues) est en déclin avec seulement 17 et 24 nouveaux médicaments approuvés en 2007 et 2008, respectivement. Seulement 1 médicament sur 5000 sera approuvé après 10 à 15 ans de développement au coût moyen de 800 millions $. De nombreuses initiatives ont été lancées par les agences règlementaires afin d’augmenter le taux de succès lors du développement des nouveaux médicaments mais les résultats tardent. Cette stagnation est attribuée au manque d’efficacité du nouveau médicament dans bien des cas mais les évaluations d’innocuité remportent la palme des causes d’arrêt de développement. Primum non nocere, la maxime d’Hippocrate, père de la médecine, demeure d’actualité en développement préclinique et clinique des médicaments. Environ 3% des médicaments approuvés au cours des 20 dernières années ont, par la suite, été retirés du marché suite à l’identification d’effets adverses. Les effets adverses cardiovasculaires représentent la plus fréquente cause d’arrêt de développement ou de retrait de médicament (27%) suivi par les effets sur le système nerveux. Après avoir défini le contexte des évaluations de pharmacologie de sécurité et l’utilisation des bio-marqueurs, nous avons validé des modèles d’évaluation de l’innocuité des nouveaux médicaments sur les systèmes cardiovasculaires, respiratoires et nerveux. Évoluant parmi les contraintes et les défis des programmes de développements des médicaments, nous avons évalué l’efficacité et l’innocuité de l’oxytocine (OT), un peptide endogène à des fins thérapeutiques. L’OT, une hormone historiquement associée à la reproduction, a démontré la capacité d’induire la différentiation in vitro de lignées cellulaires (P19) mais aussi de cellules souches embryonnaires en cardiomyocytes battants. Ces observations nous ont amené à considérer l’utilisation de l’OT dans le traitement de l’infarctus du myocarde. Afin d’arriver à cet objectif ultime, nous avons d’abord évalué la pharmacocinétique de l’OT dans un modèle de rat anesthésié. Ces études ont mis en évidence des caractéristiques uniques de l’OT dont une courte demi-vie et un profil pharmacocinétique non-linéaire en relation avec la dose administrée. Ensuite, nous avons évalué les effets cardiovasculaires de l’OT sur des animaux sains de différentes espèces. En recherche préclinique, l’utilisation de plusieurs espèces ainsi que de différents états (conscients et anesthésiés) est reconnue comme étant une des meilleures approches afin d’accroître la valeur prédictive des résultats obtenus chez les animaux à la réponse chez l’humain. Des modèles de rats anesthésiés et éveillés, de chiens anesthésiés et éveillés et de singes éveillés avec suivi cardiovasculaire par télémétrie ont été utilisés. L’OT s’est avéré être un agent ayant d’importants effets hémodynamiques présentant une réponse variable selon l’état (anesthésié ou éveillé), la dose, le mode d’administration (bolus ou infusion) et l’espèce utilisée. Ces études nous ont permis d’établir les doses et régimes de traitement n’ayant pas d’effets cardiovasculaires adverses et pouvant être utilisées dans le cadre des études d’efficacité subséquentes. Un modèle porcin d’infarctus du myocarde avec reperfusion a été utilisé afin d’évaluer les effets de l’OT dans le traitement de l’infarctus du myocarde. Dans le cadre d’un projet pilote, l’infusion continue d’OT initiée immédiatement au moment de la reperfusion coronarienne a induit des effets cardiovasculaires adverses chez tous les animaux traités incluant une réduction de la fraction de raccourcissement ventriculaire gauche et une aggravation de la cardiomyopathie dilatée suite à l’infarctus. Considérant ces observations, l’approche thérapeutique fût révisée afin d’éviter le traitement pendant la période d’inflammation aigüe considérée maximale autour du 3ième jour suite à l’ischémie. Lorsqu’initié 8 jours après l’ischémie myocardique, l’infusion d’OT a engendré des effets adverses chez les animaux ayant des niveaux endogènes d’OT élevés. Par ailleurs, aucun effet adverse (amélioration non-significative) ne fût observé chez les animaux ayant un faible niveau endogène d’OT. Chez les animaux du groupe placebo, une tendance à observer une meilleure récupération chez ceux ayant des niveaux endogènes initiaux élevés fût notée. Bien que la taille de la zone ischémique à risque soit comparable à celle rencontrée chez les patients atteints d’infarctus, l’utilisation d’animaux juvéniles et l’absence de maladies coronariennes sont des limitations importantes du modèle porcin utilisé. Le potentiel de l’OT pour le traitement de l’infarctus du myocarde demeure mais nos résultats suggèrent qu’une administration systémique à titre de thérapie de remplacement de l’OT devrait être considérée en fonction du niveau endogène. De plus amples évaluations de la sécurité du traitement avec l’OT dans des modèles animaux d’infarctus du myocarde seront nécessaires avant de considérer l’utilisation d’OT dans une population de patients atteint d’un infarctus du myocarde. En contre partie, les niveaux endogènes d’OT pourraient posséder une valeur pronostique et des études cliniques à cet égard pourraient être d’intérêt.

Analyse cinétique des rétinaldéhydes déshydrogénases recombinantes de type 3 et 4 de souris

Les Rétinal déshydrogénases (RALDHs) catalysent irréversiblement la déshydrogénation du Rétinal en Acide Rétinoïque (AR) qui est impliqué dans l’embryogenèse et la différenciation tissulaire. Pour comprendre le rôle dans la biosynthèse de l’AR des RALDHs type 3 et 4 de souris, nous avons déterminé leurs propriétés cinétiques ainsi que leur comportement en présence de différents inhibiteurs. Les tests enzymatiques sont effectués avec une préparation d’enzyme recombinante, tagguée avec 6 histidines, purifiée sur colonne Ni-NTA (Qiagen). L’activité enzymatique est évaluée en quantifiant la production d’AR par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en phase inversée. Les constantes cinétiques ont été déterminées pour les isomères du rétinal tout-trans, 9-cis et 13-cis. La RALDH4 catalyse les isomères 9-cis et 13-cis de rétinal, elle présente un faible KM (3μM) pour les deux isomères et a une efficacité catalytique élevée pour le 9-cis rétinal 3.4 fois supérieure au 13-cis rétinal. La RALDH3 est spécifique au tout-trans rétinal avec un KM de 4 μM et une efficacité élevée. β-Ionone, inhibiteur possible pour la RALDH4, inhibe l’activité avec le rétinal 9-cis et 13-cis, mais n’influence pas l’activité de la RALDH3. Le para-hydroxymercuribenzoïque (p-HMB) inhibe l’activité de deux isoenzymes. Le cation MgCl2 augmente par 3 fois l’oxydation du rétinal 13-cis par la RALDH4, diminue l’oxydation du 9-cis rétinal et influence faiblement la RALDH3. Ces données enrichissent les connaissances sur les caractéristiques cinétiques des RALDHs recombinantes de souris de types 3 et 4 et fournissent des éclaircissements sur la biogenèse de l’acide rétinoïque in vivo.

Immuno-oncology of human prostate cancer : phenotypical characterization and study of the tumor-derived, androgen-regulated immunosuppressive microenvironment

Le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les hommes canadiens et la troisième cause de décès relié au cancer. Lorsque diagnostiqué à un stade précoce de la maladie, le cancer de la prostate est traité de manière curative par chirurgie et radiothérapie. Par contre, les thérapies actuelles ne peuvent éradiquer la maladie lorsqu’elle progresse à des stades avancés. Ces thérapies, comme la chimiothérapie et l’hormonothérapie, demeurent donc palliatives. Il est primordial d’optimiser de nouvelles thérapies visant l’élimination des cellules cancéreuses chez les patients atteints des stades avancés de la maladie. Une de ces nouvelles options thérapeutiques est l’immunothérapie. L’immunothérapie du cancer a fait des progrès considérables durant les dernières années. Cependant, les avancements encourageants obtenus lors d’essais précliniques ne se sont pas encore traduits en des résultats cliniques significatifs. En ce qui concerne le cancer de la prostate, les résultats négligeables suivants des interventions immunothérapeutiques peuvent être causés par le fait que la plupart des études sur le microenvironnement immunologique furent effectuées chez des modèles animaux. De plus la majorité des études sur l’immunologie tumorale humaine furent effectuées chez des patients atteints d’autres cancers, tels que le mélanome, et non chez les patients atteints du cancer de la prostate. Donc, le but central de cette thèse de doctorat est d’étudier le microenvironnement immunologique chez les patients atteints du cancer de la prostate afin de mieux définir les impacts de la tumeur sur le développement de la réponse immunitaire antitumorale. Pour réaliser ce projet, nous avons établi deux principaux objectifs de travail : (i) la caractérisation précise des populations des cellules immunitaires infiltrant la tumeur primaire et les ganglions métastatiques chez les patients atteints du cancer de la prostate; (ii) l’identification et l’étude des mécanismes immunosuppressifs exprimés par les cellules cancéreuses de la prostate. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent que la progression du cancer de la prostate est associée au développement d’un microenvironnement immunosuppressif qui, en partie, est régulé par la présence des androgènes. L’étude initiale avait comme but la caractérisation du microenvironnement immunologique des ganglions drainant la tumeur chez des patients du cancer de la prostate. Les résultats présentés dans le chapitre III nous a permis de démontrer que les ganglions métastatiques comportent des signes cellulaires et histopathologiques associés à une faible réactivité immunologique. Cette immunosuppression ganglionnaire semble dépendre de la présence des cellules métastatiques puisque des différences immunologiques notables existent entre les ganglions non-métastatiques et métastatiques chez un même patient. La progression du cancer de la prostate semble donc associée au développement d’une immunosuppression affectant les ganglions drainant la tumeur primaire. Par la suite, nous nous sommes intéressés à l’impact de la thérapie par déplétion des androgènes (TDA) sur le microenvironnement immunologique de la tumeur primaire. La TDA est associée à une augmentation marquée de l’inflammation prostatique. De plus, les protocoles d’immunothérapies pour le cancer de la prostate actuellement évalués en phase clinique sont dirigés aux patients hormonoréfractaires ayant subi et échoué la thérapie. Cependant, peu d’information existe sur la nature de l’infiltrat de cellules immunes chez les patients castrés. Il est donc essentiel de connaître la nature de cet infiltrat afin de savoir si celui-ci peut répondre de manière favorable à une intervention immunothérapeutique. Dans le chapitre IV, je présente les résultats sur l’abondance des cellules immunes infiltrant la tumeur primaire suivant la TDA. Chez les patients castrés, les densités de lymphocytes T CD3+ et CD8+ ainsi que des macrophages CD68+ sont plus importantes que chez les patients contrôles. Nous avons également observé une corrélation entre la densité de cellules NK et une diminution du risque de progression de la maladie (rechute biochimique). Inversement, une forte infiltration de macrophages est associée à un plus haut risque de progression. Conjointement, durant cette étude, nous avons développé une nouvelle approche informatisée permettant la standardisation de la quantification de l’infiltrat de cellules immunes dans les échantillons pathologiques. Cette approche facilitera la comparaison d’études indépendantes sur la densité de l’infiltrat immun. Ces résultats nous ont donc permis de confirmer que les effets pro-inflammatoires de la TDA chez les patients du cancer de la prostate ciblaient spécifiquement les lymphocytes T et les macrophages. L’hypothèse intéressante découlant de cette étude est que les androgènes pourraient réguler l’expression de mécanismes immunosuppressifs dans la tumeur primaire. Dans le chapitre V, nous avons donc étudié l’expression de mécanismes immunosuppressifs par les cellules cancéreuses du cancer de la prostate ainsi que leur régulation par les androgènes. Notre analyse démontre que les androgènes augmentent l’expression de molécules à propriétés immunosuppressives telles que l’arginase I et l’arginase II. Cette surexpression dépend de l’activité du récepteur aux androgènes. Chez les patients castrés, l’expression de l’arginase II était diminuée suggérant une régulation androgénique in vivo. Nous avons observé que l’arginase I et l’arginase II participent à la prolifération des cellules du cancer de la prostate ainsi qu’à leur potentiel immunosuppressif. Finalement, nous avons découvert que l’expression de l’interleukin-8 était aussi régulée par les androgènes. De plus, l’interleukin-8, indépendamment des androgènes, augmente l’expression de l’arginase II. Ces résultats confirment que les androgènes participent au développement d’une microenvironnement immunosuppressif dans le cancer de la prostate en régulant l’expression de l’arginase I, l’arginase II et l’interleukin-8. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse témoignent du caractère unique du microenvironnement immunologique chez les patients atteints du cancer de la prostate. Nos travaux ont également permis d’établir de nouvelles techniques basées sur des logiciels d’analyse d’image afin de mieux comprendre le dialogue entre la tumeur et le système immunitaire chez les patients. Approfondir les connaissances sur les mécanismes de régulation du microenvironnement immunologique chez les patients atteint du cancer de la prostate permettra d’optimiser des immunothérapies mieux adaptées à éradiquer cette maladie.

Régulation dépendante du cycle cellulaire de la réparation par excision de nucléotides

La réparation par excision de nucléotides (NER) est une voie critique chez l'homme pour enlever des lésions qui déforment l’hélice d'ADN et qui bloquent à la fois la réplication et la transcription. Parmi ces lésions, il y a les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPDs) et les adduits pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4PPs) induient par les rayons ultraviolets. L'importance physiologique de la NER est mise en évidence par l’existence de la maladie Xeroderma pigmentosum (XP), causée par des mutations affectant des gènes impliqués dans cette voie de réparation. Les personnes atteintes sont caractérisées par une photosensibilité extrême et une forte prédisposition à développer des tumeurs cutanées (plus de 1000 fois). Les patients atteints du type variant de la maladie Xeroderma pigmentosum (XPV), apparemment compétents en réparation, portent plutôt des mutations dans le gène codant pour l'ADN polymérase η (polη). Polη est une ADN polymérase translésionnelle capable de contourner avec une grande fidélité certaines lésions telles que les CPDs, qui autrement bloquent les polymérases réplicatives. Ainsi, la polη prévient la formation de mutations et permet la reprise de la synthèse d'ADN. L'objectif principal de cette thèse est d'évaluer le rôle potentiel de voies de signalisation majeures dans la régulation de la NER, dont celles régulées par la kinase ATR (Ataxia Télangiectasia and Rad3-related kinase). Suite à l'irradiation UV, ATR est rapidement activée et phosphoryle des centaines de protéines qui régulent les points de contrôle du cycle cellulaire et joue un rôle notoire dans le maintient de la stabilité génomique. Nous avons postulé qu’ATR puisse réguler la NER de manière dépendante du cycle cellulaire. Cependant, tester cette hypothèse représente un grand défi car, pour des raisons techniques, les méthodes conventionnelles n’ont pas à ce jour été adaptées pour l'évaluation de la cinétique de réparation au cours des différentes phases du cycle cellulaire. Nous avons donc développé une méthode novatrice basée sur la cytométrie en flux permettant de quantifier avec grande précision la cinétique de réparation des 6-4PPs et CPDs dans chacune des phases G0/G1, S et G2/M. Avec cette nouvelle méthode, nous avons pu démontrer que l'inhibition d'ATR ou polη résulte en une très forte inhibition de la NER exclusivement durant la phase S du cycle cellulaire. Ces études ont révélé, pour la première fois, une fonction critique pour ces protéines dans le retrait des lésions qui bloquent la réplication. En outre, nous avons démontré que la synthèse d'ADN est indispensable pour l’inhibition de la réparation en phase-S, reflétant un lien potentiel entre la NER et la réplication. Curieusement, nous avons également montré que parmi six lignées cellulaires tumorales choisies aléatoirement, trois présentent une abrogation totale de la NER uniquement pendant la phase S, ce qui indique que de nombreux cancers humains pourraient être caractérisés par un tel défaut. Nos observations pourraient avoir d'importantes implications pour le traitement du cancer. En effet, le statut de la NER semble constituer un déterminant majeur dans la réponse clinique aux médicaments chimiothérapeutiques tels que le cisplatine, qui inhibent la croissance des cellules cancéreuses via l'induction de lésions à l’ADN.

Analyse quantitative des cyanotoxines d'eau douce par LDTD-APCI-MS/MS

Avec la hausse mondiale de la fréquence des floraisons de cyanobactéries (CB), dont certaines produisent des cyanotoxines (CT), le développement d’une méthode de détection/quantification rapide d’un maximum de CT s’impose. Cette méthode permettrait de faire un suivi quotidien de la toxicité de plans d’eau contaminés par des CB et ainsi d’émettre rapidement des avis d’alerte appropriés afin de protéger la santé publique. Une nouvelle technologie utilisant la désorption thermique induite par diode laser (LDTD) couplée à l’ionisation chimique sous pression atmosphérique (APCI) et reliée à la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) a déjà fait ses preuves avec des temps d'analyse de l’ordre de quelques secondes. Les analytes sont désorbés par la LDTD, ionisés en phase gazeuse par APCI et détectés par la MS/MS. Il n’y a donc pas de séparation chromatographique, et la préparation de l’échantillon avant l’analyse est minimale selon la complexité de la matrice contenant les analytes. Parmi les quatre CT testées (microcystine-LR, cylindrospermopsine, saxitoxine et anatoxine-a (ANA-a)), seule l’ANA-a a généré une désorption significative nécessaire au développement d’une méthode analytique avec l’interface LDTD-APCI. La forte polarité ou le poids moléculaire élevé des autres CT empêche probablement leur désorption. L’optimisation des paramètres instrumentaux, tout en tenant compte de l’interférence isobarique de l’acide aminé phénylalanine (PHE) lors de la détection de l’ANA-a par MS/MS, a généré une limite de détection d’ANA-a de l’ordre de 1 ug/L. Celle-ci a été évaluée à partir d’une matrice apparentée à une matrice réelle, démontrant qu’il serait possible d’utiliser la LDTD pour effectuer le suivi de l’ANA-a dans les eaux naturelles selon les normes environnementales applicables (1 à 12 ug/L). Il a été possible d’éviter l’interférence isobarique de la PHE en raison de sa très faible désorption avec l’interface LDTD-APCI. En effet, il a été démontré qu’une concentration aussi élevée que 500 ug/L de PHE ne causait aucune interférence sur le signal de l’ANA-a.

Exploration fonctionnelle des réponses cellulaires T CD4+ et CD8+ dans l’infection par le VIH-1

L’infection par le VIH-1 est caractérisée par une déplétion progressive des cellules T CD4+ ainsi que par un dysfonctionnement des cellules T qui, en l’absence de traitements anti-rétroviraux, conduit inéluctablement à la progression de la maladie vers le stade SIDA. Certains des mécanismes impliqués dans ce dysfonctionnement de la réponse cellulaire T ont été élucidés et ont révélé un rôle important de la molécule PD-1 dans l’exhaustion des cellules T en phase chronique de l’infection. En effet, des niveaux élevés de PD-1 ont été associés à une charge virale élevée ainsi qu’à une diminution de la production de cytokines et de la capacité de proliférer des cellules T spécifiques du virus. De plus, bloquer in vitro l’interaction de PD-1 avec son ligand PD-L1 en utilisant un anticorps bloquant rétabli la fonction de ces cellules. De façon intéressante, notre groupe ainsi que d’autres équipes, ont montré que l’expression de PD-1 était non seulement augmentée sur les cellules spécifiques de l’antigène mais aussi sur les cellules T totales. Cependant, peu de choses sont connues quant à l’impact de l’expression de PD-1 sur le renouvellement et la différenciation des cellules T qui expriment PD-1, et ce au cours de l’infection. L’expression de PD-1 n’a notamment pas été étudiée en phase aigue de l’infection. Nous montrons clairement que, aussi bien chez les individus en phase aigue qu’en phase chronique de l’infection, l’expression de PD-1 est augmentée sur toutes les sous-populations T, y compris les cellules naïves. Nous avons également mis en relief une distribution anormale des sous-populations T, ces cellules ayant un phénotype plus différencié, et ce à tous les stades de la maladie. Dans cette thèse, nous discutons le rôle possible de PD-1 dans l’homéostasie des cellules T chez les individus infectés par le VIH-1. En étudiant la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection, nous avons trouvé que les sous-populations T CD8+ des individus récemment infectés exprimaient moins de PD-1 que celles des individus à un stade plus avancé de la maladie. Ces niveaux plus élevés de PD-1 sur les cellules T CD8+ en phase chronique sont associés à des niveaux réduits de prolifération in vivo – comme mesuré par l’expression de Ki67 – suggérant que l’expression de PD-1 est partiellement impliquée dans cette perte de fonction des cellules T CD8+. De plus, les cellules naïves s’accumulent en fréquence lors de la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection. Considérant que les cellules naïves expriment déjà des hauts niveaux de PD-1, nous avons émis l’hypothèse que l’activation initiale des cellules T chez les individus chroniquement infectés est affectée. En résumé, nous proposons un modèle où des hauts niveaux d’expression de PD-1 sont associés à (1) un dysfonctionnement de la réponse cellulaire T CD8+ et (2) un défaut d’activation des cellules naïves ce qui contribue non seulement à la progression de la maladie mais aussi ce qui va limiter l’efficacité de potentiels vaccins dans l’infection par le VIH-1 en empêchant toute nouvelle réponse d’être initiée. Afin de mieux disséquer la réponse immunitaire mise en place lors d’une infection comme celle du VIH-1, nous avons développé un outil qui permet de détecter les cellules T CD4+ i.e. des tétramères de CMH de classe II. Ces réactifs ont pour but d’augmenter l’avidité du CMH de classe II pour son ligand et donc de détecter des TCR de faible affinité. Dans cette thèse, nous décrivons une méthode originale et efficace pour produire diverses molécules de HLA-DR liant de façon covalente le peptide antigénique. Mieux déterminer les mécanismes responsables de l’exhaustion des cellules T dans l’infection par le VIH-1 et de la progression de la maladie, ainsi que développer des outils de pointe pour suivre ces réponses T, est central à une meilleure compréhension de l’interaction entre le virus et le système immunitaire de l’hôte, et permettra ainsi le développement de stratégies pertinentes pour lutter contre l’infection par le VIH-1.