Caractérisation du co-transporteur Na+/myo-inositol SMIT2 dans les membranes en bordure en brosse de rein de lapin et d’intestin de rat

Le myo-inositol (MI) est un soluté organique impliqué dans diverses fonctions physiologiques de la cellule dont la signalisation cellulaire. Il est également un osmolyte compatible reconnu. Trois co-transporteurs de type actif secondaire responsables de son absorption ont été identifiés. Deux d’entre eux sont couplés au transport du sodium (SMIT1 et SMIT2) et le troisième est couplé au transport de protons (HMIT). L’objectif de cette étude a été la caractérisation du transport du MI par SMIT2 dans des membranes en bordure en brosse (BBMv) issues du rein de lapin et de l’intestin de rat ainsi qu’après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis. La quantification de l’ARNm de SMIT1 et de SMIT2 dans le rein nous a appris que SMIT1 est majoritairement présent dans la médullaire alors que SMIT2 est principalement localisé dans le cortex. Ces résultats ont été confirmés par immunobuvardage en utilisant un anticorps dirigé contre SMIT2. Grâce à l’inhibition sélective de SMIT1 par le L-Fucose et de SMIT2 par le D-chiro-inositol (DCI), nous avons démontré que SMIT2 semble le seul responsable du transport luminal de MI dans le tubule contourné proximal avec un Km de 57 ± 14 µM. Pour ce qui est de l’intestin, des études de transport de MI radioactif ont démontré une absence de transport de MI chez le lapin alors que l’intestin de rat présente un transport de MI très actif. Une quantification par qRT-PCR nous a permis de constater que l’intestin de lapin ne semble pas posséder les transporteurs de MI nécessaires. Comme pour le rein, SMIT2 semble le seul transporteur de MI présent au niveau du pôle apical des entérocytes intestinaux chez le rat. Il est chargé du prélèvement du MI de l'alimentation avec un Km de 150 ± 40 µM. Les analyses fonctionnelles exécutées sur SMIT2 de rat en électrophysiologie après expression dans les ovocytes de Xenopus laevis donnent sensiblement les mêmes résultats que pour les BBMv de rein de lapin et d’intestin de rat. Dans les ovocytes, SMIT2 présente une grande affinité pour le MI (270 ± 19 µM) et le DCI (310 ± 60 µM) et aucune affinité pour le L-fucose. Il est ii également très sensible à la phlorizine (16 ± 7 µM). Une seule exception persiste : la constante d’affinité pour le glucose dans les BBMv d’intestin de rat est 40 fois plus petite que celle observée sur les ovocytes de Xenopus laevis. Nous avons également testé la capacité de certains transporteurs de sucre présents à la surface des membranes apicales des entérocytes à prélever le MI. Vu que l'inhibition de ces transporteurs (SGLT1 et GLUT5) ne changeait rien au taux de MI radioactif transporté, nous en avons conclu qu'ils ne sont pas impliqués dans son transport. Finalement, l’efflux de MI à partir du pôle basolatéral des entérocytes n’est pas effectué par GLUT2 puisque ce dernier lorsqu'il est exprimé dans des ovocytes, est incapable de transporter le MI.

Rôle des facteurs physico-chimiques du micro-environnement intestinal et des boucles inter-hélicales du Domaine I dans l’activité de la toxine insecticide Cry9Ca du bacille de Thuringe

Une fois ingérées par un insecte sensible, les toxines insecticides du bacille de Thuringe doivent être activées par les protéases intestinales de cet insecte. Leur premier domaine, un ensemble de sept hélices-α amphipathiques, est responsable de leur insertion dans la membrane luminale de certaines cellules de l’intestin médian, ce qui crée des pores peu sélectifs. La toxicité et la capacité à former des pores d’une telle toxine, la Cry9Ca, de ses mutants simples R164A et R164K et d’un fragment de 55 kDa résultant d’un clivage protéolytique au niveau de son résidu 164 ont été étudiées à l’aide d’une combinaison de modélisation par homologie, de bioessais, d’expériences de gonflement osmotique avec des vésicules de membrane en bordure en brosse de larves de sphinx du tabac et de mesures électrophysiologiques sur des intestins isolés. Ni les mutations simples ni le clivage protéolytique n’ont altéré la toxicité de la Cry9Ca. Dans une solution à faible force ionique, toutefois, la formation des pores dépend fortement du pH : une augmentation de celui-ci de 6,5 à 10,5 a entraîné une baisse irrégulière et par étapes successives de la perméabilité membranaire. Les quatre préparations de toxine ont néanmoins dépolarisé la membrane apicale d’intestins médians fraîchement isolés baignant dans une solution contenant 122 mM de KCl à pH 10,5. L’activité de la Cry9Ca, et des mutants R164A et R164K, a été grandement stimulée lorsque les expériences ont été effectuées en présence de suc intestinal, de lipides extraits d’un volume équivalent de suc intestinal ou d’un cocktail d’inhibiteurs de protéases solubles dans l’eau. De plus, le rôle des boucles inter-hélicales du Domaine I lors de l’insertion dans la membrane a été étudié avec des mutants doubles de la Cry9Ca dont les mutations introduisaient, neutralisaient ou renversaient une charge électrique. À l’exception de trois d’entres eux, tous ces mutants ont conservé une toxicité et une capacité à former des pores comparables à celles de la toxine parentale. L’ensemble de ces résultats suggère que le micro-environnement de l’intestin médian contribue à minimiser l’influence des charges de surface portées par les résidus des boucles inter-hélicales du Domaine I sur la capacité des toxines du bacille de Thuringe à former des pores. Il indique aussi que, d’une part, selon le site de clivage et les conditions expérimentales utilisées, des protéolyses supplémentaires de la toxine Cry9Ca activée peuvent soit stimuler, soit nuire à son activité et que, d’autre part, le suc intestinal du sphinx du tabac contient probablement un inhibiteur de protéases qui pourrait jouer un rôle important dans l’activité des toxines du bacille de Thuringe.

Transport d’iode par le transporteur de sodium/acide monocarboxylique SMCT1

Le transporteur de Na+/ acide monocarboxylique sensible à l’ibuprofène (SMCT1) est exprimé dans la membrane apicale de plusieurs épithélia. Son rôle physiologique dans la glande thyroïde reste cependant obscur mais on présume qu’il pourrait agir comme un transporteur apical d’iode nécessaire pour la synthèse des hormones thyroïdiennes. Récemment, on a montré que SMCT1 possède un courant de fuite anionique sensible à [Na+]e qui permettrait de transporter l’iode de façon électrogénique. Cependant, un efflux d’iode sensible à l’ibuprofène, mais indépendant de la [Na+]e a été aussi observé sur des cultures primaires des thyrocytes porcins, suggérant un autre mécanisme de transport d’iode par SMCT1. Ce travail vise à comprendre les caractéristiques de ce genre de transport en utilisant comme modèle d’expression les ovocytes de Xenopus laevis. Les résultats obtenus des essais de captation d’iode radioactif montrent que SMCT1 présente un transport d’iode sensible à l’ibuprofène de l’ordre de 30nmol/ovocyte/h. Si ce transport est non saturable en iode (0-100 mM), il nécessite du Na+ dans la solution externe. En effet, le remplacement du Na+ extracellulaire par le NMDG inhibe complètement le transport. En outre, on s’est intéressé à exclure la possibilité de différents artefacts. En ayant trouvé que la grande majorité de l’iode radioactif se trouve dans la partie soluble de l’ovocyte, on exclut une liaison non spécifique de l’iode à la membrane cellulaire. Cependant, une bonne proportion de l’iode transporté pourrait être liée à des protéines à l’intérieur de l`ovocyte. En effet, on observe une réduction du transport d’iode dans les ovocytes exprimant SMCT1 de 81,6 ± 2 % en présence de 2 % BSA dans la solution extracellulaire. Également, on écarte la possibilité que le transport d’iode soit le résultat de la surexpression de protéines de transport endogènes dont les canaux chlore. Le transport d’iode semble spécifique à l’expression de SMCT1 et de manière intéressante à l’expression d’un autre transporteur de monocarboxylates, MCT1. L’analyse de l’ensemble des essais, y compris le fait que l’amplitude du transport observé est 20 fois plus grande que celle du courant de fuite nous mène à proposer que SMCT1 puisse transporter l’iode de façon électroneutre. Cependant, le mécanisme par lequel ceci est accompli n’est pas évident à identifier. L’utilisation d’un autre modèle cellulaire serait surement utile pour répondre à cette question.

Malformation Chiari-Like : l’investigation d’une maladie complexe par l’utilisation d’un modèle canin

La malformation de Chiari type 1 (MCI) est une anomalie congénitale de la jonction cranio-cérébrale fréquente avec une incidence de 1:1280. MCI est caractérisée par la descente des amygdales cérébelleuses à travers le foramen magnum et est souvent associée à la syringomyélie. Les causes de cette maladie semblent être multifactorielles incluant des facteurs génétiques. La MCI est similaire à une malformation fréquente chez la race des Griffon Bruxellois (GB) connue sous le nom de Malformation Chiari-like (MCL). Le modèle canin offre l’avantage d’une forte homogénéité génétique réduisant ainsi la complexité de la maladie et facilitant l’identification d’un locus causatif. Une étude d’association du génome entier sur une cohorte de 56 GB suivie d’une cartographie fine sur une cohorte de 217 GB a identifié un locus fortement associé à la MCL sur le chromosome 2 (22 SNPs, valeur P= 7 x 10-8) avec un haplotype de 1.9 Mb plus fréquent chez les non affectés. Une seconde étude d’association du génome entier sur une cohorte de 113 GB a permis d’identifier un 2 ème locus fortement associé à la MCL sur le chromosome 13 (25 SNPs , valeur P= 3 x 10 -7) avec un haplotype de 4 Mb surreprésenté chez les non affectés. Ces régions candidates constituent la première étape vers l’identification de gènes causatifs pour la MCL. Notre étude offre un point d’entrée vers une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-tendant la pathogénèse de la MCI humaine.

Cell wall composition regulates cell shape and growth behaviour in pollen tubes

L’une des particularités fondamentales caractérisant les cellules végétales des cellules animales est la présence de la paroi cellulaire entourant le protoplaste. La paroi cellulaire joue un rôle primordial dans (1) la protection du protoplaste, (2) est impliquée dans les mécanismes de filtration et (3) est le lieu de maintes réactions biochimiques nécessaires à la régulation du métabolisme et des propriétés mécaniques de la cellule. Les propriétés locales d’élasticité, d’extensibilité, de plasticité et de dureté des composants pariétaux déterminent la géométrie et la forme des cellules lors des processus de différentiation et de morphogenèse. Le but de ma thèse est de comprendre les rôles que jouent les différents composants pariétaux dans le modelage de la géométrie et le contrôle de la croissance des cellules végétales. Pour atteindre cet objectif, le modèle cellulaire sur lequel je me suis basé est le tube pollinique ou gamétophyte mâle. Le tube pollinique est une protubérance cellulaire qui se forme à partir du grain de pollen à la suite de son contact avec le stigmate. Sa fonction est la livraison des cellules spermatiques à l’ovaire pour effectuer la double fécondation. Le tube pollinique est une cellule à croissance apicale, caractérisée par la simple composition de sa paroi et par sa vitesse de croissance qui est la plus rapide du règne végétal. Ces propriétés uniques font du tube pollinique le modèle idéal pour l’étude des effets à courts termes du stress sur la croissance et le métabolisme cellulaire ainsi que sur les propriétés mécaniques de la paroi. La paroi du tube pollinique est composée de trois composantes polysaccharidiques : pectines, cellulose et callose et d’une multitude de protéines. Pour comprendre les effets que jouent ces différents composants dans la régulation de la croissance du tube pollinique, j’ai étudié les effets de mutations, de traitements enzymatiques, de l’hyper-gravité et de la gravité omni-directionnelle sur la paroi du tube pollinique. En utilisant des méthodes de modélisation mathématiques combinées à de la biologie moléculaire et de la microscopie à fluorescence et électronique à haute résolution, j’ai montré que (1) la régulation de la chimie des pectines est primordiale pour le contrôle du taux de croissance et de la forme du tube et que (2) la cellulose détermine le diamètre du tube pollinique en partie sub-apicale. De plus, j’ai examiné le rôle d’un groupe d’enzymes digestives de pectines exprimées durant le développement du tube pollinique : les pectate lyases. J’ai montré que ces enzymes sont requises lors de l’initiation de la germination du pollen. J’ai notamment directement prouvé que les pectate lyases sont sécrétées par le tube pollinique dans le but de faciliter sa pénétration au travers du style.

Intestin et défauts métaboliques dans la résistance à l'insuline

En lien avec l’augmentation constante de l’obésité, de plus en plus de personnes sont atteintes de résistance à l’insuline ou de diabète de type 2. Ce projet doctoral s’est surtout intéressé à l’une des conséquences majeures des pathologies cardiométaboliques, soit la dyslipidémie diabétique. À cet égard, les gens présentant une résistance à l’insuline ou un diabète de type 2 sont plus à risque de développer des perturbations lipidiques caractérisées essentiellement par des taux élevés de triglycérides et de LDL-cholestérol ainsi que de concentrations restreintes en HDL-cholestérol dans la circulation. Les risques de maladies cardiovasculaires sont ainsi plus élevés chez ces patients. Classiquement, trois organes sont connus pour développer l’insulino-résistance : le muscle, le tissu adipeux et le foie. Néanmoins, certaines évidences scientifiques commencent également à pointer du doigt l’intestin, un organe critique dans la régulation du métabolisme des lipides postprandiaux, et qui pourrait, conséquemment, avoir un impact important dans l’apparition de la dyslipidémie diabétique. De façon très intéressante, des peptides produits par l’intestin, notamment le GLP-1 (glucagon-like peptide-1), ont déjà démontré leur potentiel thérapeutique quant à l’amélioration du statut diabétique et leur rôle dans le métabolisme intestinal lipoprotéinique. Une autre évidence est apportée par la chirurgie bariatrique qui a un effet positif, durable et radical sur la perte pondérale, le contrôle métabolique et la réduction des comorbidités du diabète de type 2, suite à la dérivation bilio-intestinale. Les objectifs centraux du présent programme scientifique consistent donc à déterminer le rôle de l’intestin dans (i) l’homéostasie lipidique/lipoprotéinique en réponse à des concentrations élevées de glucose (à l’instar du diabète) et à des peptides gastro-intestinaux tels que le PYY (peptide YY); (ii) la coordination du métabolisme en disposant de l’AMPK (AMP-activated protein kinase) comme senseur incontournable permettant l’ajustement précis des besoins et disponibilités énergétiques cellulaires; et (iii) l’ajustement de sa capacité d’absorption des graisses alimentaires en fonction du gain ou de la perte de sa sensibilité à l’insuline démontrée dans les spécimens intestinaux humains prélevés durant la chirurgie bariatrique. Dans le but de confirmer le rôle de l’intestin dans la dyslipidémie diabétique, nous avons tout d’abord utilisé le modèle cellulaire intestinal Caco-2/15. Ces cellules ont permis de démontrer qu’en présence de hautes concentrations de glucose en basolatéral, telle qu’en condition diabétique, l’intestin absorbe davantage de cholestérol provenant de la lumière intestinale par l’intermédiaire du transporteur NPC1L1 (Niemann Pick C1-like 1). L’utilisation de l’ezetimibe, un inhibiteur du NPC1L1, a permis de contrecarrer cette augmentation de l’expression de NPC1L1 tout comme l’élévation de l’absorption du cholestérol, prouvant ainsi que le NPC1L1 est bel et bien responsable de cet effet. D’autre part, des travaux antérieurs avaient identifié certains indices quant à un rôle potentiel du peptide intestinal PYY au niveau du métabolisme des lipides intestinaux. Toutefois, aucune étude n’avait encore traité cet aspect systématiquement. Pour établir définitivement l’aptitude du PYY à moduler le transport et le métabolisme lipidique dans l’intestin, nous avons utilisé les cellules Caco-2/15. Notre étude a permis de constater que le PYY incubé du côté apical est capable de réduire significativement l’absorption du cholestérol et le transporteur NPC1L1. Puisque le rôle de l'AMPK dans l'intestin demeure inexploré, il est important non seulement de définir sa structure moléculaire, sa régulation et sa fonction dans le métabolisme des lipides, mais aussi d'examiner l'impact de l’insulino-résistance et du diabète de type 2 (DT2) sur son statut et son mode d’action gastro-intestinal. En employant les cellules Caco-2/15, nous avons été capables de montrer (i) la présence de toutes les sous-unités AMPK (α1/α2/β1/β2/γ1/γ2/γ3) avec une différence marquée dans leur abondance et une prédominance de l’AMPKα1 et la prévalence de l’hétérotrimère α1/β2/γ1; (ii) l’activation de l’AMPK par la metformine et l’AICAR, résultant ainsi en une phosphorylation accrue de l’enzyme acétylCoA carboxylase (ACC) et sans influence sur l'HMG-CoA réductase; (iii) la modulation négative de l’AMPK par le composé C et des concentrations de glucose élevées avec des répercussions sur la phosphorylation de l’ACC. D’autre part, l’administration de metformine au Psammomys obesus, un modèle animal de diabète et de syndrome métabolique, a conduit à (i) une régulation positive de l’AMPK intestinale (phosphorylation de l’AMPKα-Thr172); (ii) la réduction de l'activité ACC; (iii) l’augmentation de l’expression génique et protéique de CPT1, supportant une stimulation de la β-oxydation; (iv) une tendance à la hausse de la sensibilité à l'insuline représentée par l’induction de la phosphorylation d'Akt et l’inactivation de la phosphorylation de p38; et (v) l’abaissement de la formation des chylomicrons ce qui conduit à la diminution de la dyslipidémie diabétique. Ces données suggèrent que l'AMPK remplit des fonctions clés dans les processus métaboliques de l'intestin grêle. La preuve flagrante de l’implication de l’intestin dans les événements cardiométaboliques a été obtenue par l’examen des spécimens intestinaux obtenus de sujets obèses, suite à une chirurgie bariatrique. L’exploration intestinale nous a permis de constater chez ceux avec un indice HOMA élevé (marqueur d’insulinorésistance) (i) des défauts de signalisation de l'insuline comme en témoigne la phosphorylation réduite d'Akt et la phosphorylation élevée de p38 MAPK; (ii) la présence du stress oxydatif et de marqueurs de l'inflammation; (iii) la stimulation de la lipogenèse et de la production des lipoprotéines riches en triglycérides avec l’implication des protéines clés FABP, MTP et apo B-48. En conclusion, l'intestin grêle peut être classé comme un tissu insulino-sensible et répondant à plusieurs stimuli nutritionnels et hormonaux. Son dérèglement peut être déclenché par le stress oxydatif et l'inflammation, ce qui conduit à l'amplification de la lipogenèse et la synthèse des lipoprotéines, contribuant ainsi à la dyslipidémie athérogène chez les patients atteints du syndrome métabolique et de diabète de type 2.