Propriedades biológicas em agregados de um Latossolo Vermelho-Escuro sob plantio convencional e direto no Cerrado

As distribuições do carbono da biomassa microbiana (CBM), da atividade enzimática e do C mineralizável foram avaliadas em agregados, coletados na profundidade de 0-0,05 m, de um Latossolo Vermelho-Escuro argiloso, sob vegetação nativa de Cerrado e sob sistemas de plantio direto (PD) e convencional com arado de discos (PC), estabelecidos há 21 anos. A separação dos agregados foi realizada por via úmida. As classes de 8,00-2,00 mm; 0,50-0,25 mm e 0,25-0,106 mm e amostras denominadas soma de agregados foram selecionadas para as determinações biológicas. Em relação à área nativa, os sistemas cultivados causaram quebra de macroagregados e perda de CBM. A aplicação localizada de adubos, o menor revolvimento do solo e os maiores teores de matéria orgânica no PD favoreceram, em relação ao PC, a ocorrência de maiores níveis de fosfatase ácida e arilsulfatase nos agregados e nas amostras que representavam a soma de agregados. Os microagregados e a soma dos agregados do PD também apresentaram maiores teores de CBM, comparativamente ao PC. As maiores atividades da beta-glucosidase foram observadas nos macro e microagregados do PD. Os sistemas de manejo (PD e PC) influenciaram a distribuição das propriedades biológicas nos agregados. A atividade das enzimas beta-glucosidase, fosfatase ácida e arilsulfatase foi maior em macroagregados do PD apesar da distribuição semelhante do CBM nas três classes de agregados avaliadas. No PC, apenas beta-glucosidase apresentou distribuição diferenciada entre macro e microagregados.

Avaliação de três áreas de solo construído após mineração de carvão a céu aberto em Lauro Müller, Santa Catarina

Em solos construídos após mineração de carvão, a contaminação das camadas superficiais com pirita provoca intensa acidificação do solo, acelera a intemperização de minerais, eleva os teores de Al e Mn e aumenta a lixiviação de bases. O presente trabalho avaliou características químicas, teor de argila e mineralogia, bem como a variabilidade espacial para algumas dessas características em três áreas de solos construídos após mineração de carvão a céu aberto no município de Lauro Müller, Santa Catarina. As três áreas selecionadas apresentavam diferenças no modo de construção topográfico. A primeira, denominada Mina Juliana (MJ), foi construída em 1996, utilizando material (sólum, regolito argiloso e rocha) que foi separado e estocado antes da mineração, conforme previsto no plano de reabilitação. A segunda, denominada Mina do Apertado (MA), foi construída, em 1996, usando, como material de cobertura, o sólum proveniente do decapeamento de um morro adjacente à área. A terceira área, denominada Mina Rio do Meio (MRM), sofreu apenas construção topográfica em 1983, com mistura de resíduos de pirita de carvão e rochas de várias camadas. Amostras de solo foram coletadas em sistema de grade de pontos, em três profundidades, sendo analisados o pH em água, teores de Ca, Mg, K e Al trocáveis, H + Al e condutividade elétrica. Em amostras selecionadas, analisaram-se alguns metais pesados e a mineralogia da fração argila. Análises efetuadas em dois perfis de solo representativos das condições anteriores à mineração foram utilizados, para comparação. Todas as áreas apresentaram grande dispersão de valores para características químicas e teor de argila dos solos entre os pontos amostrados. O processo de construção do solo que resultou em maior uniformidade destas características e melhores condições para o estabelecimento de espécies vegetais foi o da área MJ. O solo da área MA, graças à mistura de resíduos de carvão piritoso com o solo superficial, está em franco processo de acidificação e contém alta concentração de sais. O solo da área MRM, em virtude do abandono e do longo período de exposição de resíduos piritosos na camada superficial, mostra elevada acidez, tendo já sofrido intensa lixiviação dos sais. As únicas variáveis testadas que apresentaram modelo definido para semivariância foram Al trocável, H + Al e argila, cujo alcance variou de 50 a 70 m.

Metodologia para reconhecimento de três solos por sensores: laboratorial e orbital

O presente trabalho teve como objetivo estabelecer um método para a utilização de dados espectrais, obtidos em laboratório e imagens do Landsat 5, no reconhecimento e discriminação de três classes de solos do estado de São Paulo. Foram coletadas amostras de solo e obtidos os dados de reflectância por espectrorradiômetro em laboratório como padrão de um Latossolo Vermelho distroférrico (LVdf), um Argissolo Vermelho-Amarelo (PVA) e Neossolo Quartzarênico (RQ). Foram extraídos dados de reflectância das imagens, com os quais se efetuou a classificação digital pelo classificador Spectral Angular Mapper. As curvas espectrais obtidas por espectrorradiômetro em laboratório mostraram três padrões distintos de comportamento espectral, baseados nas diferenças da forma das curvas, feições de absorção dos minerais do solo e na intensidade de reflectância. O LVdf apresentou menor albedo em virtude da textura argilosa e maiores teores de Fe, ao contrário dos solos mais arenosos PVA e RQ. As bandas de absorção características da caulinta (2.200 nm), OH- e água (1.400 e 1.900 nm) ocorreram em todos os solos. Solos arenosos, como o RQ, apresentaram uma curva espectral com tendência positiva. A linha do solo mostrou distinção espectral, tanto com dados orbitais como terrestres, indicando que cada solo tem uma tendência individual. Os padrões espectrais obtidos em laboratório foram importantes para a eficiência do método na detecção dos mesmos nas imagens de satélite. Os solos avaliados podem ser discriminados e reconhecidos pela interpretação quantitativa em imagens. O método mostrou-se eficiente como auxílio no mapeamento de solos no nível semidetalhado de alta intensidade.

Isolamento e identificação de fungos micorrízicos rizoctonióides associados a três espécies de orquídeas epífitas neotropicais no Brasil

Distúrbios causados pelo homem têm resultado no aumento do risco de extinção de diversos táxons de orquídeas nativas da Mata Atlântica no Brasil. Na natureza, orquídeas utilizam obrigatoriamente fungos endomicorrízicos para a germinação de sementes e desenvolvimento da plântula, ao menos nos primeiros estádios do seu ciclo de vida. Assim, fungos micorrízicos associados ao sistema radicular de orquídeas nativas vêm sendo isolados, caracterizados e armazenados para uso em futuros programas de conservação de espécies de orquídeas, por meio da germinação simbiótica. Três isolados de fungos micorrízicos rizoctonióides foram obtidos do sistema radicular de três espécies de orquídeas neotropicais, Gomesa crispa, Campylocentrum organense e Bulbophyllum sp., de três diferentes fragmentos de Mata Atlântica no Brasil. Estudos taxonômicos, baseados na condição nuclear, morfologia da hifa vegetativa e ultra-estrutura do septo dolipórico, revelaram que os isolados pertencem aos gêneros Ceratorhiza e Rhizoctonia. Esse é o primeiro relato do isolamento de fungos micorrízicos associados ao sistema radicular dessas espécies de orquídeas neotropicais. Aspectos relativos à taxonomia e ao uso desses isolados no contexto de um programa de conservação de orquídeas nativas são discutidos.

Efeito da qualidade da água de irrigação sobre atributos hídricos de um Neossolo

Duas fontes de água (rio e poço raso) foram testadas quanto à ação de seus sais sobre atributos hídricos de um Neossolo Flúvico textura franco-argilosa, durante o biênio 2000/2001. O experimento foi realizado numa área de 5.000 m² cultivada com a bananeira Musa sp cultivar pacovan, num esquema fatorial 2 x 3, com duas fontes d'água e três lâminas de irrigação (L1, L2 e L3), via microaspersão. Os resultados mostraram que as lâminas e a qualidade da água não tiveram efeitos significativos sobre a condutividade hidráulica. As curvas de retenção de água apresentaram variações nos valores de umidade retida abaixo da capacidade de campo durante o período de estiagem; no período chuvoso, foram observadas diferenças nas tensões acima da capacidade de campo. A predominância de argila e silte na fração textural, bem como os ciclos de expansão e contração do solo estudado, muito provavelmente, definiu a expressão dos atributos hídricos avaliados, uma vez que a concentração eletrolítica e a Relação de Adsorção de Sódio (RAS) do solo não atingiram valores suficientes para influir nas variáveis analisadas.

Variabilidade de goethita e hematita via dissolução redutiva em solos de região tropical e subtropical

Dezenove amostras de horizontes B latossólicos, uma de B plíntico, uma de B incipiente e uma de horizonte Cr foram submetidas a dissoluções seletivas da goethita e da hematita por ditionito-citratro-bicarbonato de sódio a 20 ºC em intervalos de tempo entre 5 e 3.840 minutos. O diâmetro médio do cristal (DMC), área superficial específica (ASE) e substituição do ferro por Al (substituição por Al3+) da goethita e da hematita nas amostras foram estimados, por difratometria de raios X (DRX), em subamostras não tratadas e em subamostras tratadas selecionadas ao longo das dissoluções seletivas. O controle das fases de goethita e hematita que persistiram após cada etapa da dissolução seletiva foi realizado pelo método da difratometria diferencial de raios X (DDRX). A cinética dissolutiva dos cristais foi descrita por meio da segmentação das curvas de dissolução do ferro no tempo em intervalos em que o comportamento dissolutivo foi linear. As taxas de dissolução nos diferentes segmentos lineares foram estimadas a partir do coeficiente angular da reta relativa a cada segmento. Em amostras goethíticas latossólicas, a metodologia discriminou diferentes fases de goethita (populações heterogêneas) quanto à substituição por Al3+, DMC e ASE e ofereceu condições para classificar o grau de estabilidade da goethita em baixa, média, alta e muito alta estabilidade. Amostras goethíticas oriundas de ambientes pedogênicos jovens e amostras hematíticas latossólicas caracterizaram-se pela maior homogeneidade de seus cristais, classificados como de baixa e média estabilidade. Nas amostras goethíticas, a proporção de cristais com maior estabilidade (alta substituição por Al3+ e cristalinidade) em cada população mostrou associação positiva com a proporção de gibbsita em relação a caulinita nas amostras. A hematita apresentou menor resistência à dissolução por redução em relação à goethita, exceto quando a última combinou baixa substituição por Al3+ e alta ASE. A caracterização de populações heterogêneas de goethita pode ampliar a utilização deste óxido como indicador de processos pedogênicos em solos poligenéticos, bem como contribuir para um melhor entendimento do comportamento químico e físico desses solos.

Mineralogia e química de três solos de uma toposseqüência da bacia sedimentar do Alto Solimões, Amazônia ocidental

Pouco se conhece sobre os atributos mineralógicos e químicos dos solos da região do Alto Solimões, em comparação aos solos do Médio e Baixo Amazonas, mais estudados. No Alto Solimões, pela maior proximidade do ambiente andino, há maior possibilidade de enriquecimento dos solos. Este trabalho teve por objetivo ampliar o conhecimento dos solos dessa região por meio da caracterização de atributos mineralógicos e químicos de três solos de uma toposseqüência na região de Benjamin Constant (AM), próximo à fronteira Brasil-Peru. Tais solos situam-se das partes mais elevadas até a várzea, sendo classificados como Argissolo Amarelo Ta alumínico abrupto, Plintossolo Argilúvico alumínico abrúptico e Neossolo Flúvico Ta eutrófico. Os resultados mostram que estes solos possuem maior riqueza de nutrientes e de minerais alteráveis, com menor grau de intemperismo, em comparação aos solos mais bem drenados da parte oriental da Amazônia, derivados de sedimentos mais antigos ou de rochas cristalinas. Os baixos teores de Fe e Mn no Plintossolo em todas as frações analisadas, em comparação aos demais solos da toposseqüência, indicam o predomínio de processos de remoção nesse ambiente, enquanto, no Neossolo Flúvico, a remoção é superada pela deposição de novos sedimentos, possibilitando a ocorrência em teores elevados de Fe e Mn. Os valores de capacidade máxima de adsorção de fosfato são baixos nos horizontes superficiais, tornando-se elevados nos horizontes subsuperficiais mais ricos em argila ou com ocorrência de plintita, podendo representar, em caso de erosão, um fator limitante ao cultivo agrícola.

Variação na temperatura do solo em três sistemas de manejo na cultura do feijão

A temperatura do solo é uma propriedade que afeta diretamente o crescimento das plantas e é influenciada pelo balanço de energia na superfície do solo. Dessa maneira, os sistemas de manejo do solo têm efeito na temperatura, visto que alteram as condições da superfície do solo. O objetivo deste estudo foi determinar o efeito de três sistemas de manejo na temperatura do solo durante todo o ciclo do feijoeiro. O delineamento experimental foi de blocos ao acaso, com os seguintes preparos do solo: plantio direto há sete anos (PD); plantio direto revolvido por uma aração e uma gradagem (PDar) e plantio direto revolvido por escarificador (PDesc), distribuídos em quatro blocos. O solo do experimento é classificado como Argissolo Vermelho-Amarelo distrófico arênico. A temperatura do solo foi determinada durante todo o ciclo do feijoeiro, realizando-se leituras a cada 10 min, em um sistema automatizado de coleta de dados, com sensores do tipo termopar (cobre-constantan), instalados na profundidade de 0,025 m e a 0,10 m. Foram determinadas a densidade do solo e a produtividade do feijoeiro. Durante todo o ciclo do feijoeiro, o PD apresentou a menor temperatura máxima e a menor amplitude diária entre os sistemas de manejo. Na profundidade de 0,025 m, o PDar apresentou temperatura máxima de 42,2 °C, o PDesc de 43,7 °C e o PD de 36,1 °C. A variação diária da temperatura do solo num dia com 12 h de sol, no início do desenvolvimento das plantas (02/12/2002), indicou que a maior temperatura ocorreu próximo às 15 h, com valores de 40 ºC, no PDar, e 30 ºC, no PD, na profundidade de 0,025 m. Quando as plantas sombreavam o solo, não houve diferenças na temperatura do solo entre os sistemas de manejo. As diferenças na temperatura do solo não provocaram diferenças na produtividade de grãos do feijoeiro, haja vista que os maiores efeitos da temperatura do solo ocorrem na germinação e emergência das plântulas.

Acetylcholine-induced vasodilation and reactive hyperemia are not affected by acute cyclo-oxygenase inhibition in human skin

Résumé Il est actuellement reconnu que l'endothélium vasculaire joue un rôle primordial dans la genèse des maladies cardiovasculaires, notamment l'artériosclérose. Dès lors, il est important de pouvoir investiguer la fonction endothéliale en clinique. Pour ce faire, il est particulièrement simple d'examiner la microcirculation cutanée, car celle-ci est très simplement accessible, de manière non-invasive, par fluxmétrie laser-Doppler. Pratiquement, on mesure l'augmentation du flux sanguin dermique en réponse à des stimuli connus pour agir via l'endothélium vasculaire. Les stimuli endothélium-dépendants les plus courants sont l'interruption temporaire du flux sanguin qui est suivie d'une hyperémie réactive, et l'administration transcutanée d'acétylcholine (Ach) par iontophorèse. La iontophorèse consiste à obtenir le transfert d' une substance ionisée, telle l'Ach, par l'application d'un courant électrique de polarité appropriée. L'objectif du présent travail était de déterminer le rôle des prostaglandines dans ces réponse vasodilatatrices dépendante de l'endothélium, rôle actuellement peu clair. 23 jeunes hommes volontaires non fumeurs et en bonne santé habituelle ont été examinés lors de deux visites séparées par 1 à 3 semaines. Lors de chaque visite, l'hyperémie réactive et la réponse vasodilatatrice à l'Ach ont été déterminées dans la peau de l'avant bras après administration soit d'un placebo, soit d'un inhibiteur de la cyclooxygénase (COX, enzyme qui contrôle la synthèse des prostaglandines). Chez certains sujets, l'inhibiteur était de l'acétylsalicylate de lysine (900 mg par voie intraveineuse). Chez d'autres sujets, il s'agissait d'indométhacine. (75 mg par voie orale). Comme la stimulation nociceptive liée au courant iontophorétique peut influencer la réponse à l'Ach, celle-ci a été déterminée en présence et en l'absence d'anesthésie de surface (crème de lidocaine). La réponse à l'Ach a été obtenue pour 4 doses différentes de cet agent (exprimées sous la forme de la densité de charge iontophorétique appliquée : 0.28, 1.4, 7, et 14 millicoulombs par cm2 de peau exposée). Le flux sanguin dermique était mesuré par imagerie laser-Doppler, une variante de la fluxmétrie laser-Doppler classique permettant l'exploration d'une surface de peau de taille arbitraire. Quelle que soit la condition testée, nous n'avons jamais observé la moindre influence de l'inhibition de la COX sur l'hyperémie réactive, ni sur la réponse à l'Ach. Cette dernière était augmentée significativement par l'anesthésie cutanée, que les sujets aient reçu ou non de l'acétylsalicylate de lysine ou de l'indométhacine . Par exemple, la réponses moyenne (±SD) à la plus haute dose d'Ach (testée sur 6 sujets, et exprimée en unités de perfusion, comme il est d'usage en fluxmétrie laser-Doppler ) était la suivante : en l'absence d'anesthésie : acétylsalicylate de lysine 339 ± 105, placebo 344 ± 68 ; avec l'anesthésie : acétylsalicylate de lysine 453 ± 76 , placebo 452 ± 65 (p * 0.001 pour les effets de l'anesthésie). En conclusion, nos résultats infirment une contribution des prostaglandines à l'hyperémie réactive ou à la vasodilatation induite par l'acétylcholine dans la microcirculation cutanée. Dans ce lit vasculaire, l'anesthésie locale accroît la vasodilatation induite par l'acétylcholine par un mécanisme indépendant des prostaglandines.

Crescimento micelial e síntese de proteínas de choque térmico em três isolados de fungos ectomicorrízicos sob condições de temperaturas supra-ótimas

A síntese de proteínas de choque térmico é uma alteração fisiológica transiente na célula de organismos expostos a temperaturas supra-ótimas. A resposta fisiológica ao choque térmico é dependente, particularmente, do tipo de célula e da capacidade dos organismos em responder às alterações do meio. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o crescimento micelial e a síntese de proteínas de choque térmico de dois isolados de Pisolithus sp. (RV82 e RS24) e de um isolado de Paxillus involutus em temperaturas supra-ótimas. No trabalho, foram feitas análises de crescimento micelial em placa de Petri com meio apropriado para o crescimento sob condições de temperaturas subletais, letais e de choque térmico. As proteínas nos micélios dos isolados foram marcadas com aminoácido radioativo (³H-leucina), e a radioatividade, quantificada em solução de cintilação. A síntese das proteínas de choque térmico (HSPs) foi avaliada em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE e 2D-PAGE). Demonstrou-se, com ³H-leucina, que os fungos ectomicorrízicos apresentaram respostas diferenciadas em relação ao crescimento micelial quando expostos a temperaturas supra-ótimas. Os dois isolados de Pisolithus sp., RS24 e RV82, mostraram-se mais tolerantes a altas temperaturas, quando comparado ao isolado de P. involutus. Os isolados de Pisolithus sp. diferem quanto à síntese de proteínas de estresse, com a síntese de HSPs de alta e de baixa massa molecular. Em resposta ao choque térmico, o isolado RV82 sintetizou proteínas putativas dos grupos HSP70, HSP28 e HSP26 e as sHSPs (15-18 kDa), enquanto o isolado RS24 sintetizou as dos grupos HSP86, HSP60, HSP55 e HSP35 e as sHSPs (12-18 kDa). A baixa tolerância a temperaturas elevadas do isolado de P. involutus foi atribuída à ausência de síntese de proteínas putativas do grupo HSPs em condições de choque térmico. Os resultados sugerem que os isolados de fungos ectomicorrízicos diferem quanto ao mecanismo de indução de termotolerância.

Atributos mineralógicos de três solos explorados com a cultura do melão na Chapada do Apodi: RN

Este trabalho teve o objetivo de caracterizar os principais solos explorados com a cultura do melão na Chapada do Apodi, Estado do Rio Grande do Norte, no tocante aos aspectos mineralógicos, visando fornecer subsídios para implantação de um manejo adequado à cultura e ao solo. Foram selecionados três solos: Cambissolo Háplico Ta eutrófico típico - CXve (Typic Haplocambids), Latossolo Vermelho-Amarelo eutrófico argissólico - LVAe (Typic Eutrotorrox) e Argissolo Vermelho distrófico arênico - PVd (Arenic Kandiustults). Foram realizadas análises mineralógicas nas frações areia, silte e argila, por difratometria de raios X, além de estudos complementares em amostras indeformadas por meio da microscopia eletrônica de varredura. A composição mineralógica é semelhante nos perfis estudados; o quartzo predomina nas frações areia e silte, enquanto a fração argila é constituída predominantemente por caulinita. O perfil 1 (CXve), comparado com os outros dois, é o menos evoluído na escala pedogenética. Os perfis 2 (LVAe) e 3 (PVd) apresentam praticamente a mesma maturidade, embora o primeiro seja um pouco mais evoluído. O fato de o perfil 1 (CXve) apresentar química de solo jovem e mineralogia de solo muito evoluído revela incoerência entre os atributos químicos e mineralógicos daquele solo. Pelas condições de semi-aridez do local em que os três perfis estão inseridos, o domínio da caulinita na fração argila sugere que os solos foram originados em condições climáticas diferentes das atuais, provavelmente mais úmidas, ou que eles tenham se desenvolvido a partir de um material pré-intemperizado.

Estoques de carbono orgânico e de nitrogênio, pH e densidade de um Latossolo após três aplicações de lodos de esgoto

O elevado conteúdo de matéria orgânica de lodo de esgoto é uma das motivações para sua disposição no ambiente como condicionador do solo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de aplicações consecutivas de lodo de esgoto sobre o acúmulo de C e de N (total e mineral), sobre o pH e sobre a densidade de um Latossolo. As avaliações foram feitas em duas profundidades do solo (0-0,1 e 0,2-0,4 m) após três cultivos de milho, em experimento realizado entre os anos de 1999 e 2001, em Jaguariúna-SP. Os tratamentos consistiram de cinco doses crescentes de dois tipos de lodo de esgoto, aplicadas a cada cultivo. O aumento das doses aplicadas (totalizando 0, 10.284, 20.568, 41.136 e 82.272 kg ha-1) do lodo da Estação de Tratamento de Esgotos de Franca-SP, de origem urbana, causou crescimento significativo dos estoques de C orgânico e de N na camada superficial. Nos tratamentos com o lodo da Estação de Tratamento de Esgotos de Barueri-SP (totalizando 0, 17.405, 34.810, 69.620 e 139.240 kg ha-1), produzido a partir de esgotos urbanos e industriais, apesar da incorporação de 14 % a mais de C ao solo, os estoques de C não foram influenciados pelas doses aplicadas e houve crescimento significativo dos estoques de N. A densidade na camada superficial diminuiu significativamente com o aumento das doses dos dois tipos de lodo de esgoto. Houve acidificação do solo nas duas camadas estudadas, com necessidade de duas calagens, após o segundo e terceiro cultivos. Observou-se lixiviação de N-mineral para maiores profundidades do solo.

Mechanisms of antifungal resistance in the opportunistic fungus Aspergillus fumigatus

ABSTRACT Aspergillus fumigatus is one of the most prevalent airbone fungal pathogen and can cause severe fatal invasive aspergillosis in immunocompromised patients. Several antifungal agents are available to treat these infections but with limited success. These agents include polyenes (amphotericin B), echinocandins (caspofungin) and azoles, which constitute the most important class with itraconazole (ITC) and voriconazole as major active compounds. Azole-derived antifungal agents target the ergosterol biosynthesis pathway via the inhibition of the lanosterol 14α-demethylase (cyp51/ERG1 1), a cytochrome P450 responsible for the conversion of lanosterol to ergosterol, which is the main component of cell membrane in fungi. A. fumigatus is also found in the environment as a contaminant of rotting plant or present in composting of organic waste. Among antifungal agents used in the environment for crop protection, the class of azoles is also widely used with propiconazole or prochloraz as examples. However, other agents such as dicarboximide (iprodione), phenylamide (benalaxyl) or strobilurin (azoxystrobin) are also used. Emergence of clinical azole-resistant isolates has been described in several European countries. However the incidence of antifungal resistance has not been yet reported in details in Switzerland. In this study, the status of antifungal resistance was investigated on A. fumigatus isolates collected from Swiss hospitals and from different environmental sites and. tested for their susceptibility to several currently used antifungal agents. The data showed a low incidence of resistance for all tested agents among clinical and environmental isolates. Only two azole-resistant environmental isolates were detected and none among the clinical tested isolates. In general, A. fumigatus was susceptible to all antifungals tested in our study, except to azoxystrobin which was the less active agent against all isolates. Since mechanisms of antifungal resistance have been poorly investigated until now in A. fumigatus, this work was aimed 1) to identify A. fumigatus genes involved in antifungal resistance and 2) to test their involvement in the development of resistance in sampled isolates. Therefore, this work proposed to isolate A. fumigatus genes conferring resistance to a drug-hypersusceptible Saccharomyces cerevisiae strain due to a lack of multidrug transporter genes. Several genes were recovered including three distinct efflux transporters (atrF, atrH and mdrA) and a bZip transcription factor, yapA. The inactivation of each transporter in A. fumigatus indicated that the transporters were involved in the basal level of azole susceptibility. The inactivation of YapA led to a hypersusceptibility to H2O2, thus confirming the involvement of this gene in the oxidative stress response of A. fumigatus. The involvement of the abovementioned transporters genes and of other transporters genes identified by genome analysis in azole resistance was tested by probing their expression in some ITC-resistant isolates. Even if upregulation of some transporters genes was observed in some investigated isolates, the correlation between azole resistance and expression levels of all these transporters genes could not be clearly established for all tested isolates. Given these results, the present work addressed 1) alteration in the expression of cyp51A encoding for the azole target enzyme, and 2) mutation(s) in the cyp51A sequence as potential mechanisms of azote resistance in A. . However, overexpression of cyp51A in the investigated isolates was not linked with azote resistance. Since it was reported that mutation(s) in cyp51A were participating in azote resistance in A. fumigatus, a functional complementation of cyp51A cDNAs from ITC-resistant A. fumigatus strains in S. cerevisiae ergl 1 Δ mutant strain was attempted. Expression in S. cerevisiae allowed the testing of these cDNAs with regards to their functionality and involvement in resistance to specific azote compounds. We could demonstrate that Cyp51A protein with a G54E or M220K mutations conferred resistance to specific azoles in S. cerevisiae, therefore suggesting that these mutations were important for the development of azote resistance in A. fumigatus. In conclusion, this work showed a correlation between ITC resistance and mechanisms involving overexpression of transporters and cyp51A mutations in A. fumigatus isolates. However, azole resistance of some isolates has not been solved and thus it will be necessary to approach the study of resistance mechanisms in this fungal species using alternative methodologies. RESUME Aspergillus fumigatus est un champignon opportuniste répandu et est la cause d'aspergilloses invasives le plus souvent fatales chez des patients immunodéprimés. Plusieurs antifongiques sont disponibles afin de traiter ces infections, cependant avec un succès limité. Ces agents incluent les polyènes (amphotericin B), les échinocandines (caspofungin) et les azoles, qui représentent la plus importante classe d'antifongiques avec l'itraconazole (ITC) et le voriconazole comme principaux agents actifs. Les dérivés azolés ciblent la voie de biosynthèse de l'ergostérol via l'inhibition de la lanostérol 14α-demethylase (cyp51/ERG11), un cytochrome P450 impliqué dans la conversion du lanostérol en ergostérol, qui est un composant important de la membrane chez les champignons. A. fumigatus est également répandu dans l'environnement. Parmi les antifongiques employés en agriculture afin de protéger les cultures, les azoles sont aussi largement utilisés. Cependant, d'autres agents tels que les dicarboximides (iprodione), les phenylamides (benalaxyl) et les strobilurines (azoxystrobin) peuvent être également utilisés. L'émergence de souches cliniques résistantes aux azoles a été décrite dans différents pays européens. Cependant, l'incidence d'une telle résistance aux azoles n'a pas encore été reportée en détails en Suisse. Dans ce travail, l'émergence de la résistance aux antifongiques a été étudiée par analyse de souches d'A. fumigatus provenant de milieux hospitaliers en Suisse et de différents sites et leur susceptibilité testée envers plusieurs antifongiques couramment utilisés. Les données obtenues ont montré une faible incidence de la résistance parmi les souches cliniques et environnementales pour les agents testés. Seulement deux souches environnementales résistantes aux azoles ont été détectées et aucune parmi les souches cliniques. Les mécanismes de résistance aux antifongiques ayant été très peu étudiés jusqu'à présent chez A. fumigatus , ce travail a eu aussi pour but 1) d'identifier les gènes d' A. fumigatus impliqués dans la résistance aux antifongiques et 2) de tester leur implication dans la résistance de certaines souches. Ainsi, il a été proposé d'isoler les gènes d' A. fumigatus pouvant conférer une résistance aux antifongiques à une souche de Saccharomyces cerevisiae hypersensible aux antifongiques. Trois transporteurs à efflux (atrF, atrH et mdrA) et un facteur de transcription appartenant à la famille des bZip (YapA) ont ainsi été isolés. L'inactivation, dans une souche d'A. fumigatus, de chacun des ces transporteurs a permis de mettre en évidence leur implication dans la susceptibilité d'A. fumigatus aux antifongiques. L'inactivation de YapA a engendré une hypersusceptibilité à l' H2O2, confirmant ainsi le rôle de ce gène dans la réponse au stress oxydatif chez A . fumigatus. La participation dans la résistance aux antifongiques des gènes codant pour des transporteurs ainsi que d'autres gènes identifiés par analyse du génome a été déterminée en testant leur niveau d'expression dans des souches résistantes à l'ITC. Bien qu'une surexpression de transporteurs ait été observée dans certaines souches, une corrélation entre la résistance à l'ITC et les niveaux d'expression de ces transporteurs n'a pu être clairement établie. Ce présent travail s'est donc porté sur l'étude de 2 autres mécanismes potentiellement impliqués dans la résistance aux azoles : 1) la surexpression de cyp51A codant pour l'enzyme cible et 2) des mutations dans cyp51A. Cependant, la surexpression de cyp51A dans les souches étudiées n'a pas été constatée. L'effet des mutations de cyp51A dans la résistance aux azoles a été testée par complémentation fonctionnelle d'une souche S. cerevisiae déletée dans son gène ERG11. L'expression de ces gènes chez S. cerevisiae a permis de démontrer que les protéines Cyp51Ap contenant une mutation G54E ou M220K pouvaient conférer une résistance spécifique à certains azoles, ainsi suggérant que ces mutations pourraient être importantes dans le développement d'une résistance aux azoles chez A. fumigatus. En conclusion, ce travail a permis de mettre en évidence, dans des souches d'A. fumigatus , une corrélation entre leur résistance à l' ITC et les mécanismes impliquant une surexpression de transporteurs et des mutations dans cyp51A. Cependant, ces mécanismes n'ont pu expliquer la résistance aux azoles de certaines souches et c'est pourquoi de nouvelles approches doivent être envisagées afin d'étudier ces mécanismes.

Activation mechanisms of the protease MALT1 and cleavage of one of its targets - the ribonuclease Regnase-1- in lymphocytes and lymphoma cell lines

Persistent infection induces an adaptive immune response that is mediated by T and B lymphocytes. Upon triggering with an antigen, these cells become activated and turn into fast expanding cells able to efficiently defend the host. Lymphocyte activation is controlled by a complex composed of CARMA1, BCL10 and MALT1 which regulates the NF-KB signaling pathway upon antigen triggering. Abnormally high expression or activity of either one of these three proteins can favor the development of lymphomas, while genetic defects in the pathway are associated with immunodeficiency. MALT1 was identified as a paracaspase sharing homology with other cysteine proteases, namely caspases and metacaspases. In order to be active, caspases need to dimerize. Based on their sequence similarity with MALT1, we hypothesized that dimerization might also be a mechanism of activation employed by MALT1. To address this assumption, we performed a bioinformatics modelling based on the crystal structures of several caspases. Our model suggested that the MALT1 caspase-like domain can indeed form dimers. This finding was later confirmed by several published crystal structures of MALT1. In the dimer interface of our model, we noticed the presence of charged amino acids that could potentially form salt bridges and thereby hold both monomers together. Mutation of one of these residues, E549, into alanine completely blocked the catalytic activity of MALT1. Additionally, we provided evidence for a role of E549 in promoting the MALTl-dependent growth of cells derived from diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) of the aggressive B cell-like type (ABC). To our initial surprise, the E549A mutation showed only a partial defect in dimerization, indicating that additional residues are essential to form a stable dimer. The MALT1 crystal structures revealed a key function for E549 in stabilizing the catalytic site of the protease via its interaction with an arginine which is located next to the catalytic active cysteine. In an additional study, we discovered that MALT1 monoubiquitination is required for the catalytic activity of the protease. Interestingly, we found that the MALT1 dimer interface mutant E549A could not be monoubiquitinated. Based on these findings, we suggest that correct formation of the dimer interface is a prerequisite for monoubiquitination. In a second project, we discovered a novel target of the protease MALT1, the ribonuclease Regnase¬la It was described that the RNase activity of Regnase-1 negatively regulates immune responses. We could show that in ABC DLBCL cell lines, Regnase-1 is not only cleaved by MALT1 but also phosphorylated, at least in part, by the inhibitor of KB kinase (IKK). Both regulations appear to restrain the RNase function of Regnase-1 and thereby allow the production of pro-survival proteins. In conclusion, our studies further highlight and explain the importance of the catalytic activity of MALT1 for the activation of lymphocytes and provide additional knowledge for the development of specific drugs targeting the catalytic activity of MALT1 for immunomodulation and treatment of lymphomas.  SUMMARY IN FRENCH PhD Thesis Katrin Cabalzar 2 SUMMARY IN FRENCH Une infection persistante induit une réponse immunitaire adaptative par l'intermédiaire des lymphocytes T et B. Quand elles reconnaissent l'antigène, ces cellules sont activées et se multiplient très rapidement pour défendre efficacement l'hôte. L'activation des lymphocytes est transmise par un complexe composé de trois protéines, CARMA1, BCL10 et MALT1, qui régule la voie de signalisation NF-KB lorsque l'antigène est reconnu. L'expression ou l'activité anormalement élevée de l'une de ces trois protéines peut favoriser le développement de lymphomes, tandis que des défauts génétiques de cette voie de signalisation sont associés à l'immunodéficience. MALT1 a été identifiée comme étant une paracaspase qui partage des séquences homologues avec d'autres protéases à cystéine, comme les caspases et les métacaspases. Pour être actives, les caspases ont besoin de dimériser. Etant donné leur similarité de séquence avec MALT1, nous avons supposé que la dimérisation pouvait aussi être un mécanisme d'activation utilisé par MALT1. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons conçu un modèle bioinformatique à partir des structures cristallographiques de plusieurs caspases. Et notre modèle a suggéré que le domaine catalytique de MALT1 était effectivement capable de former des dimères. Cette découverte a été confirmée plus tard par des publications qui montrent des structures cristallographiques dimériques de MALT1. Dans l'interface du dimère de notre modèle, nous avons remarqué la présence d'acides aminés chargés qui pouvaient former des liaisons ioniques et ainsi réunir les deux monomères. La mutation de l'un de ces résidus, E549, pour une alanine, a complètement inhibé l'activité catalytique de MALT1. De plus, nous avons mis en évidence un rôle d'E549 dans la croissance dépendante de MALT1, des cellules dérivées de lymphomes B diffus à grandes cellules (DLBCL) de sous-type cellules B actives (ABC). Dans un premier temps nous avons été surpris de constater que cette mutation révélait seulement un défaut partiel de dimérisation, ce qui indique que des acides aminés supplémentaires sont indispensables pour former un dimère stable. Les structures cristallographiques de MALT1 ont révélé un rôle primordial d'E549 dans la stabilisation du site catalytique de la protéase via son interaction avec une arginine qui se trouve à côté de la cystéine du site actif. Dans une autre étude, nous avons découvert que la monoubiquitination de MALT1 est requise pour l'activité catalytique de la protéase. A remarquer que nous avons trouvé que le mutant E549A de l'interface dimère de MALT1 n'a pas pu être monoubiquitiné. Sur la base de ces résultats, nous suggérons que la formation correcte de l'interface du dimère est une condition préalable pour la monoubiquitination. Dans un second projet, nous avons découvert une nouvelle cible de la protéase MALT1, la ribonucléase Regnase-1. Il a été décrit que l'activité RNase de Regnase-1 régulait négativement les réponses immunitaires. Nous avons pu montrer que dans les lignées cellulaires ABC DLBCL, la Regnase-1 n'était pas seulement clivée par MALT1 mais également phosphorylée, au moins en partie, par la kinase de l'inhibiteur de KB (IKK). Les deux régulations semblent supprimer la fonction RNase de Regnase-1 et permettre ainsi la stabilisation de certains ARN messagers et la production de protéines favorisant la survie. En conclusion, nos études mettent en évidence le rôle-clé de la dimérisation de MALT1 et expliquent l'importance de l'activité catalytique de MALT1 pour l'activation des lymphocytes. Ainsi, nos résultats apportent des connaissances supplémentaires pour le développement de médicaments spécifiques ciblant l'activité catalytique de MALT1, qui pourraient être utiles pour modifier les réponses immunitaires et traiter des lymphomes.