Uso de fluorescência em um método de dissector modificado para estimar o número de miócitos no tecido cardíaco

FUNDAMENTO: Métodos convencionais de dissector atualmente requerem consideráveis custos financeiros, técnicos e operacionais para estimar o número de células, incluindo cardiomiócitos, em uma área de 3D. OBJETIVO: Usar a microscopia de fluorescência em um método de dissector modificado para determinar o número de miócitos no tecido cardíaco em condições normais e patológicas. MÉTODOS: O estudo empregou camundongos Wistar machos com quatro meses de idade e peso de 366,25 ± 88,21 g randomizados em grupos controles (GC, n = 8) e infectados (GI, n = 8). Os animais do GI foram inoculados com cepa Y de T. cruzi (300.000 tripomastigotas/50 g). Após oito semanas, os animais foram pesados e sacrificados. Os Ventrículos Esquerdos (VE) foram removidos para análise estereológica da densidade numérica de cardiomiócitos (Nv [c]) e o número total dessas células no VE (N [c]). Esses parâmetros foram estimados usando um dissector fluorescente (DF) e comparados com os métodos convencionais de dissector óptico (DO) e dissector físico (DFi). RESULTADOS: Em ambos os métodos de dissector, os animais do GI apresentaram queda significativa de Nv[c] e N[c] em comparação com os animais do GC (P > 0,05). Uma correlação forte, igual ou superior a 96%, foi obtida entre DF, DO e DFi. CONCLUSÃO: O método DF parece ser igualmente confiável para determinar Nv[c] e N[c] em condições normais e patológicas, apresentando algumas vantagens em relação aos métodos convencionais de dissector: redução de cortes histológicos e imagens na análise estereológica, redução do tempo de análise das imagens, a construção de DF em microscópios simples, utilizando o modo de epifluorescência, distinção de planos de dissector em ampliações inferiores.

Expressão imunoistoquímica de diferenciação e crescimento celular em cardiomiócitos de neonatos

FUNDAMENTO: As alterações cardíacas na fase de transição do coração fetal para a vida extrauterina vêm sendo exploradas por inúmeras pesquisas em animais, e os mecanismos celulares responsáveis por essas modificações ainda não estão bem documentado em seres humanos. OBJETIVO: Avaliar o mecanismo de diferenciação celular em cardiomiócitos ocorridas nos primeiros dias de vida, por meio da análise imunoistoquímica de proteínas envolvidas com processos de proliferação e contração muscular, em amostras de miocárdio de recém-natos humanos. MÉTODO: Estudo transversal de amostras parafinadas de miocárdio provenientes de banco de necropsias de recémnascidos humanos, divididos em dois grupos amostrais: recém-nascidos a termo que foram a óbito com no máximo dois dias de vida (NEO1) com 10 casos, e recém- nascidos a termo que foram a óbito entre três e 10 dias de vida (NEO2) com 14 casos, a fim de seguir uma linha de tempo que contemplasse a fase de transição da circulação fetal a vida extrauterina. As amostras foram estudadas em tissue microarray e os anticorpos utilizados foram o Ki67, PCNA, PTEN, Bcl2 (proliferação) e HHF35 e actina sarcomérica (proteínas contráteis). RESULTADOS: Foi encontrada diferença com o Ki67 p = 0,02, HHF35 p < 0,01 e actina sarcomérica p = 0,02, e a expressão do Ki67 foi mais alta no grupo NEO1 e a expressão do HHF35 e da actina sarcomérica foi mais alta no grupo NEO2. CONCLUSÃO: Os resultados sugerem que os cardiomiócitos apresentam uma característica proliferativa (Ki67) nos NEO1 e que essa vai, seguindo uma linha temporal, sendo substituída por um caráter de diferenciação (HHF35 e actina sarcomérica) nos NEO2.

Cintilografia de perfusão miocárdica e comprometimento cardíaco na fase indeterminada da doença de chagas

FUNDAMENTO: A cintilografia de perfusão miocárdica (CPM) tem sido utilizada na avaliação da cardiopatia chagásica. OBJETIVO: Investigar o valor da CPM com tomografia computadorizada por emissão de fóton único (gated-SPECT) para detectar comprometimento cardíaco precoce em pacientes chagásicos na fase indeterminada, que apresentam anomalias de movimento segmentar detectadas por exame de imagem por Doppler tecidual (IDT) strain derivada. MÉTODOS: Foram incluídos 40 indivíduos (idade média: 25 ± 2 anos, 50% homens) de uma área endêmica da doença de Chagas e com diagnóstico sorológico positivo. Todos foram submetidos à CPM com gated-SPECT de 2 dias (repouso e estresse) e ecocardiografia. RESULTADOS: Trinta indivíduos (75%) apresentaram resultados normais. Em três casos (8%), a CPM apresentou resultado ligeiramente anormal e em sete foi ambígua. Em todos os casos com defeitos reversíveis, os segmentos afetados foram coincidentes com aqueles com anomalias de movimento. Foi encontrada redução na fração de ejeção ventricular esquerda (FEVE) > 5% (ΔLVEF% < -5) pós-estresse em 11 dos 40 indivíduos (28%). Tanto o desvio padrão fasederivado como a largura da banda do histograma mostraram diferença significativa entre o pós-estresse e a fase de repouso. Em ambos os casos, houve ligeira dessincronia em repouso normalizado no pós-estresse. CONCLUSÃO: Uma abordagem estresse-repouso com gated-SPECT é válida para detectar alterações miocárdicas precoces, bem como dessincronia intraventricular na fase indeterminada da doença de Chagas em pacientes com anomalias no movimento segmentar previamente detectadas pela IDT strain derivada.

InsCor: um método simples e acurado para avaliação do risco em cirurgia cardíaca

FUNDAMENTO: Escores de risco apresentam dificuldades para obter o mesmo desempenho em diferentes populações. OBJETIVO: Criar um modelo simples e acurado para avaliação do risco nos pacientes operados de doença coronariana e/ou valvar no Instituto do Coração da Universidade de São Paulo (InCor-HCFMUSP). MÉTODOS: Entre 2007 e 2009, 3.000 pacientes foram operados consecutivamente de doença coronariana e/ou valvar no InCor-HCFMUSP. Desse registro, dados de 2/3 dos pacientes foram utilizados para desenvolvimento do modelo (técnica de bootstrap) e de 1/3 para validação interna do modelo. O desempenho do modelo (InsCor) foi comparado aos complexos 2000 Bernstein-Parsonnet (2000BP) e EuroSCORE (ES). RESULTADOS: Apenas 10 variáveis foram selecionadas: Idade > 70 anos; sexo feminino; cirurgia de revascularização coronariana + valva; infarto de miocárdio < 90 dias; reoperação; tratamento cirúrgico da valva aórtica; tratamento cirúrgico da valva tricúspide; creatinina < 2mg/dL; fração de ejeção < 30%; e eventos. O teste de Hosmer Lemeshow para o InsCor foi de 0,184, indicando uma excelente calibração. A área abaixo da curva ROC foi de 0,79 para o InsCor, 0,81 para o ES e 0,82 para o 2000BP, confirmando que os modelos são bons e similares na discriminação. CONCLUSÕES: O InsCor e o ES tiveram melhor desempenho que o 2000BP em todas as fases da validação; pórem o novo modelo, além de se identificar com os fatores de risco locais, é mais simples e objetivo para a predição de mortalidade nos pacientes operados de doença coronariana e/ou valvar no InCor-HCFMUSP.

Estudo da Fase Intra-hospitalar da Revascularizacao Cirurgica do Miocardio em Pacientes Dialiticos

Fundamentos: Atualmente, a revascularização cirúrgica do miocárdio é o melhor tratamento para o paciente dialítico com lesão coronariana multiarterial, contudo a mortalidade e a morbidade hospitalar do procedimento ainda permanecem altas. Objetivos: Avaliar os resultados e a evolução intra-hospitalar da revascularização cirúrgica do miocárdio isolada em pacientes dialíticos. Métodos: Estudo retrospectivo unicêntrico de 50 pacientes dialíticos consecutivos e não selecionados, submetidos à revascularização cirúrgica do miocárdio em um hospital terciário universitário no período de 2007 a 2012. Resultados: A casuística apresentou alta prevalência de fatores de risco cardiovasculares (100% hipertensos, 68% diabéticos e 40% dislipidêmicos). Não houve óbito intraoperatório, e 60% dos procedimentos foram feitos sem circulação extracorpórea. Houve sete (14%) óbitos intra-hospitalares. Infecção pós-operatória, insuficiência cardíaca prévia, uso de circulação extracorpórea, função ventricular anormal e reexploração cirúrgica foram os fatores associados a maior mortalidade. Conclusão: A revascularização cirúrgica do miocárdio é um procedimento factível para essa classe de pacientes, contudo com alta morbidade e mortalidade intra-hospitalar. É necessário melhor entendimento das particularidades metabólicas desses pacientes para o planejamento adequado das condutas.

Um método prático de racionamento das aves domésticas

O A., pretende facilitar aos práticos a composição de suas próprias fórmulas de ração com os alimentos disponíveis no momento; baseando-se nos conhecimentos e métodos já existentes sobre o assunto, simplifica-os, reduzindo-os ao exame de uma tabela que apresenta, conjuntamente com regras simples e práticas. Os cálculos sáo baseados na composição bruta dos alimentos e se limitam a adição e subtração do teor em proteina de cada ingradiente duma ração cujo total seja 100. Outras sugestões práticas são apresentadas.

Contribuições à teoria da genética em populações

1) O equilíbrio em populações, inicialmente compostas de vários genotipos depende essencialmente de três fatores: a modalidade de reprodução e a relativa viabilidade e fertilidade dos genotipos, e as freqüências iniciais. 2) Temos que distinguir a) reprodução por cruzamento livre quando qualquer indivíduo da população pode ser cruzado com qualquer outro; b) reprodução por autofecundação, quando cada indivíduo é reproduzido por uma autofecundação; c) finalmente a reprodução mista, isto é, os casos intermediários onde os indivíduos são em parte cruzados, em parte autofecundados. 3) Populações heterozigotas para um par de gens e sem seleção. Em populações com reprodução cruzada se estabelece na primeira geração um equilíbrio entre os três genotipos, segundo a chamada regra de Hardy- Weinberg. Inicial : AA/u + Aa/v aa/u = 1 Equilibirio (u + v/2)² + u + v/2 ( w + v/2) + (w + v/2)² = p2 + 2 p o. q o. + q²o = 1 Em populações com autofecundação o equilíbrio será atingido quando estiverem presentes apenas os dois homozigotos, e uma fórmula é dada que permite calcular quantas gerações são necessárias para atingir aproximadamente este resultado. Finalmente, em populações com reprodução mista, obtemos um equilíbrio com valores intermediários, conforme Quadro 1. Frequência Genotipo Inicial mº Geração Final AA u u + 2m-1v / 2m+1 u + 1/2v Aa v 2/ 2m+2 v - aa w w + 2m - 1/ 2m + 1 v w + 1/2 v 4) Os índices de sobrevivencia. Para poder chegar a fórmulas matemáticas simples, é necessário introduzir índices de sobrevivência para medir a viabilidade e fertilidade dos homozigotos, em relação à sobrevivência dos heterozigotos. Designamos a sobrevivência absoluta de cada um dos três genotipos com x, y e z, e teremos então: x [ A A] : y [ Aa] : z [ aa] = x/y [ A A] : [ Aa] : z/ y [aa] = R A [ AA] : 1 [Aa] : Ra [aa] É evidente que os índices R poderão ter qualquer valor desde zero, quando haverá uma eliminação completa dos homozigotos, até infinito quando os heterozigotos serão completamente eliminados. Os termos (1 -K) de Haldane e (1 -S) ou W de Wright não têm esta propriedade matemática, podendo variar apenas entre zero e um. É ainda necessário distinguir índices parciais, de acordo com a marcha da eliminação nas diferentes fases da ontogenia dos indivíduos. Teremos que distinguir em primeiro lugar entre a eliminação durante a fase vegetativa e a eliminação na fase reprodutiva. Estas duas componentes são ligadas pela relação matemática. R - RV . RR 5) Populações com reprodução cruzada e eliminação. - Considerações gerais. a) O equilibrio final, independente da freqüência inicial dos genes e dos genotipos para valores da sobrevivência diferentes de um, é atingido quando os gens e os genotipos estão presentes nas proporções seguintes: (Quadro 2). po / qo = 1- ro / 1-Ra [AA] (1 - Ro)² . Rav [ Aa] = 2(1 - Ra) ( 1 - Ra) [a a} = ( 1 - Ra)² . RaA b) Fórmulas foram dadas que permitem calcular as freqüências dos genotipos em qualquer geração das populações. Não foi tentado obter fórmulas gerais, por processos de integração, pois trata-se de um processo descontínuo, com saltos de uma e outra geração, e de duração curta. 6) Populações com reprodução cruzada e eliminação. Podemos distinguir os seguintes casos: a) Heterosis - (Quadro 3 e Fig. 1). Ra < 1; Ra < 1 Inicial : Final : p (A)/q(a) -> 1-ra/1-ra = positivo/zero = infinito Os dois gens e assim os três genotipos zigóticos permanecem na população. Quando as freqüências iniciais forem maiores do que as do equilíbrio elas serão diminuidas, e quando forem menores, serão aumentadas. b) Gens recessivos letais ou semiletais. (Quadro 1 e Fig. 2). O equilíbrio será atingido quando o gen, que causa a redução da viabilidade dos homozigotos, fôr eliminado da população. . / c) Gens parcialmente dominantes semiletais. (Quadro 5 e Fig. 3). Rª ; Oz Ra < 1 Inicial : Equilibrio biológico Equilíbrio Matemático pa(A)/q(a) -> positivo /zero -> 1- Rq/ 1-Ra = positivo/negativo d) Genes incompatíveis. Ra > 1 ; Ra > 1; Ra > Ra Equílibrio/biológico p (A)/ q(a) -> positivo/zero Equilibrio matemático -> positivo/ zero -> zero/negativo -> 1-Ra/1 - Ra = negativo/negativo Nestes dois casos devemos distinguir entre o significado matemático e biológico. A marcha da eliminação não pode chegar até o equilíbrio matemático quando um dos gens alcança antes a freqüência zero, isto é, desaparece. Nos três casos teremos sempre uma eliminação relativamente rápida de um dos gens «e com isso do homozigoto respectivo e dos heterozigotòs. e) Foram discutidos mais dois casos especiais: eliminação reprodutiva diferencial dos dois valores do sexo feminino e masculino, -e gens para competição gametofítica. (Quadros 6 e 7 e Figs. 4 a 6). 7) População com autofecundação e seleção. O equilíbrio será atingido quando os genotipos estiverem presentes nas seguintes proporções: (Quadro 8); [AA] ( 0,5 - Ra). R AV [Aa] = 4. ( 0,5 - Ra) . (0.5 -R A) [aa] ( 0,5 - R A) . Rav Também foram dadas fórmulas que permitem calcular as proporções genotípicas em cada geração e a marcha geral da eliminação dos genotipos. 8)Casos especiais. Podemos notar que o termo (0,5 -R) nas fórmulas para as populações autofecundadas ocupa mais ou menos a mesma importância do que o termo (1-R) nas fórmulas para as populações cruzadas. a) Heterosis. (Quadro 9 e Fig. 7). Quando RA e Ra têm valores entre 0 e 0,5, obtemos o seguinte resultado: No equilíbrio ambos os gens estão presentes e os três heterozigotos são mais freqüentes do que os homozigotos. b) Em todos os demais casos, quando RA e Ra forem iguais ou maiores do que 0,5, o equilíbrio é atingido quando estão representados na população apenas os homozigotos mais viáveis e férteis. (Quadro 10). 9) Foram discutidos os efeitos de alterações dos valores da sobrevivência (Fig. 9), do modo de reprodução (Fig. 10) e das freqüências iniciais dos gens (Fig. 8). 10) Algumas aplicações à genética aplicada. Depois de uma discussão mais geral, dois problemas principais foram tratados: a) A homogeneização: Ficou demonstrado que a reprodução por cruzamento livre representa um mecanismo muito ineficiente, e que se deve empregar sempre ou a autofecundação ou pelo menos uma reprodução mista com a maior freqüência possível de acasalamentos consanguíneos. Fórmulas e dados (Quadro 11 e 12), permitem a determinação do número de gerações necessárias para obter um grau razoável de homozigotia- b) Heterosis. Existem dois processos, para a obtenção de um alto grau de heterozigotia e com isso de heterosis: a) O método clássico do "inbreeding and outbreeding". b) O método novo das populações balançadas, baseado na combinação de gens que quando homozigotos dão urna menor sobrevivência do que quando heterozigotos. 11) Algumas considerações sobre a teoria de evolução: a) Heterosis. Os gens com efeito "heterótico", isto é, nos casos onde os heterozigotos s mais viáveis e férteis, do que os homozigotos, oferecem um mecanismo especial de evolução, pois nestes casos a freqüência dos gens, apesar de seu efeito negativo na fase homozigota, tem a sua freqüência aumentada até que seja atingido o valor do equilíbrio. b) Gens letais e semiletais recessivos. Foi demonstrado que estes gens devem ser eliminados automáticamente das populações. Porém, ao contrário do esperado, não s raros por exemplo em milho e em Drosophila, gens que até hoje foram classificados nesta categoria. Assim, um estudo detalhado torna-se necessário para resolver se os heterozigotos em muitos destes casos não serão de maior sobrevivência do que ambos os homozigotos, isto é, que se trata realmente de genes heteróticos. c) Gens semiletais parcialmente dominantes. Estes gens serão sempre eliminados nas populações, e de fato eles são encontrados apenas raramente. d) Gens incompatíveis. São também geralmente eliminados das populações. Apenas em casos especiais eles podem ter importância na evolução, representando um mecanismo de isolamento.