Characterization of Novel OmpA-Like Protein of Leptospira interrogans That Binds Extracellular Matrix Molecules and Plasminogen

Leptospira interrogans is the etiological agent of leptospirosis, a zoonotic disease of human and veterinary concern. The identification of novel proteins that mediate host-pathogen interactions is important for understanding the bacterial pathogenesis as well as to identify protective antigens that would help fight the disease. We describe in this work the cloning, expression, purification and characterization of three predicted leptospiral membrane proteins, LIC10258, LIC12880 (Lp30) and LIC12238. We have employed Escherichia coli BL21 (SI) strain as a host expression system. Recently, we have identified LIC12238 as a plasminogen (PLG)-binding receptor. We show now that Lp30 and rLIC10258 are also PLG-receptors of Leptospira, both exhibiting dose-dependent and saturating binding (K(D), 68.8 +/- 25.2 nM and 167.39 +/- 60.1 nM, for rLIC10258 and rLIC12880, respectively). In addition, LIC10258, which is a novel OmpA-like protein, binds laminin and plasma fibronectin ECM molecules and hence, it was named Lsa66 (Leptospiral surface adhesin of 66 kDa). Binding of Lsa66 to ECM components was determined to be specific, dose-dependent and saturable, with a KD of 55.4 +/- 15.9 nM to laminin and of 290.8 +/- 11.8 nM to plasma fibronectin. Binding of the recombinant proteins to PLG or ECM components was assessed by using antibodies against each of the recombinant proteins obtained in mice and confirmed by monoclonal anti-polyhistidine antibodies. Lsa66 caused partial inhibition on leptospiral adherence to immobilized ECM and PLG. Moreover, this adhesin and rLIC12238 are recognized by antibodies in serum samples of confirmed leptospirosis cases. Thus, Lsa66 is a novel OmpA-like protein with dual activity that may promote the attachment of Leptospira to host tissues and may contribute to the leptospiral invasion. To our knowledge, this is the first leptospiral protein with ECM and PLG binding properties reported to date.

Cell surface expression of adhesins for fibronectin correlates with virulence in Sporothrix schenckii

The virulence of four Sporothrix schenckii isolates was compared in a murine model of sporotrichosis, together with the protein pattern of the yeast cell surface and the capacity to bind the extracellular matrix protein fibronectin. Virulence was determined by the mortality rate, fungal burden and histopathology. Two clinical isolates were more virulent for C57BL/6 mice, but no direct correlation was seen between virulence and the clinical or environmental origin of the isolates. The lowest virulence was observed for an isolate recovered from a patient with meningeal sporotrichosis. Although all isolates could effectively disseminate, the dissemination patterns were not similar. Using flow cytometry analysis, we investigated the interaction of all the strains with fibronectin, and showed that the binding capacity correlated with virulence. Western blot analysis of S. schenckii cell wall extracts revealed positive bands for fibronectin in the range of 3792 kDa. The 70 kDa adhesin was also recognized by a protective monoclonal antibody raised against a gp70 antigen of S. schenckii (mAb P6E7). Confocal microscopy confirmed the co-localization of fibronectin and mAb P6E7 on the yeast cell surface. To our knowledge, this is the first report identifying adhesins for fibronectin on the surface of this human pathogen.

Enolase from Paracoccidioides brasiliensis: isolation and identification as a fibronectin-binding protein

Paracoccidioides brasiliensis yeast cells can enter mammalian cells and may manipulate the host cell environment to favour their own growth and survival. Moreover, fibronectin and several other host extracellular matrix proteins are recognized by various components of the yeast cell extracts. The present study was designed to isolate and characterize a fibronectin-binding protein from P. brasiliensis. We also compared P. brasiliensis strain 18, tested before (Pb18a) and after (Pb18b) animal passage, in relation to its adhesion and invasion processes. Extracts from both samples, when cultured on blood agar solid medium, showed higher levels of protein expression than when the same samples were cultured on Fava-Netto solid medium, as demonstrated by two-dimensional electrophoresis and SDS-PAGE. Also, both Pb18a and Pb18b exhibited stronger adhesion to A549 epithelial cells when cultured on blood agar medium than when cultured on Fava-Netto medium. Ligand affinity binding assays revealed a protein of 54 kDa and pl 5.6 in P. brasiliensis cell-free extracts with the properties of a fibronectin-binding adhesin, which was characterized by tryptic digestion and mass spectroscopy as a homologue of enolase from P. brasiliensis. Antibody raised against this 54 kDa protein abolished 80 % of P. brasiliensis adhesion to A549 epithelial cells. Our results demonstrate that P. brasiliensis produces a fibronectin-binding adhesin, irrespective of the culture medium, and that this activity can be inhibited by a specific antibody and is involved in the adhesion of the fungus to pulmonary epithelial cells.

LipL53, a temperature regulated protein from Leptospira interrogans that binds to extracellular matrix molecules

The regulation of gene expression by environmental signals, such as temperature and osmolarity, has been correlated with virulence. In this study, we characterize the protein LipL53 from Leptospira interrogans, previously shown to react with serum sample of individual diagnosed with leptospirosis and to be up-regulated by shift to physiological osmolarity. The recombinant protein was expressed in Escherichia coli system, in insoluble form, recovered by urea solubilization and further refolded by decreasing the denaturing agent concentration during the purification procedure. The secondary structure content of the recombinant LipL53, as assessed by circular dichroism, showed a mixture of beta-strands and alpha-helix. The presence of LipL53 transcript at 28 degrees C was only detected within the virulent strains. However, upon shifted of attenuated cultures of pathogenic strains from 28 degrees C to 37 degrees C and to 39 degrees C, this transcript could also be observed. LipL53 binds laminin, collagen IV, cellular and plasma fibronectin in dose-dependent and saturable manner. Animal challenge studies showed that LipL53, although immunogenic, elicited only partial protection in hamsters. LipL53 is probably surface exposed as seen through immunofluorescence confocal microscopy. Our results suggest that LipL53 is a novel temperature regulated adhesin of L. interrogans that may be relevant in the leptospiral pathogenesis. (C) 2009 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

Lsa63, a newly identified surface protein of Leptospira interrogans binds laminin and collagen IV

Leptospira interrogans is the etiological agent of leptospirosis, a zoonotic disease that affects populations worldwide. We have identified in proteomic studies a protein that is encoded by the gene LIC10314 and expressed in virulent strain of L. interrogans serovar Pomona. This protein was predicted to be surface exposed by PSORT program and contains a p83/100 domain identified by BLAST analysis that is conserved in protein antigens of several strains of Borrelia and Treponema spp. The proteins containing this domain have been claimed antigen candidates for serodiagnosis of Lyme borreliosis. Thus, we have cloned the LIC10314 and expressed the protein in Escherichia coli BL21-SI strain by using the expression vector pAE. The recombinant protein tagged with N-terminal hexahistidine was purified by metal-charged chromatography and characterized by circular dichroism spectroscopy. This protein is conserved among several species of pathogenic Leptospira and absent in the saprophytic strain L. biflexa. We confirm by liquid-phase immunofluorescence assays with living organisms that this protein is most likely a new surface leptospiral protein. The ability of the protein to mediate attachment to ECM components was evaluated by binding assays. The leptospiral protein encoded by LIC10314, named Lsa63 (Leptospiral surface adhesin of 63 kDa), binds strongly to laminin and collagen IV in a dose-dependent and saturable fashion. In addition, Lsa63 is probably expressed during infection since it was recognized by antibodies of serum samples of confirmed-leptospirosis patients in convalescent phase of the disease. Altogether, the data suggests that this novel identified surface protein may be involved in leptospiral pathogenesis. (C) 2009 The British Infection Society. Published by Elsevier Ltd. All rights reserved.

A newly identified protein of Leptospira interrogans mediates binding to laminin

Pathogenic Leptospira is the aetiological agent of leptospirosis, a life-threatening disease that affects populations worldwide. The search for novel antigens that could be relevant in host-pathogen interactions is being pursued. These antigens have the potential to elicit several activities, including adhesion. This study focused on a hypothetical predicted lipoprotein of Leptospira, encoded by the gene LIC12895, thought to mediate attachment to extracellular matrix (ECM) components. The gene was cloned and expressed in Escherichia coli BL21 Star (DE3)pLys by using the expression vector pAE. The recombinant protein tagged with N-terminal hexahistidine was purified by metal-charged chromatography and characterized by circular dichroism spectroscopy. The capacity of the protein to mediate attachment to ECM components was evaluated by binding assays. The leptospiral protein encoded by LIC12895, named Lsa27 (leptospiral surface adhesin, 27 kDa), bound strongly to laminin in a dose-dependent and saturable fashion. Moreover, Lsa27 was recognized by antibodies from serum samples of confirmed leptospirosis specimens in both the initial and the convalescent phases of the disease. Lsa27 is most likely a surface protein of Leptospira as revealed in liquid-phase immunofluorescence assays with living organisms. Taken together, these data indicate that this newly identified membrane protein is expressed during natural infection and may play a role in mediating adhesion of L. interrogans to its host.

Genetic characterization of pilin glycosylation and phase variation in Neisseria meningitidis

Pili of Neisseria meningitidis are a key virulence factor, being the major adhesin of this capsulate organism and contributing to specificity for the human host. Pili are post-translationally modified by addition of either an O-linked trisaccharide, Gal (beta1-4) Gal (alpha1-3) 2,4-diacetamido-2,4,6-trideoxyhexose or an O-linked disaccharide Gal (alpha1,3) GlcNAc. The role of these structures in meningococcal pathogenesis has not been resolved. In previous studies we identified two separate genetic loci, pglA and pglBCD, involved in pilin glycosylation. Putative functions have been allocated to these genes; however, there are not enough genes to account for the complete biosynthesis of the described structures, suggesting additional genes remain to be identified. In addition, it is not known why some strains express the trisaccharide structure and some the disaccharide structure. In order to find additional genes involved in the biosynthesis. of these structures, we used the recently published group A strain Z2491 and group B strain MC58 Neisseria meningitidis genomes and the unfinished Neisseria meningitidis group C strain FAM18 and Neisseria gonorrhoeae strain FA1090 genomes to identify novel genes involved in pilin glycosylation, based on homology to known oligosaccharide biosynthetic genes. We identified a new gene involved in pilin glycosylation designated pglE and examined four additional genes pgIB/B2, pglF, pglG and pglH. A strain survey revealed that pglE and pglF were present in each strain examined. The pglG, pglH and pgIB2 polymorphisms were not found in strain C311#3 but were present in a large number of clinical isolates. Insertional mutations were constructed in pglE and pglF in N. meningitidis strain C311#3, a strain with well-defined lipopolysaccharide (LPS) and pilin-linked glycan structures. Increased gel migration of the pilin subunit molecules of pglE and pglF mutants was observed by Western analysis, indicating truncation of the trisaccharide structure. Antisera specific for the C311#3 trisaccharide failed to react with pilin from these pglE and pglF mutants. GC-MS analysis of the sugar composition of the pglE mutant showed a reduction in galactose compared with C311#3 wild type. Analysis of amino acid sequence homologies has suggested specific roles for pglE and pglF in the biosynthesis of the trisaccharide structure. Further, we present evidence that pglE, which contains heptanucleotide repeats, is responsible for the phase variation between trisaccharide and disaccharide structures in strain C311#3 and other strains. We also present evidence that pglG, pglH and pgIB2 are potentially phase variable.

Detecção e caracterização de patotipos diarreiogênicos de Escherichia coli por métodos fenotípicos e genotípicos em indivíduos de todas as idades atendidos nas unidades de saúde de Vitória-ES

A diarreia é a segunda causa de mortalidade em <5 anos e é responsável pela diminuição da produtividade na população economicamente ativa. Dentre os agentes infecciosos envolvidos, seis patotipos diarreiogênicos de Escherichia coli (DEC) merecem destaque: E. coli enteropatogênica (EPEC), E.coli enteroinvasora (EIEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroemorrágica ou produtora de toxina de Shiga (EHEC/STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli de aderência difusa (DAEC). O objetivo deste estudo foi determinar a frequência dos patotipos de DEC e caracterizar fenotípica e genotipicamente EAEC, DAEC, aEPEC e E. coli chain-like adhesion (CLA) isolados de fezes indivíduos de todas as idades atendidos nas Unidades de Saúde do município de Vitória, ES, entre janeiro de 2008 e junho de 2011. Os isolados de E. coli foram submetidos à: (i) PCR para detecção dos genes eae, bfpA, aat, lt, st, ipaH, stx1 e stx2; (ii) hibridização de colônia com as sondas eae, aat e daaC; (iii) adesão em cultura de células HEp-2 para evidenciar padrão de aderência agregativa (AA), difusa (DA) e chain-like adhesion (CLA). PCR para detecção de genes de virulência foi realizado em isolados de EAEC, CLA, DAEC e aEPEC. Isolados de EAEC e CLA, foram submetidos a testes de formação de biofilme e de película. Foram obtidos 328 espécimes fecais e E. coli foi isolada de 85,7%. Os seguintes patotipos foram identificados: EAEC (18,3%), DAEC (11%), aEPEC (2,6%), ETEC (0,7%). CLA foi identificada em 4,9% e EIEC, tEPEC e STEC não foram detectados. Dos 60 isolados de EAEC (AA) (25% aat+ por PCR e 35% por hibridização), fímbrias de aderência agregativa foram evidenciadas em baixa frequência (aggA- 1,7%, aafA- 0%, agg3A- 11,7%, hdA- 8,3%). EAEC típica correspondeu a 31,7% dos isolados de EAEC (aggR+), e foram significantes nestas a formação de biofilme, escore 3+ de produção de película e presença dos genes aat, agg3A, hdA, aap, sat, pet, set1A e iucA. Todos os isolados CLA apresentaram o gene pet, 87,5%, foram aggR-, formaram película e nenhum produziu biofilme. Dentre dos 42 isolados de DAEC (DA), a sonda daaC detectou 52,4%. PCR evidenciou adesinas afa/Dr (daaD e afa) em 59,5% e adesina AIDA-I não foi encontrada, sugerindo que outras adesinas estejam envolvidas na adesão da DAEC. Isolados de DAEC afa/Dr + foram estatisticamente mais isolados de <5 anos. Em aEPEC, os genes da ilha de patogenicidade OI-122 pesquisados, nleE, efa1/lifA e paa foram evidenciados em 30% dos isolados, todos provenientes de <5 anos. Características de virulência de tEAEC e DAEC Afa/Dr sugerem que sejam subpopulações relacionadas com diarreia. CLA não parece ser variante de EAEC.

Os Media Participativos e o poder da Identidade na Oncologia: o Cidadão e a Instituição enquanto Marcas interactivas

Neste artigo procuramos averiguar a relevância que as marcas e identidades têm nas plataformas participativas no contexto da saúde, em particular na oncologia. Apesar de estas plataformas disponibilizarem aos cidadãos e instituições as mesmas ferramentas, a sua capacidade de mobilização não é a mesma. As instituições parecem ter maior facilidade, mas nem sempre tal acontece. Discutir o conceito de marca e de identidade contribuirá para responder a esta questão, bem como compreender porque é que as diferenças entre os cidadãos e as instituições se podem atenuar nos novos media. Baseamos a nossa análise na observação de páginas do Facebook, de instituições oncológicas e de grupos de apoio de cidadãos; num conjunto de entrevistas a doentes e familiares oncológicos; e em diferentes estudos na saúde. No fim, procura-se esclarecer a importância do estudo das marcas e da identidade, como possível directriz de novas soluções nos media participativos, que contribuam para atenuar o problema individual do cidadão que se relaciona com o cancro.

Estágio no âmbito do projecto de execução de um viaduto de ligação entre a E.M. 575 e a E.M. 533-1 situado no Pinhal Novo

O presente relatório tem como objectivo descrever o trabalho desenvolvido ao longo de um estágio, realizado na empresa Professor Edgar Cardoso - Engenharia e Laboratório de Estruturas, durante o período de Fevereiro de 2009 a Maio de 2010. Durante este período, foi realizado um projecto de execução de um viaduto situado no Pinhal Novo. Este possui um comprimento total de 233,0 metros, suporta duas vias de trânsito em sentidos opostos e é constituído por 7 vãos com a seguinte distribuição: 20,0 m – 30,0 m – 35,0 m – 58,0 m – 40,0 m – 30,0 m – 20,0 m Além de compreender um vão central de 58,0 metros, existe ainda a particularidade de o viaduto atravessar um complexo feixe de linhas férreas e a sua directriz ser completamente curva. O tabuleiro é composto por betão armado, pré-esforçado na direcção longitudinal, encontra-se apoiado sobre os encontros e rigidamente ligado a 6 pilares de secção circular. A secção transversal do tabuleiro é constituída por uma nervura de secção trapezoidal, com 12 metros de largura, espessura variável e vazada no 2º, 4º e 6º vão. O dimensionamento respeitou os regulamentos nacionais em vigor, nomeadamente o Regulamento de Estruturas de Betão Armado e Pré-Esforçado (REBAP), o Regulamento de Segurança e Acções para Edifícios e Pontes (RSA) e o Eurocódigo 1, 2 e 8.

Projecto de traçado de infra-estruturas rodoviárias

O presente relatório enquadra-se no âmbito do trabalho final de Mestrado do curso de Engenharia Civil, área de especialização de Vias de Comunicação e Transportes, do Instituto Superior de Engenharia de Lisboa. O trabalho final de Mestrado consistiu na realização de um estágio centrado no projecto de traçado de infra-estruturas rodoviárias. O estágio teve lugar na empresa Clenci – Clínica de Engenharia Civil, Lda e teve como principal objecto o estudo de vários arruamentos, no âmbito da remodelação do Ramal da Lousã, inserido no Projecto do Metro de Superfície - Metro do Mondego, nomeadamente o reperfilamento do actual Arruamento da Estação Casal de Santo António e a criação de um novo eixo viário de ligação à futura Estação do Corvo. Neste âmbito, as soluções desenvolvidas envolveram o estudo do traçado geométrico, em planta e em perfil longitudinal, assim como a definição dos respectivos perfis transversais tipo, e ainda o dimensionamento de intersecções giratórias, de forma a optimizar a articulação entre os vários arruamentos em estudo. Refere-se, ainda, a importância das várias deslocações ao local para o desenvolvimento do projecto, de modo a caracterizar a situação existente e avaliar eventuais condicionantes.

IKEA em Loures: projecto de execução do traçado da rede de acessibilidades viárias

O principal objectivo da realização deste projecto consistiu em permitir a inserção de novas acessibilidades a um empreendimento de grande dimensão e solicitação de tráfego, sem prejuízo para as acessibilidades actualmente existentes e que possuem finalidade diversa, garantindo segurança na circulação para os utilizadores das vias de comunicação envolvidas. A reformulação do actual Nó de Frielas, que contempla a substituição dos entroncamentos existentes na EN 250 por duas rotundas, com a consequente eliminação das viragens à esquerda, e o aumento da extensão da via de entrecruzamento, visam o aumento da segurança rodoviária, como consequência da intervenção em causa. Para além das modificações nos ramos de ligação e restabelecimentos integrados no Nó Rodoviário, o presente projecto contempla uma rede de infra-estruturas integrando a beneficiação e o alargamento de algumas estradas e arruamentos existentes, novas vias de comunicação que se interligam com as existentes e acessos directos aos parques de estacionamento do futuro empreendimento IKEA. No que diz respeito a software, foi utilizado o AutoCAD Civil 3D para o cálculo dos elementos de traçado rodoviário e para a determinação dos volumes de terraplenagens associados a este projecto, ao passo que o programa AutoTURN foi uma ferramenta essencial para o estudo de manobras mais específicas. Todas as peças desenhadas foram produzidas através do programa de desenho AutoCAD

Nó do Barreiro: ligação da terceira travessia do Tejo à ER11-2 articulação com a rede envolvente, traçado (estudo prévio)

O objectivo deste projecto foi desenvolver, a nível de Estudo Prévio, a solução mais adequada em termos de traçado rodoviário para o Nó do Barreiro, partindo dos pressupostos do Estudo de Viabilidade (Outubro 2006) e do Estudo Prévio (Maio 2008) existentes. Os estudos referidos foram realizados no âmbito da Terceira Travessia do Tejo, tendo sido incluídas as acessibilidades rodoviárias que contêm o Nó do Barreiro que será alvo de análise. Este Nó de Ligação visa garantir a melhor articulação entre as duas vias rápidas previstas (IC21 e ER 11-2) e as acessibilidades locais da cidade do Barreiro. O projecto que se apresenta foi elaborado com base no software InRoads para o cálculo rodoviário e na plataforma de desenho AutoCAD para a produção das peças desenhadas. Os traçados e os cálculos respectivos foram desenvolvidos sobre a cartografia do Estudo Prévio, à escala 1:5000, sendo os desenhos relativos ao traçado em Planta e Perfil Longitudinal apresentados na escala 1:2000. O volume de solos associados às terraplanagens do conjunto de ligações é apresentado em anexo e representa um total de 1.021.000m3, correspondendo 82% a material para aterro e 18% a escavação. Daqui se conclui que o nó apresenta um deficit de terras da ordem dos 653.000m3. De qualquer modo esta análise volumétrica não se deve dissociar do resto do empreendimento, para uma rigorosa e real avaliação do equilíbrio de terras. A nível da drenagem foram efectuados os cálculos hidrológicos, relativos à drenagem transversal das várias vias, sendo as mesmas representadas nos desenhos de Planta e Perfil Longitudinal na escala 1:2000.

Contabilidade Ambiental: divulgação de Informação

O presente artigo procura apresentar uma revisão da literatura sobre a temática da Contabilidade Ambiental na perspectiva da Divulgação. Efectua-se o enquadramento teórico do tema como suporte para a problemática da motivação da Gestão para o relato ambiental e caracteriza-se o state of the art da divulgação ambiental no relatório anual a nível internacional com particular ênfase para os países onde este assunto tem merecido mais atenção. Depois de apresentado o ponto da situação sobre a realidade portuguesa, antes e após a publicação da Directriz Contabilística nº29 – Matérias Ambientais, é efectuada uma abordagem sobre o papel que cabe aos auditores no processo de reporte de informação no domínio ambiental em face do impacte que estas matérias têm nas demonstrações financeiras.

A evolução do tratamento contabilístico das concentrações de actividades empresariais

Trabalho apresentado para obtenção do Título de Professor-Adjunto para a Área Científica de Contabilidade Financeira do Instituto Superior de Contabilidade e Administração de Lisboa, do Instituto Politécnico de Lisboa