Etablierung neuer Methoden zur in vitro Kultivierung der Baumart Fraxinus excelsior L. und Entwicklung von Verfahren zur Kryokonservierung von in vitro Sprossspitzen

Die hier vorliegende Arbeit wurde im Rahmen eines europäischen Projektes mit dem Titel „Improving Fraxinus (Ash) productivity for European needs by testing, selection, propagation and promotion of improved genetic resources“ an der Niedersächsischen Forstlichen Versuchsanstalt, Abteilung Waldgenressourcen erstellt. Im Rahmen des Projektes wurden 62 Plusbäume aus einem 15 Jahre alten europäischen Herkunfts-/ Nachkommenschaftsversuch in den Niedersächsischen Forstämtern Bovenden und Dannenberg nach den Kriterien Stammform und Wuchsleistung für die vegetative Vermehrung ausgewählt. Ziel dieser Arbeit war die Optimierung bestehender in vitro Protokolle sowie die Entwicklung eines bisher noch nicht existierenden Kryokonservierungsprotokolls für in vitro Sprossspitzen. Im ersten Teil dieser Arbeit wird die Entwicklung des in vitro Protokolls für Fraxinus excelsior dargestellt. Die Optimierung der Methoden zur Etablierung, Vermehrung und Bewurzelung erfolgte durch Versuchsreihen mit unterschiedlichen Klonen, so dass insgesamt 26 der selektierten Plusbäume erfolgreich in vitro etabliert werden konnten. Achselknospen frischer Triebe der Pfropflinge der Mutterbäume stellten die beste Explantatquelle dar. Die Explantate wurden mit 0,2 % Quecksilberchlorid (HgCl2) oberflächensterilisiert bevor sie auf hormonfreies Woody Plant Medium (WPM) transferiert wurden. Nach zwei Wochen erfolgte ein Transfer auf WPM mit 4 mg/l 6-Benzylaminopurine (BAP) und 0,15 mg/l Indole-3-butyric acid (IBA). Die besten Vermehrungsraten wurden auf WPM mit 4 mg/l BAP, 0,15 mg/l IBA und 0,01 mg/l TDZ und 0,7 % Agar in Honiggläsern mit einem Plastikdeckel erzielt. Als Bewurzelungsmedium wurde 0,5 konzentriertes Murashige und Skoog (MS) Medium mit 2 mg/l IBA, 0,25 mg/l BAP und 0,8 % Agar verwandt. Im zweiten Teil der Arbeit werden die Versuchsreihen zur Entwicklung des Kryokonservierungsprotokolls von in vitro Sprossspitzen dargestellt. Zur Entwicklung der Methode wurden die Vorbehandlungsbedingungen verbessert und zwei Techniken, die Alginat- / Dehydrati-onsmethode und die Vitrifikationsmethode mit Hilfe der sogenannten PVS2-Lösung (Plant Vitrification solution number 2) getestet. Die optimierte PVS2-Methode erwies sich als die für Esche besser geeignete Technik und ließ sich erfolgreich zur Kryokonservierung juveniler und adulter Kulturen anwenden. Die Regenerationsraten lagen zwischen 50 und 100 % für juvenile bzw. 50 und 80 % für adulte Kulturen.

In vitro characterization of two small nucleolytic ribozymes-the hairpin and the hammerhead ribozymes in their natural context

Hairpin Ribozyme kommen natürlich in den Minussträngen der Satelliten RNAs dreier Pflanzenviren (sTRsV, sArMV and sCYMoV) vor. In dieser Arbeit wurden mit dem Programm Mfold darin mehrere distinkte Sekundärstrukturelemente gefunden, die außerhalb des katalytischen Zentrums der Ribozyme lokalisieren. Verschiedene Varianten der drei Ribozyme wurden hergestellt und die Funktion der beobachteten peripheren Strukturelemente biochemisch untersucht. Die sTRsV Hairpin Ribozyme mit unterschiedlichen Längen in Arm C wiesen ähnliche cis-Spaltungsreaktionen auf, unabhängig von der Anzahl interner bulges in Arm C. Das gleiche Verhalten, jedoch bei schnelleren Spaltungsraten, wurde nach Entfernen der three-way junction, die 3’ von der Spaltstelle in Arm A liegt, beobachtet. Hier hat Arm C demnach keinen Einfluss auf die Katalyse, wogegen ein verlängerter Arm A die Reaktion verlangsamt. Unter den experimentellen Bedingungen war die Rückreaktion in Anwesenheit des natürlichen Arms A nicht messbar. Im Gegensatz dazu zeigten alle Varianten ohne die Arm A Erweiterung Ligationsaktivität, die am höchsten in dem Molekül mit dem längsten Arm C war, und gleichermaßen erniedrigt für zwei Varianten mit kürzerem Arm C. Keine der Reaktionen diverser sArMV Hairpin Ribozyme konnte reproduzierbar analysiert werden. Für das sCYMoV Hairpin Ribozym wurde schließlich in cis-Spaltungsreaktionen eine Zunahme der Geschwindigkeit mit Abnahme der Länge von Arm D beobachtet. Dies war der Fall in Anwesenheit der three-way junction in Arm A, nicht jedoch in ihrer Abwesenheit, wo Varianten mit unterschiedlichen Längen des Arms D ähnliche Spaltungsreaktionen aufwiesen. In Anwesenheit der three-way junction in Arm A war eine Reduzierung der Ligationsgeschwindigkeit zu beobachten, und bei ihrer Abwesenheit stieg diese mit der Länge von Arm D. Dies zeigt, dass sowohl die three-way junction in Arm A, als auch die Länge und Anzahl der bulges in Arm D die Reaktion des Hairpin Ribozyms aus sCYMoV beeinflussen, wobei sich Unterschiede in Vorwärts- und Rückreaktion auf die experimentellen Bedingungen zurückführen lassen. In zwei Serien wurde die zentrale five-way junction dieses Ribozyms durch verschiedene four-way junctions ersetzt. Die kinetischen Parameter der Selbstspaltung waren ähnlich für Varianten ohne Arm E auf, jedoch verlangsamt bei Varianten ohne Arm C. Dies zeigt, dass das sCYMoV Hairpin Ribozym auch um eine four-way junction gebildet werden kann, deren konstituierenden Helices jedoch nicht beliebig sind. In einem zweiten Projekt wurde die Konservierung von Hammerhead Ribozym-motiven, die bereits früher im Genom der Brassicacee A. thaliana gefunden worden waren, exemplarisch an zehn Mitgliedern dieser Familie untersucht. Da deren Genome nicht sequenziert sind, wurde PCR mit Primern angewandt, die für die A. thaliana Motive spezifisch waren. Damit konnten Ribozymmotive in allen untersuchten Brassicaceen außer B. nigra and B. oleracea gefunden werden. Diese gehören zu den sechs Brassica Pflanzen, für die der koreanische Botaniker U 1935 im “triangle of U” die genetische Verwandtschaft beschrieb. Darin ist B. carinata, für die Ribozymmotive gezeigt wurden, die Tochterspezies der Brassica Pflanzen ohne diese Motive. Dieser Widerspruch könnte darauf zurückzuführen sein, dass in der PCR unspezifische Primer genutzt wurden, oder aber die Motive aus B. carinata könnten ein Artefakt aus einer Luft-übertragenen Kontamination sein. Technische Schwierigkeiten in der Durchführung von Southern Blots, mit denen zwischen diesen Möglichkeiten unterschieden werden sollte, haben eine abschließende Antwort verhindert. Nach einer Optimierung der Methode sollte diese aber geeignet sein, diese Frage zu klären.

Apatite-Polymer Composite Particles for Controlled Delivery of BMP-2: In Vitro Release and Cellular Response

Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) has the ability to induce osteoblast differentiation of undifferentiated cells, resulting in the healing of skeletal defects when delivered with a suitable carrier. We have applied a versatile delivery platform comprising a novel composite of two biomaterials with proven track records – apatite and poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) – to the delivery of BMP-2. Sustained release of this growth factor was tuned with variables that affect polymer degradation and/or apatite dissolution, such as polymer molecular weight, polymer composition, apatite loading, and apatite particle size. The effect of released BMP-2 on C3H10T1/2 murine pluripotent mesenchymal cells was assessed by tracking the expression of osteoblastic makers, alkaline phosphatase (ALP) and osteocalcin. Release media collected over 100 days induced elevated ALP activity in C3H10T1/2 cells. The expression of osteocalcin was also upregulated significantly. These results demonstrated the potential of apatite-PLGA composite particles for releasing protein in bioactive form over extended periods of time.

Expresión de TRF2 y GAPDH en el envejecimiento de las células del epitelio superficial del ovario in vitro

Se ha demostrado que la proteína GAPDH se puede unir al ADN telomérico de cadena sencilla, tanto in vitro como in vivo. Por lo tanto, se ha planteado la hipótesis de que la GAPDH juega un papel importante en la protección de los telómeros, papel que podría ser compartido con la TRF2, proteína que participa en una gran variedad de funciones relacionadas con la homeostasis telomérica. Objetivo: el objetivo de este estudio fue determinar si existe una correlación entre la expresión de ambos genes en el epitelio superficial del ovario in vitro. Materiales y métodos: la expresión relativa de cada gen fue establecida mediante qRT-PCR, en cultivos primarios de células del epitelio superficial del ovario provenientes de un grupo de 22 donantes colombianas mestizas sanas. Resultados: las pruebas no paramétricas de Kendall y Spearman permitieron establecer que existe una correlación significativa entre los niveles de expresión de GAPDH y TRF2 a lo largo de la historia replicativa de los cultivos, en forma independiente de la edad de las donantes. Conclusión: nuestros resultados sugieren un efecto sinérgico entre TRF2 y GAPDH, que podría estar orientado a contrarrestar la reducción de los telómeros in vitro.

Senescence-associated β-galactosidase activity in the in vitro ovarian stromal fibroblasts

Introduction: A growing biological research field is the cellular senescence, a mechanism that has been associated, under certain circumstances, with malignant transformation. Given the high incidence of ovarian cancer and its main origin from the ovarian surface epithelium, as well as the possibility that an epithelial-mesenchymal transition occurs, we evaluated both the in vitro growth of stromal fibroblasts from the ovarian cortex and their β-galactosidase activity at pH 6, enzyme whose expression is considered as a marker of replicative senescence. Methods: 48 samples of ovarian cortical fibroblasts from donors without a history of cancer were serially cultured until the end of their replicative life. β-galactosidase activity at pH 6 was quantified in each passage by the chemiluminiscent method. As control, we used ovarian epithelial cell cultures from the same donors. The enzyme activity was also evaluated in fibroblasts previously induced to senescence by exposure to hydrogen peroxide. Results: The analysis of the enzyme activity and the replicative capacity taken together showed that the fibroblast cultures reached the senescent state at passages 4-5, as what happened with the control epithelial cells. Fibroblasts induced to senescence showed high variability in the values of enzymatic activity. Conclusions: The similarity between both types of cells in reaching the senescent state deserves to be taken into account in relation to the epithelialmesenchymal transition that has been proposed to explain their behavior in the genesis of cancer arising from ovarian surface epithelium. Low β-galactosidase activity values at pH 6 would suggest possible inactivation of the response pathways to oxidative stress.

Characterization of resistance in vitro to different antimicrobial in strains of Staphylococcus spp. in a hospital of the city of Valledupar between January and July 2009

The Staphylococcus spp. they can cause a wide range of infections systemic and located in community and hospital patients. Its high pathogenicity and growing resistance to multiple antimicrobials including methicillin, causes high morbiditymortality rates, causing a high epidemiological impact. Objective: to determine the phenotypic profile of resistance to different antimicrobials in strains of the genus Staphylococcus spp. Materials and methods: collected 75 strains and determined them susceptibility to different antibiotics by the Kirby-Bauer method. The production of betalactamasecheck using the nitrocefin test. (Resistance to Methicillin in S. aureus was conductedusing Mueller Hinton with 4% NaCl and oxacillin 6 μg/mL). Inducible clindamycin resistance tamizo by D-Test test. Results: they were isolated by 38% of staphylococcus coagulase negative (SNA) and 62% of S. aureus. 53% were penicillin resistant staphylococci: S. aureus with 58% and 42% SNA. 47% of the strains showed resistance to methicillin: S. aureus with 61% and SNA with 39%. A strain of S. aureus showed inducible resistance to clindamycin (1.33%). Coagulase negative staphylococci were isolated mostly from blood samples (31%), blood (29%), tip of catheter (5%) and came mostly from neonatal ICU (25%), medical (21%) and surgery (16%).Conclusions: S. aureus and SNA were isolated with greater frequency in blood and wounds from surgery and neonatal ICU. The predominant resistance phenotypes were penicillin and oxacillin.

Evaluación muticéntrica de la actividad antimicrobiana in vitro de tigeciclina en aislados obtenidos de pacientes hospitalizados en Colombia

El aumento en la resistencia bacteriana es un problema global que afecta también a nuestro país y que puede llevar a fracasos terapéuticos, peores desenlaces clínicos, uso de terapia combinada, mayor riesgo de interacciones medicamentosas y de reacciones adversas asi como a aumento de los costos del tratamiento. Tigeciclina, un nuevo antibiótico de la clase de las glicilciclinas ha mostrado una promisoria actividad antibacteriana in vitro contra bacterias comunes incluyendo multiresistentes que cada vez son más prevalentes en nuestro país especialmente a nivel hospitalario. Este estudio fue desarrollado para determinar la actividad de tigeciclina en nuestro medio y conocer su potencial utilidad.