O contributo da rotoscopia na relação entre cinema de animação e artes plásticas

A par de uma curta-metragem de animação intitulada Tele-sofia, o prosente trabalho enfatizará a importância do desenho como base das artes plásticas. Partindo deste pressuposto, a identificação, compreensão e inclusão das componentes estruturais do desenho poderão ser fortes adjuvantes na reconversão de práticas tendencialmente mais tecnologizadas em poéticas dos materiais e do atelier, distintivas das artes plásticas. Assim, na direta medida em que a rotoscopia se fundamente no desenho responsivo - como uma extensão das possibilidades do desenho de modelo - ir-se-á integrando no campo artístico, tornando a obra resultante numa animação de experiências plásticas. Afinal, o desenho não se confina à perfeição reprodução mecânica da realidade - a mimesis - ele requer interpretações idiossincráticas e uma profunda empatia com o referente, dados apenas registados por um instrumento sensível: o artista.

Identificação sorológica intratípica de poliovírus pelo "método da comparação dos índices de neutralização"

O método da comparação dos índices de neutralização (SMIT & WILTERDINK, 1966) foi utilizado na identificação sorológica intratípica de 49 poliovírus, pertencentes aos três tipos imunológicos e isolados de casos clínicos com e sem contato conhecido com a vacina oral de Sabin. O método foi também comparado com o método de Wecker e com o marcador RCT40 no estudo da identificação intratípica das estirpes do tipo 3. Os soros imunes necessários às reações de neutralização foram preparados em cobaias com as estirpes vacinais LSc2ab, P712Ch2ab e Leon 12a1b. As estirpes - dos tipos 1 e 3 - isoladas dos indivíduos sem contato conhecido com a vacina oral, foram todas identificadas como heterólogas às respectivas estirpes vacinais e as provenientes dos indivíduos com contato (recém-vacinados e contatos) foram identificadas como isólogas às respectivas estirpes vacinais, exceto duas, das quais uma (do tipo 1) foi identificada como intermediária e a outra (do tipo 3) como heteróloga. Não foi possível interpretar convenientemente os resultados das provas de identificação das estirpes do tipo 2, porque o índice de neutralização do protótipo Lansing, ao contrário dos índices das estirpes de referência dos tipos 1 e 3, não deu resultados constantes em provas consecutivas na presença do sôro anti-P712Ch2ab. No estudo da identificação intratípica dos poliovírus do tipo 3, o método da comparação dos índices de neutralização forneceu resultados plenamente concordantes com os obtidos pelo método de Wecker, com isto evidenciando ser um método igualmente satisfatório e, devido à relativa simplicidade de sua técnica, melhor indicado para inquéritos epidemiológicos, quando se examina a procedência de numerosas estirpes. Os resultados obtidos com o marcador RCT40 mostraram a importância de utilizar provas de diferenciação sorológica intratípica na identificação dos vírus da poliomielite em áreas de vacinação, devido à instabilidade do caráter RCT40 das estirpes do tipo 3.

Comportamento imunológico das vacinas anti-meningocócicas

A doença meningocócica continua sendo um grande problema de saúde pública em todos os continentes, e as vacinas anti-meningocócicas têm sido indicadas na prevenção e controle de epidemias. As vacinas polissacarídicas A e C são relativamente eficazes, com comportamentos imunológicos distintos frente às faixas etárias; no entanto, para o sorogrupo B, embora existam numerosos estudos internacionais até agora já desenvolvidos, ainda não se tem uma vacina altamente segura e eficaz de ampla aceitação. O polissacáride capsular do meningococo B não é imunogênico devido ao seu mimetismo com componentes celulares do hospedeiro. Tentativas de se introduzir carreadores protéicos vêm sendo feitas para se obter uma vacina que seja imunogênica em todas as faixas etárias e de preferência protetora contra todos os meningococos. Foi feita revisão da literatura com o objetivo de estudar o comportamento imunológico de todas as vacinas, até então desenvolvidas, e mostrar os esforços que estão sendo empreendidos no sentido de se buscar um produto seguro e eficaz para o controle da doença meningocócica

Immune cell changes in response to a swimming training session during a 24-h recovery period

Understanding the impact of training sessions on the immune response is crucial for the adequate periodization of training, to prevent both a negative influence on health and a performance impairment of the athlete. This study evaluated acute systemic immune cell changes in response to an actual swimming session, during a 24-h recovery period, controlling for sex, menstrual cycle phases, maturity, and age group. Competitive swimmers (30 females, 15 ± 1.3 years old; and 35 males, 16.5 ± 2.1 years old) performed a high-intensity training session. Blood samples were collected before, immediately after, 2 h after, and 24 h after exercise. Standard procedures for the assessment of leukogram by automated counting (Coulter LH 750, Beckman) and lymphocytes subsets by flow cytometry (FACS Calibur BD, Biosciences) were used. Subjects were grouped according to competitive age groups and pubertal Tanner stages. Menstrual cycle phase was monitored. The training session induced neutrophilia, lymphopenia, and a low eosinophil count, lasting for at least 2 h, independent of sex and maturity. At 24 h postexercise, the acquired immunity of juniors (15-17 years old), expressed by total lymphocytes and total T lymphocytes (CD3+), was not fully recovered. This should be accounted for when planning a weekly training program. The observed lymphopenia suggests a lower immune surveillance at the end of the session that may depress the immunity of athletes, highlighting the need for extra care when athletes are exposed to aggressive environmental agents such as swimming pools

Uso racional do medicamento: contributo da publicidade e da adequada conservação

A globalização do uso de sistemas de informação e comunicação mais rápidos, mais interactivos e dinâmicos, as novas tecnologias de comunicação podem influenciar de forma positiva ou de forma gravemente negativa o uso racional do medicamento. Por medicamento entende-se “toda a substância ou composição que possua propriedades curativas ou preventivas das doenças e dos seus sintomas, do Homem ou do animal, com vista a estabelecer um diagnóstico médico ou a restaurar, corrigir ou modificar as suas funções orgânicas” (Decreto-Lei nº 72/91), sendo constituído por substâncias activas, excipientes e adjuvantes. Todos estes constituintes podem sofrer alterações físico-químicas que não são necessariamente visíveis a olho nu, mas que alteram a qualidade e modificam as suas funções no organismo humano. Destes factores os mais importantes são a temperatura, a humidade e a luz. A informação acerca do medicamento é fundamental e envolve diferentes níveis de comunicação, sendo de referir como indispensável uma boa identificação da embalagem exterior (cartonagem), rótulo e folheto informativo, com informação precisa para a efectiva segurança do medicamento, como por exemplo, ao nível da sua conservação. A publicidade como meio de informação e comunicação deve prestar uma informação detalhada e obedecer a normas legais. Não deverá defender o consumo indiscriminado de medicamentos, nem levar a crer que este é um bem de consumo. Com base na análise documental da legislação aplicável, das normativas nacionais e internacionais e de artigos de revisão e opinião pretende-se identificar os principais factores de alteração dos medicamentos e os locais mais apropriados para o seu armazenamento, assim como caracterizar o enquadramento legal da publicidade a medicamentos de uso humano em Portugal.

Avaliação da influência do cimento na interação cimento-superplastificante

Um dos materiais mais utilizados na indústria da construção civil é o betão. É um material cuja aplicação é diversificada: edifícios, pontes, barragens, entre outros e tem tido um grande desenvolvimento ao longo dos tempos. A sua ampla utilização deve-se às suas características, tais como a trabalhabilidade (no estado fresco), a durabilidade ou a resistência a cargas e ao fogo (no estado endurecido). O cimento é o principal componente para obtenção de betão, constituindo o ligante que o manterá coeso. Como referido, uma das características mais importantes no betão é a sua trabalhabilidade, a qual, quando expressa em termos de fluidez, é otimizada com o recurso de adjuvantes na composição do betão. Os adjuvantes com maior eficácia são os superplastificantes, que são substâncias fluidificantes que permitem a redução da quantidade de água numa mistura, mantendo a trabalhabilidade melhorando outras características, tais como a resistência à compressão. No entanto, a eficácia dos adjuvantes depende não só das suas características e dosagem, mas também como interagem com o cimento. Este trabalho teve como objetivo, avaliar a influência que as propriedades do cimento têm na interação cimento-superplastificante. Para isto, foram estudados três tipos cimentos diferentes e três superplastificantes diferentes. Os cimentos e superplastificantes foram caracterizados isoladamente, e depois aplicados em conjunto onde foram estudadas algumas propriedades químicas e físicas. Foram analisados os resultados obtidos, avaliando quais as características dos cimentos que influenciam o comportamento de pastas produzidas os superplastificantes utilizados. Com este estudo, obteve-se como principal conclusão que o teor de sulfatos, álcalis e aluminato tricálcico (C3A) do cimento influenciam fortemente a interação cimentosuperplastificante. E verificou-se que estes componentes não influenciam de igual modo para todos os tipos de cimento e superplastificantes.

Avaliação da resposta humoral à vacina pneumocócica 7-valente em crianças com Aids

OBJETIVO: A doença pneumocócica invasiva é importante causa de morbi-mortalidade em crianças infectadas pelo HIV. O objetivo do estudo foi avaliar quantitativamente a resposta com anticorpos aos sete sorotipos pneumocócicos da vacina em um grupo de crianças infectadas pelo HIV. MÉTODOS: Estudo realizado com 40 crianças infectadas pelo HIV, com idade entre 2 e 9 anos, em seguimento em ambulatório especializado no município de São Paulo, em 2002-2003. A dosagem de anticorpos IgG contra os polissacarídeos da cápsula pneumocócica foi realizada por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA). Os anticorpos foram dosados imediatamente antes e um mês após a aplicação da segunda dose da vacina. Utilizaram-se dois critérios para avaliar a resposta à vacina: títulos de anticorpos >1,3 µg/mL na sorologia pós-imunização e aumento >4 vezes nos títulos da sorologia pós em relação à pré-imunização. RESULTADOS: Para o primeiro critério (>1,3 µg/mL), 26 (65%) crianças obtiveram resposta sorológica à vacina, 12 (30%) delas apresentaram títulos de IgG pós-imunização em níveis de pelo menos 1,3 µg/mL para todos os sorotipos. Para o segundo critério (incremento >4 vezes nos títulos para quatro sorotipos ou mais), obteve-se resposta sorológica para 15 (37,5%) crianças. CONCLUSÕES: A resposta à vacina foi considerada satisfatória, com aumento estatisticamente significante dos títulos geométricos médios pós-vacinais em relação aos pré-vacinais para todos os sorotipos estudados.

Sistema pericial para o estudo de composição de betões

O betão é o material de construção feito pelo Homem mais utilizado no mundo. A sua composição é um processo complexo que exige um conhecimento teórico sólido e muita experiência prática, pelo que poucas pessoas estão habilitadas para o fazer e são muito requisitadas. No entanto não existe muita oferta actual de software que contemple alguns dos aspectos importantes da composição do betão, nomeadamente para o contexto europeu. Nesse sentido, foi desenvolvido um sistema de apoio à decisão chamado Betacomp, baseado num sistema pericial, para realizar estudos de composição de betão. Este contempla as normas legais portuguesas e europeias, e a partir da especificação do betão apresenta toda a informação necessária para se produzir um ensaio de betão. A aquisição do conhecimento necessário ao sistema contou com a colaboração de um especialista com longa e comprovada experiência na área da formulação e produção do betão, tendo sido construída uma base de conhecimento baseada em regras de produção no formato drl (Drools Rule Language). O desenvolvimento foi realizado na plataforma Drools.net, em C# e VB.net. O Betacomp suporta os tipos de betão mais comuns, assim como adições e adjuvantes, sendo aplicável numa grande parte dos cenários de obra. Tem a funcionalidade de fornecer explicações sobre as suas decisões ao utilizador, auxiliando a perceber as conclusões atingidas e simultaneamente pode funcionar como uma ferramenta pedagógica. A sua abordagem é bastante pragmática e de certo modo inovadora, tendo em conta parâmetros novos, que habitualmente não são considerados neste tipo de software. Um deles é o nível do controlo de qualidade do produtor de betão, sendo feito um ajuste de compensação à resistência do betão a cumprir, proporcional à qualidade do produtor. No caso dos produtores de betão, permite que indiquem os constituintes que já possuem para os poderem aproveitar (caso não haja impedimentos técnicos) , uma prática muito comum e que permitirá eventualmente uma aceitação maior da aplicação, dado que reflecte a forma habitual de agir nos produtores.

Expanding our therapeutic options: β-blockers for colon cancer?

Supported by U. Porto/Santander Totta (IJUP) (PP-IJUP2011-320)

Decisões judiciais sobre acesso aos medicamentos em Pernambuco

OBJETIVO: Analisar as decisões do sistema jurídico sobre acesso da população a medicamentos no Sistema Único de Saúde por via judicial quanto a critérios de decisão e eventuais pressões políticas e econômicas. MÉTODOS: Estudo documental descritivo e retrospectivo de abordagem qualitativa e quantitativa. A coleta de dados foi realizada na Superintendência Estadual de Assistência Farmacêutica de Pernambuco, utilizando-se como fontes de dados 105 ações judiciais e relatórios administrativos de janeiro a junho de 2009. Verificaram-se os medicamentos com pedido ou carta patente no banco de dados do Instituto Nacional de Propriedade Industrial para identificar a frequência das patentes nas ações judiciais. Os dados obtidos foram classificados conforme o Sistema Anatômico Terapêutico Químico. Para análise das decisões judiciais, foi utilizada a teoria dos sistemas sociais autopoiéticos. RESULTADOS: As ações judiciais somaram 134 medicamentos com valor estimado de R$ 4,5 milhões para atender aos tratamentos solicitados; 70,9% dos medicamentos estavam com carta patente ou pedido e se concentraram em três classes terapêuticas: antineoplásicos e moduladores imunológicos, aparelho digestório e metabolismo, órgãos dos sentidos. Foram identificadas seis ideias centrais com os critérios de decisão dos magistrados (Constituição Federal e prescrição médica) e as pressões entre os sistemas do direito, da economia e da política quanto ao acesso a medicamentos. CONCLUSÕES: A análise das decisões judiciais fundamentadas na teoria dos sistemas sociais autopoiéticos permitiu identificar as estimulações mútuas (dependências) entre o sistema do direito e demais sistemas sociais em relação à questão do acesso dos cidadãos aos medicamentos. Essas dependências foram representadas pela Constituição Federal e pela propriedade intelectual. A Constituição Federal e a prescrição médica foram identificadas como critério de decisão nas ações judiciais. A propriedade intelectual representou eventuais pressões políticas e econômicas, especialmente nos casos de lançamento de medicamentos no mercado.

Cisticercose músculo-cutânea e visceral - doença rara?

O presente trabalho teve como objetivos estimar a freqüência das formas músculo-cutánea e visceral da cisticercose em exames anátomo-patológicos e necrópsias realizados em Brasilia, Distrito Federal (estudo retrospectivo) e diagnosticar a cisticercose músculo-cutânea em pacientes residentes na mesma região geográfica (estudo prospectivo). Em 64.911 protocolos de exames anátomo-patológicos, o diagnóstico de cisticercose foi observado em 30 (0,05%), sendo que em 27 (90,0%) os cistos estavam nos tecidos músculo-cutâneo-mucoso, em 1 (3,3%) em gânglio e em 2 (6,7%) no sistema nervoso central. Entre aqueles com cistos nos tecidos músculo-cutâneo-mucoso 2 (7,4%) tinham cisticercos em língua. Em 1520 protocolos de necrópsia, encontraram-se 25 (1,6%) com diagnóstico de cisticercose, sendo: 24(96,0%) com neurocisticercose, seja isolada ou associada a outras formas da doença; e 2 (8,0%) com cisticercos em coração, 2 (8,0%) em músculo esquelético e 1 (4,0%) em fígado, seja isolados ou associados a outras localizações do parasito. Foram também examinados 1122 indivíduos, realizando-se em todos eles as reações sorológicas de imunofluorescência indireta e ELISA para cisticercose e a investigação radiológica de partes moles e crânio. Encontraram-se 59 (5,3%) com ambas reações sorológicas reagentes (10 entre eles com o diagnóstico de cisticercose confirmado por biópsias); e 32 (2,8%) com calcificações nas radiografias de partes moles e/ou crânio, mas apresentando ambas reações sorológicas não-reagentes. Entre os pacientes com os testes imunológicos reagentes, a neurocisticercose foi diagnosticada em 39 (66,1%), a cisticercose muscular em 25 (42,4%); a cutânea em 12 (20,3%); e a visceral em 2 (3,4%), sendo em 1 (1,7%) ovariana e em 1 (1,7%) miocárdica, pleural e renal. Os resultados permitem concluir que a forma músculo-cutânea é observada freqüentemente entre pacientes com cisticercose residentes em Brasília. A forma visceral também foi encontrada, com os cisticercos localizados em diferentes órgãos, sendo que os pacientes afetados não apresentavam as manifestações clínicas.

Aspectos ecológicos da leishmaniose tegumentar americana: 9. Prevalência/incidência da infecção humana nos municípios de Pedro de Toledo e Miracatu, São Paulo, Brasil

Este trabalho apresenta aspectos epidemiológicos da leishmaniose tegumentar nos municípios de Pedro de Toledo e Miracatu, região do Vale do Ribeira, estado de São Paulo, referente ao período 1973-1984. Foi feita uma análise retrospectiva de 108 e 65 casos humanos, respectivamente, para os dois municípios acima. Outro estudo prospectivo foi realizado através do exame clínico e testes de Montenegro, imunofluorescência indireta (IF) e hemaglutinação passiva (HA). Duzentos e setenta e três pessoas foram examinadas, sendo que 22 tinham leishmaniose clínica; 10,2 e 12,8% foram soropositivos à IF e HA, respectivamente. O teste de Montenegro foi aplicado em 154 indivíduos residentes em Pedra do Largo, com prevalência de 25,5% de infecção humana. Destes, 5,8% eram crianças com idade entre 0 e 9 anos. A morbidade mostrou-se variável no tempo, manifestada sob a forma de surtos epidêmicos explosivos e sugerindo feição cíclica ainda mal definida. Notou-se tendência para incidência nula em período subseqüente a cada surto. O aspecto epidemiológico geral mostra uma leishmaniose tegumentar com baixa endemicidade. O padrão de transmissão pareceu não depender do contato do homem com a floresta e a infecção humana sem distinção entre crianças e adultos

Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em áreas endémicas

RESUMO A Leptospirose é uma zoonose re-emergente causada por espiroquetídeos patogénicos do género Leptospira. Em Portugal, é reconhecida, desde 1931, como uma importante doença infecciosa humana, cuja notificação é obrigatória desde 1986 para todos os serovares. Porém, devido ao acentuado polimorfismo clínico e à dificuldade de um diagnóstico laboratorial especializado, esta patologia nem sempre é confirmada. Com efeito, o isolamento do agente é difícil e o método convencional de diagnóstico, baseado no teste serológico de referência TAM (Teste de Aglutinação Microscópica), não é muito sensível na primeira semana da doença. Assim, foram três os principais objectivos desta dissertação: actualizar o padrão epidemiológico da Leptospirose, após uma extensa revisão bibliográfica da doença (Capítulos 1 e 2); esclarecer os aspectos imunológicos relacionados com os marcadores antigénicos que mais influenciam a regulação da resposta humoral na infecção humana, em particular, em área endémica (Capítulo 3); e, por último, promover a identificação molecular de alguns isolados de Leptospira, avaliar o respectivo poder patogénico no modelo murino e contribuir para o diagnóstico precoce da doença humana (Capítulo 4). O primeiro dos temas investigados, com base no estudo retrospectivo de uma larga série de 4.618 doentes sintomáticos analisados representa uma caracterização única da epidemiologia da Leptospirose, em particular, na Região Centro do País, e nas ilhas de São Miguel e Terceira (Açores), nos últimos 18 e 12 anos, respectivamente. Foram confirmados 1.024 (22%) casos, com uma distribuição média de 57 casos/ano, sendo a maior frequência no sexo masculino (67%). As áreas analisadas corresponderam à maioria das notificações em Portugal, com uma taxa de incidência média anual nas ilhas muito superior à registada no continente (11,1 vs 1,7/100.000 habitantes, respectivamente). Os adultos em idade activa (25-54 anos) foram os mais afectados, nos meses de Dezembro e Janeiro. A doença foi causada por serovares de nove serogrupos presuntivos de Leptospira interrogans sensu lato, com predomínio de Icterohaemorrhagiae, Pomona e Ballum, em cerca de 66% dos casos. A seropositividade da Leptospirose esteve associada às formas anictérica e ictérica da doença, sendo evidente uma elevada sub-notificação ( 20 casos/ano). Foram detectados e analisados os diversos factores de risco, verificando-se um risco elevado de transmissão em áreas geográficas onde a circulação dos agentes zoonóticos se processa em ciclos silváticos e/ou domésticos bem estabelecidos. Este estudo confirma que a incidência da Leptospirose em Portugal tem aumentado nos últimos anos, particularmente, nos Açores, onde a seropositividade elevada e a ocorrência de casos fatais confirmam esta patologia como um problema emergente de Saúde Pública. No âmbito do Capítulo 3, investigaram-se os aspectos imunológicos da Leptospirose humana na Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em áreas endémicas Região Centro e nas ilhas de São Miguel e Terceira, caracterizando as proteínas e os lipopolissacáridos (LPS) envolvidos durante as fases aguda (estádio único) e tardia da doença (três estádios), através do follow-up serológico de 240 doentes com confirmação clínica e laboratorial de Leptospirose. Foram incluídos no estudo 463 soros, 320 (69%) dos quais, obtidos durante a fase de convalescença (até 6 anos após o início dos sintomas). Soros de dadores de sangue (n=200) e de doentes com outras patologias infecciosas (n=60) foram usados como controlos. As amostras foram testadas pela técnica de Western Blot com lisados de oito estirpes patogénicas pertencentes aos serogrupos mais prevalentes. O reconhecimento dos antigénios leptospíricos, nos quatro estádios evolutivos, resultou da detecção de reactividade específica anti-IgM e anti IgG, nos diferentes immunoblots. Detectaram-se cinco proteínas major (45, 35, 32, 25 e 22 kDa) comuns a todos os serovares. Os soros estudados com as estirpes dos serogrupos homólogos, previamente identificados pela TAM, reagiram contra as proteínas de 45, 32 e 22 kDa, conhecidas como LipL45, LipL32 e LpL21, respectivamente, sendo estes, os antigénios imunodominantes durante o período estudado, nas duas regiões geográficas. Os doentes açorianos mostraram, ainda, uma reactividade elevada contra os LPS, cujo significado é discutido face aos resultados negativos dos soros controlo para os marcadores referidos. Esta investigação indica, pela primeira vez, uma forte persistência da resposta humoral e o importante papel protector da LipL45, Lip32 e LipL21, anos após o início dos sintomas. Por último, procedeu-se à identificação de estirpes Portuguesas, isoladas de murinos e de um caso humano fatal (L. inadai), numa perspectiva polifásica de intervenção. Utilizaram-se três testes fenotípicos (testes de crescimento sob diferentes temperaturas e na presença de 8-azaguanina, a par de um teste de alteração morfológica induzida pela adição de NaCl 1M). Paralelamente, efectuaram-se ensaios de amplificação do gene rrs (16S ARNr) de Leptospira spp por PCR (Polymerase Chain Reaction), utilizando um par de primers “universais” (331 pb) e um segundo par, que apenas amplifica o gene secY (285 pb) de estirpes patogénicas, para definição da identidade dos isolados em estudo. Da integração dos resultados obtidos, confirmou-se que estes ocupam uma posição taxonómica “intermédia” entre as leptospiras saprófitas e as patogénicas. Desenvolveu-se, ainda, uma investigação (complementar) “in vivo” do carácter taxonómico “intermédio” do referido isolado humano, por cultura e amplificação do respectivo ADN de tecidos de hamsters inoculados para o efeito. Esta metodologia molecular foi posteriormente utilizada, com sucesso, no diagnóstico precoce de doentes com Leptospirose, sendo uma mais-valia na confirmação laboratorial de infecção por Leptospira, na ausência de anticorpos específicos na fase inicial da doença.

Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em Áreas Endémicas

RESUMO A Leptospirose é uma zoonose re-emergente causada por espiroquetídeos patogénicos do género Leptospira. Em Portugal, é reconhecida, desde 1931, como uma importante doença infecciosa humana, cuja notificação é obrigatória desde 1986 para todos os serovares. Porém, devido ao acentuado polimorfismo clínico e à dificuldade de um diagnóstico laboratorial especializado, esta patologia nem sempre é confirmada. Com efeito, o isolamento do agente é difícil e o método convencional de diagnóstico, baseado no teste serológico de referência TAM (Teste de Aglutinação Microscópica), não é muito sensível na primeira semana da doença. Assim, foram três os principais objectivos desta dissertação: actualizar o padrão epidemiológico da Leptospirose, após uma extensa revisão bibliográfica da doença (Capítulos 1 e 2); esclarecer os aspectos imunológicos relacionados com os marcadores antigénicos que mais influenciam a regulação da resposta humoral na infecção humana, em particular, em área endémica (Capítulo 3); e, por último, promover a identificação molecular de alguns isolados de Leptospira, avaliar o respectivo poder patogénico no modelo murino e contribuir para o diagnóstico precoce da doença humana (Capítulo 4). O primeiro dos temas investigados, com base no estudo retrospectivo de uma larga série de 4.618 doentes sintomáticos analisados representa uma caracterização única da epidemiologia da Leptospirose, em particular, na Região Centro do País, e nas ilhas de São Miguel e Terceira (Açores), nos últimos 18 e 12 anos, respectivamente. Foram confirmados 1.024 (22%) casos, com uma distribuição média de 57 casos/ano, sendo a maior frequência no sexo masculino (67%). As áreas analisadas corresponderam à maioria das notificações em Portugal, com uma taxa de incidência média anual nas ilhas muito superior à registada no continente (11,1 vs 1,7/100.000 habitantes, respectivamente). Os adultos em idade activa (25-54 anos) foram os mais afectados, nos meses de Dezembro e Janeiro. A doença foi causada por serovares de nove serogrupos presuntivos de Leptospira interrogans sensu lato, com predomínio de Icterohaemorrhagiae, Pomona e Ballum, em cerca de 66% dos casos. A seropositividade da Leptospirose esteve associada às formas anictérica e ictérica da doença, sendo evidente uma elevada sub-notificação ( 20 casos/ano). Foram detectados e analisados os diversos factores de risco, verificando-se um risco elevado de transmissão em áreas geográficas onde a circulação dos agentes zoonóticos se processa em ciclos silváticos e/ou domésticos bem estabelecidos. Este estudo confirma que a incidência da Leptospirose em Portugal tem aumentado nos últimos anos, particularmente, nos Açores, onde a seropositividade elevada e a ocorrência de casos fatais confirmam esta patologia como um problema emergente de Saúde Pública. No âmbito do Capítulo 3, investigaram-se os aspectos imunológicos da Leptospirose humana na Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em áreas endémicas Região Centro e nas ilhas de São Miguel e Terceira, caracterizando as proteínas e os lipopolissacáridos (LPS) envolvidos durante as fases aguda (estádio único) e tardia da doença (três estádios), através do follow-up serológico de 240 doentes com confirmação clínica e laboratorial de Leptospirose. Foram incluídos no estudo 463 soros, 320 (69%) dos quais, obtidos durante a fase de convalescença (até 6 anos após o início dos sintomas). Soros de dadores de sangue (n=200) e de doentes com outras patologias infecciosas (n=60) foram usados como controlos. As amostras foram testadas pela técnica de Western Blot com lisados de oito estirpes patogénicas pertencentes aos serogrupos mais prevalentes. O reconhecimento dos antigénios leptospíricos, nos quatro estádios evolutivos, resultou da detecção de reactividade específica anti-IgM e anti IgG, nos diferentes immunoblots. Detectaram-se cinco proteínas major (45, 35, 32, 25 e 22 kDa) comuns a todos os serovares. Os soros estudados com as estirpes dos serogrupos homólogos, previamente identificados pela TAM, reagiram contra as proteínas de 45, 32 e 22 kDa, conhecidas como LipL45, LipL32 e LpL21, respectivamente, sendo estes, os antigénios imunodominantes durante o período estudado, nas duas regiões geográficas. Os doentes açorianos mostraram, ainda, uma reactividade elevada contra os LPS, cujo significado é discutido face aos resultados negativos dos soros controlo para os marcadores referidos. Esta investigação indica, pela primeira vez, uma forte persistência da resposta humoral e o importante papel protector da LipL45, Lip32 e LipL21, anos após o início dos sintomas. Por último, procedeu-se à identificação de estirpes Portuguesas, isoladas de murinos e de um caso humano fatal (L. inadai), numa perspectiva polifásica de intervenção. Utilizaram-se três testes fenotípicos (testes de crescimento sob diferentes temperaturas e na presença de 8-azaguanina, a par de um teste de alteração morfológica induzida pela adição de NaCl 1M). Paralelamente, efectuaram-se ensaios de amplificação do gene rrs (16S ARNr) de Leptospira spp por PCR (Polymerase Chain Reaction), utilizando um par de primers “universais” (331 pb) e um segundo par, que apenas amplifica o gene secY (285 pb) de estirpes patogénicas, para definição da identidade dos isolados em estudo. Da integração dos resultados obtidos, confirmou-se que estes ocupam uma posição taxonómica “intermédia” entre as leptospiras saprófitas e as patogénicas. Desenvolveu-se, ainda, uma investigação (complementar) “in vivo” do carácter taxonómico “intermédio” do referido isolado humano, por cultura e amplificação do respectivo ADN de tecidos de hamsters inoculados para o efeito. Esta metodologia molecular foi posteriormente utilizada, com sucesso, no diagnóstico precoce de doentes com Leptospirose, sendo uma mais-valia na confirmação laboratorial de infecção por Leptospira, na ausência de anticorpos específicos na fase inicial da doença.

Mediterranean spotted fever and identification of new agents of rickettsioses in Portugal : epidemiological determinants, host and microbial features in portuguese patients

Resumo: a febre botonosa, também conhecida por febre escaro-nodular (FEN) é uma doença endémica nos Países da bacia do Mediterrâneo, África, Médio Oriente, Índia e Paquistão. O agente etiológico responsável por esta patologia é a bactéria Rickettsia conorii. Contudo, em alguns países, como Portugal e Itália, esta patologia é causada por duas estirpes diferentes: R conorii Malish e R conorii Israeli spotted fever strain. O principal vector e reservatório é o ixodídeo Rhipicephalus sanguineus. Mesmo com uma elevada taxa de subnotificação detectada no nosso País, a taxa incidência da FEN é de 8.4/105 habitantes (1989-2005), uma das mais altas quando comparada coom a de outros países da bacia do Mediterrâneo. De todos os distritos portugueses, Bragança e Beja são aqueles que apresentam as taxas de incidência mais elevadas, 56,8/105 habitantes e 47,4 / 105 habitantes respectivamente. Em Portugal, as alterações climáticas verificadas na última década, nomeadamente a subida das temperaturas médias anuais, parecem ter influenciado o ciclo de vida do vector e a sua dinâmica sazonal, permitindo ao R. sanguineus completar mais de um ciclo de vida por ano. Este facto, e a possibilidade deste vector se manter activo noutros meses do ano, nomeadamente nos meses de inverno, tem influenciado consequentemente o padrão de distribuição anual dos casos de FEN. A febre escaro-nodular caracteriza-se clinicamente como uma doença exantemática, com um processo de vasculite generalizado. Apesar de na generalidade ser considerada uma doença benigna (quando tratada atempadamente e com terapêutica adequada e específica)e de estarem descritos casos graves em cerca de 5-6% dos doentes, em Portugal essa percentagem aumentou e consequentemente levou a um aumento de casos fatais. Este facto tornou-se mais evidente em 1997, no Hospital Distrital de Beja e no Hospital Garcia de Orta, onde a taxa de letalidade atingiu os 32% e 18% respectivamente.Para além dos factores de co-morbilidade encontrados nos doentes mais graves, como diabetes mellitus, ou o atraso na instituição da terapêutica específica, foi colocada de que a estirpe R. conorii Israel spotted fever strain pudesse ser mais virulenta ou então estivesse associada a diferentes manifestações clínicas que dificultassem o diagnóstico clínico e a instituição atempada da terapêutica. Houve ainda a necessidade de avaliar alguns parâmetros imunológicos dos doentes e tentar identificar que factores, nomeadamente que citoquinas, poderiam estar envolvidos na resposta a uma infecção por R.conorii.Face a estas questões foi avaliada e comparada a epidemiologia, manifestações clínicas e laboratoriais de 140 doentes (71 infectados com R. conorii Malish e 69 infectados com R. conorii Israel spotted fever strain). Concluiu-se que existe uma sobreposição de manifestações clinicas entre os dois grupos de doentes, mas que a percentagem da escara de inoculação é significativamente inferior em doentes infectados com R. conorii Israel spotted fever strain. Dos resultados mais importantes encontrados neste estudo concluiu-se que a estirpe R. conorii Malish e é demonstrado, pela primeira vez, estatisticamente que o alcoolismo é um factor de risco para a morte de doentes com FEN. Associadas a factores de um mau prognósitco da doença, estão as manifestações gastrointestinais, que poderão ser ou não reflexo de alterações do sistema nervoso central, e ainda a alteração de parâmetros laboratoriais como a presença de hiperbilirubinemia e aumento dos valores da ureia.A maior parte dos estudos realizados sobre os mecanismos da resposta imunitária à infecção por R. conorii e as interacções hospedeiro - agente etiológico têm sido elucidados com base em modelos animais. Poucos estudos têm sido efectuados em doentes e nenhum estudo prévio tinha sido realizado no sentido de avaliar localmente (escara/pele) quais os mediadores ou outras moléculas envolvidas na resposta imunitária às rickettsioses. Foi avaliado o nível de expressão génica de RNA mensageiro (RNAm)de diferentes citoquinas em amostras de pele de doentes com FEN pela técnica de PCR em tempo real.Os resultados deste estudo mostraram que, quando comparado com o grupo controlo, os 23 doentes analisados apresentavam níveis estatisticamente significativos, mais elevados de expressão génica de interferão (IFN-γ, Tumor necrosis factor (TFN-α, interleucina 10 (IL-10, RANTES (regulated by activation, normal T-cell-expressed and secreted chemokine)e indolamina 2-3 desoxigenase (IDO),uma enzima envolvida no controlo e limitação do crescimento intracelular das rickettsias, através da degradação do triptofano. Seis dos 23 doentes apresentaram ainda niveis de expressão elevados de óxido nítrico indutível (iNOS)que actua como microbicida. Encontrou-se uma correlação positiva entre a expressão de RNAm de TNF-α, γ, iNOS e IDO e os casos menos graves de FEN sugerindo um tipo de resposta imunitária tipo Th1, i.e. com papel protector na resposta à infecção.Verificou-se também que os valores de expressão genética do RNAm de IL-10, estavam inversamente correlacionados com a expressão do RNAm de TNF-α e IFN-γ. Os casos menos graves de FEN parecem assim envolver um balanço entre a resposta pró-inflamatória e anti-inflamatória. Já os níveis de expressão génica do RNAm de IL-10 estavam inversamente correlacionados com a expressão RNAm de TNF-α e IFN-γ. Os casos menos graves de FEN parecem assim envolver um balanço entre uma resposta pró-inflamatória e anti-inflamatória. Já os níveis de expressão RNAm da quimoquina RANTES foram estatisticamente mais elevados em doentes graves.Nesta dissertação é ainda descrita uma nova rickettsiose presente em Portugal, causada pela bactéria R. sibirica mongolitimonae, que foi identificada laboratorialmente por isolamento do agente, e por detecção do DNA em biopsia de pele. A presença deste agente foi ainda corroborada pela detecção em paralelo do mesmo agente no ixodídeos como R. africae like e em pulgas como R. felis e R.typhi alertam para a possibilidade de existência de outras rickettsioses que possam estar diagnosticadas em Portugal. Abstract: Mediterranean spotted fever (MSF), a tick-borne disease caused by Rickettsia conorii, is widley distributed in the Old World, being endemic in the southern Europe, Africa, Middle East, India and Pakistan. In Portugal two strains cause disease: R.conorii Malish and R.conorii Israeli spotted fever.Rhipicephalus sanguineus, the brown dog tick, is considered the main vector and reservoir. MSF is characterized by seasonality, and most of cases are encountered in late spring and summer, peaking in July and August. However, CEVDI/INSA laboratory has observed that the incidence of MSF cases has changed during winter season.The increasing annual averages of air temperatures and warmer and drier winters might have influenced the dynamics of the life cycle and activity of R. sanguineus, and indirectley the number MSF cases during the so called MSF off-season.In the period of 1989-2005, the incidence rate of MSF was 8.4/105 inhabitants, one of the highest rates compared with other endemic countries. In the Portugal during the same period, the highest incidence rates were reported in the districts of Bragança, with 56.8/105 inhabitants, and Beja, with 47.4/105 inhabitants. Severe cases of MSF are reported in 6% of the patients, but it seems that this pattern of disease in Portugal has been changing.This factor became more evident in 1997, with a reported case fatality rate of 32% and 18% in patients with MSF admited at Beja and Garcia Orta Hospitals, respectively. Although it was found that diabetes mellitus and delay in therapy have been implicated as a risk factor for death, the hypothesis was considered, that the new ISF strain isolated from Portugueses patients in the same year (1997)causes different or atypical clinical conorii Malish strain. The local (skin biopsies) immune response to R. conorii infection was also evaluated.A prospective study was performed to characterized epidemiological, clinical, laboratory features and determined risk factors for a fatal outcome. One hundred forty patients (51% patients were infected with Rickettsia conorii Malish stain and 49% with Israeli spotted fever strain)with diagnosis documented with identification of the causative rickettsial strain were admitted to 13 Portugueses Hospitals during 1994-2006.Comparison of the clinical manifestations of MSF caused by Malish and ISF strains revealed tremendous overlap that would not permit clinical recognition of the strain envolved, but an eschar was observed in a significantly higher percentage of patients with Malish than ISF strain.A fatal outcome was significantly more likely for patients with ISF strain infection meaning that ISF strain was more virulent than Malish strain, and also alcoholism was a host risk factor for a fatal outcome.The pathophysiology of a fatal outcome involved significantly greater incidence of petechial rash, gastrointestinal symptoms, confusion/obtundation, dehydration, tachypnea, hepatomegaly, leukocytosis, coagulopathy, azotemia, hyperbilirubinemia, and elevated hepatic enzymes and creatine kinase. Multivariate analysis revealed that acute renal failure and hyperbilirubinemia were most strong associated with a fatal oucome of infections with both strains.The immune response to R. conorii infection determined with both strains. The immune response to R. conorii infection determined by the expression levels of inflammatory and immune mediators in skin biopsies collected from untreated patients with Mediterranean spotted fever reveal that intralesional expression of mRNA of TNF-α, IFN-γ, IL-10, RANTES, and indoleamine-2, 3-dioxygenase (IDO)an enzyme involved in limiting rickettsial growth by tryptophan degradation, were elevated in skin of MSF patients compared to controls. Six patients had elevated levels of inducible nitric oxide synthase (NOS2, a source microbicidal nitric oxide.Positive correlations among TNF-α, IFN-γ, NOS2,IDO and mild-to-moderate disease suggested that type 1 polarization plays a protective role. Significantly high levels of intralesional IL-10 were inversely correlated with IFN-γ and TNF-α. The chemokine RANTES was significantly higher in patients with several MSF. It seems that MSF patients with mild-to-moderate disease have a strong and balanced intralesional pro-inflammatory and anti-inflammatory response, while severe disease is associated with higher chemokine expression.Whether these findings are simply a correlate of mild and severe disease or contribute to anti-rickettsial immunity and pathogenesis remains to be determined.In this dissertation is also described a new rickettsiois present in Portugal caused by R.sibirica mongolitimonae strain, identified based on agent isolation and DNA detection by PCR technique in a skin biopsy.The presence of this agent corroborated by its detection also in Rhipicephalus pusillus tick. Also, pathogenic tick and flea-borne rickettsial agents such as R. africae strain detected in Rhipicephalus bursa tick, and R.felis and R.typhi detected in different fleas species raise the alert for the possible existence of other rickettsioses in Portugal that might be underdiagnosed.