Methicillin-resistant Staphylococcus aureus resensitization by protein synthesis inhibitors : proposal for a mechanism

RESUME Staphylococcus aureus est un important pathogène à gram-positif, à la fois responsable d'infections nosocomiales et communautaires. Le S. aureus résistant à la méthicilline est intrinsèquement résistant aux bêta-lactamines, inhibiteurs de la synthèse de la paroi bactérienne, grâce à une enzyme nouvellement acquise, la protéine liant la pénicilline 2A, caractérisée par une faible affinité pour ces agents et pouvant poursuivre la synthèse de la paroi, alors que les autres enzymes sont bloquées. Ce micro-organisme a également développé des résistances contre quasiment tous les antibiotiques couramment utilisés en clinique. Parallèlement au développement de molécules entièrement nouvelles, il peut être utile d'explorer d'éventuelles caractéristiques inattendues de médicaments déjà existants, par exemple en les combinant, dans l'espoir d'un potentiel effet synergique. Comprendre les mécanismes de tels effets synergiques pourrait contribuer à la justification de leur utilisation clinique potentielle. Récemment, un effet synergique contre le S. aureus résistant à la méthicilline a été décrit entre la streptogramine quinupristine-datfopristine et les bêta-lactamines, aussi bien in vitro qu'in vivo. Le présent travail a pour but de proposer un modèle pour le mécanisme de cette interaction positive et de l'étendre à d'autres classes d'antibiotiques. Premièrement, un certain nombre de méthodes microbiologiques ont permis de mieux cerner la nature de cette interaction, en montrant qu'elle agissait spécifiquement sur le S. aureus résistant à la méthicilline et qu'elle était restreinte à l'association entre inhibiteurs de la synthèse des protéines et bêta-lactamines. Deuxièmement, L'observation de l'influence des inhibiteurs de la synthèse des protéines sur la machinerie de la paroi bactérienne, c'est-à-dire sur l'expression des protéines liant la pénicilline, responsables de la synthèse du peptidoglycan, a montré une diminution de la quantité de ta protéine liant la pénicilline 2, connue pour posséder une activité de transglycosylation, indispensable au bon fonctionnement de la protéine liant la pénicilline 2A, responsable de la résistance à la méthicilline. Troisièmement, l'analyse fine de la composition du peptidoglycan extrait de bactéries, avant ou après traitement par des inhibiteurs de la synthèse des protéines, a montré des altérations corrélant avec leur capacité à agir en synergie avec les bêta-lactamines contre S. aureus résistant à ta méthicilline. Ces altérations dans les muropeptides pourraient représenter une signature de la diminution de la quantité de la protéine liant la pénicilline 2. Le modèle mécanistique retenu considère que les inhibiteurs de la synthèse des protéines pourraient diminuer l'expression de la protéine Liant la pénicilline 2, indispensable à la résistance à la méthiciltine, et que ce déséquilibre dans les enzymes synthétisant la paroi bactérienne pourrait générer une signature dans les muropeptides. SUMMARY Staphylococcus aureus is a major gram-positive pathogen causing both hospital-acquired and community-acquired infections. Methicillin- resistant Staphylococcus aureus is intrinsically resistant to the cell wall inhibitors beta-lactams by virtue of a newly acquired cell-wall-building enzyme, tow-affinity penicillin-binding protein 2A, which can build the wall when other penicillin-binding proteins are blocked. Moreover, the microorganism has developed resistance to virtually all non-experimental antibiotics. In addition of producing entirely new molecules, it is useful to explore unexpected features of existing drugs, for example by using them in combination, expecting drug synergisms. Understanding the mechanisms of such synergisms would help justify their putative clinical utilization. Recently, a synergism between the streptogramin quinupristin-dalfopristin and beta-lactams was reported against methicillin-resistant S. aureus, both in vitro and in vivo. The present work intends to propose a model for the mechanism of this positive interaction and to extend it to other drug classes. First, microbiological experimentation helped better defining the nature of this interaction, restricting it to methicillin-resistant S. aureus, and to the association of protein synthesis inhibitors with beta-lactams. Second, the observation of inhibitors of protein synthesis influence on the cell-wall-building machinery, i.e. on the expression of penicillin-binding proteins responsible for peptidoglycan synthesis, showed a decrease in the amount of penicillin-binding protein 2, known to provide a transglycosylase activity for glycan chain elongation, indispensable for the functionality of the low-affinity penicillin-binding protein 2A responsible for methicillin resistance. Third, the fine analysis of the peptidoglycan composition purified from bacteria before or after treatment with inhibitors of protein synthesis showed alterations that correlated with their ability to synergize with beta-lactams against methicillin-resistant S. aureus. These muropeptide alterations could be the signature of decrease in the amount of penicillin-binding protein 2. The retained mechanistic model is that inhibitors of protein synthesis could decrease the expression of penicillin-binding protein 2, wich is indispensable for methicillin-resistance, and that this imbalance in cell-wall-building enzymes could generate a muropeptide signature.

Molecular genetics of rare hereditary diseases via genome-wide and integrated approaches

ABSTRACTThe Online Mendelian Inheritance in Man database (OMIM) reports about 3000 Mendelian diseases of known causal gene and about 2000 that remain to be mapped. These cases are often difficult to solve because of the rareness of the disease, the structure of the family (too big or too small) or the heterogeneity of the phenotype. The goal of this thesis is to explore the current genetic tools, before the advent of ultra high throughput sequencing, and integrate them in the attempt to map the genes behind the four studied cases. In this framework we have studied a small family with a recessive disease, a modifier gene for the penetrance of a dominant mutation, a large extended family with a cardiac phenotype and clinical and/or allelic heterogeneity and we have molecularly analyzed a balanced chromosomal translocation.RESUMELa base de données des maladies à transmission mendélienne, Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), contient environ 3000 affections à caractère mendélien pour lesquelles le gène responsable est connu et environ 2000 qui restent à élucider.Les cas restant à résoudre sont souvent difficiles soit par le caractère intrinsèquement rare de ces maladies soit à cause de difficultés structurelles (famille trop petite ou trop étendue) ou hétérogénéité du phénotype ou génétique. Cette thèse s'inscrit avant l'arrivée des nouveaux outils de séquençage à haut débit. Son but est d'explorer les outils génétiques actuels, et de les intégrer pour trouver les gènes impliqués dans quatre cas représentant chacun une situation génétique différente : nous avons étudié une famille de quatre individus avec une transmission récessive, recherché un gène modificateur de la pénétrance de mutations dominantes, étudié une famille étendue présentant un phénotype cardiaque cliniquement et/ou allèliquement hétérogène et nous avons fait l'analyse moléculaire d'une translocation chromosomique balancée.

Risk assessment of recurrence in sporadic retinoblastoma using a molecular-based algorithm

Le rétinoblastome (Rb) est une tumeur provenant des cellules rétiniennes progénitrices des photorécepteurs. C'est la tumeur pédiatrique maligne la plus fréquente avec une incidence par naissance évaluée entre 1/15Ό00 et 1/20Ό00. Les enfants atteints de Rb sont diagnostiqué dans leur grande majorité avant l'âge de 4 ans, soit le temps nécessaire à la différentiation et à la maturation des photorécepteurs et donc à la disparition de la cellule d'origine du Rb. La survie du patient, la sauvegarde oculaire et le pronostic visuel restent excellents pour autant que le traitement ne soit pas différé. Dans sa variante non héréditaire (60%) le Rb est toujours unilatéral et sporadique. Le Rb héréditaire de transmission dominante autosomique (40%), se décline sous toutes les formes, familiale (10%) ou sporadique (30%), que l'atteinte soit unilatérale ou bilatérale. La majorité des mutations causales sont uniques et distribuées de façon aléatoire sur la totalité du gène RB1 sans région prédisposante. La détection de ces mutations est couteuse et chronophage, tout en présentant un taux de détection relativement bas; surtout dans les cas de Rb sporadiques unilatéraux. Dans le but d'identifier les patients présentant un risque réel de développer un Rb, et de réduire le nombre d'examens sous narcose requis pour le dépistage de la maladie chez les sujets à risque, nous avons développé une stratégie sensible, rapide, efficace et peu couteuse basée sur une analyse de l'haplotype intragénique. Cet algorithme prend en compte a) la perte d'hétérozygotie intratumorale du gène RB1, b) l'origine paternelle préférentielle des nouvelles mutations germinales et c) un risque a priori dérivé des données empiriques de Vogel. Pendant la période allant de janvier 1994 à décembre 2006, nous avons comparé l'apparition de nouveau Rb parmi la fratrie et la descendance de patient atteints au nombre de nouveaux cas attendus calculé par notre algorithme. 134 familles ont été étudiées. L'analyse moléculaire a été effectuée chez 570 personnes dont 99 patients âgés de moins de 4 ans et donc à risque de développer un Rb. Parmi cette cohorte, nous avons observé l'apparition d'un cas de Rb, alors que les risques cumulés a posteriori calculé par notre algorithme prédisait l'apparition de 1.77 nouveau cas. Dans cette étude, nous avons pu valider notre algorithme prédisant la récurrence de Rb chez les parents de 1er degré de patients atteints. Cet outil devrait grandement faciliter le conseil génétique ainsi que le suivi des patients à risque de développer un Rb, surtout dans les cas ou le séquençage direct du gène RB1 n'est pas disponible ou est resté non informatif. - Purpose: Most RBI mutations are unique and distributed throughout the RBI gene. Their detection can be time-consuming and the yield especially low in cases of conservatively-treated sporadic unilateral retinoblas-toma (Rb) patients. In order to identify patients with true risk of developing Rb, and to reduce the number of unnecessary examinations under anesthesia in all other cases, we developed a universal sensitive, efficient and cost-effective strategy based on intragenic haplotype analysis. Methods: This algorithm allows the calculation of the a posteriori risk of developing Rb and takes into account (a) RBI loss of heterozygosity in tumors, (b) preferential paternal origin of new germline mutations, (c) a priori risk derived from empirical data by Vogel, and (d) disease penetrance of 90% in most cases. We report the occurrence of Rb in first degree relatives of patients with sporadic Rb who visited the Jules Gonin Eye Hospital, Lausanne, Switzerland, from January 1994 to December 2006 compared to expected new cases of Rb using our algorithm. Results: A total of 134 families with sporadic Rb were enrolled; testing was performed in 570 individuals and 99 patients younger than 4 years old were identified. We observed one new case of Rb. Using our algorithm, the cumulated total a posteriori risk of recurrence was 1.77. Conclusions: This is the first time that linkage analysis has been validated to monitor the risk of recurrence in sporadic Rb. This should be a useful tool in genetic counseling, especially when direct RBI screening for mutations leaves a negative result or is unavailable.

Free flaps in surgical dermatology. Comparison between fasciocutaneous and myocutaneous free flaps in facial reconstructions.

BACKGROUND Dermatologic surgeons routinely harvest pedicled flaps at distance with an axial or random pattern to repair facial defects. These types of skin flaps are time-consuming and have high economic, social and personal costs. These drawbacks could be avoided with the introduction of a single-step transfer of free flaps to the recipient site, with microvascular anastomosis. OBJECTIVE To demonstrate that better results are obtained with myocutaneous or fasciocutaneous free flaps and which one is more suitable in surgical dermatology. MATERIAL AND METHODS We selected two patients of opposite sexes and similar ages who had undergone Mohs surgery to remove recurrent malignant tumors that were located in the upper cheek bordering the zygomatic zone. The woman was treated with a fasciocutaneous radial free flap and the man with a rectus abdominis free flap. RESULTS Both patients had excellent immediate postoperative outcomes. Complications observed in the male patient were related to a previous pulmonary alteration. The fasciocutaneous radial free flap reconstruction was easier to perform than the rectus abdominis free flap; nevertheless, the radial free flap is very thin and, although the palmaris longus tendon is used, it does not yield enough volume, requiring later use of implants. In contrast, the rectus abdominis free flap transfers a wide flap with enough fat tissue to expand in the future. As for the cosmetic results regarding the donor site, the rectus abdominis free flap produces better-looking scars, since secondary defects of the palmar surface cannot be directly closed and usually require grafting - a situation that some patients do not accept. CONCLUSIONS In surgical dermatology, each case, once the tumor has been extirpated, requires its own reconstructive technique. The radial free flap is suitable for thin patients who are willing to cover their arm with a shirt. The rectus abdominis free flap is best suited for obese patients with deep and voluminous defects, although it is necessary to dislocate the navel from its original position.