Fungal contamination in two Portuguese wastewater treatment plants

The presence of filamentous fungi was detected in wastewater and air collected at wastewater treatment plants (WWTP) from several European countries. The aim of the present study was to assess fungal contamination in two WWTP operating in Lisbon. In addition, particulate matter (PM) contamination data was analyzed. To apply conventional methods, air samples from the two plants were collected through impaction using an air sampler with a velocity air rate of 140 L/min. Surfaces samples were collected by swabbing the surfaces of the same indoor sites. All collected samples were incubated at 27°C for 5 to 7 d. After lab processing and incubation of collected samples, quantitative and qualitative results were obtained with identification of the isolated fungal species. For molecular methods, air samples of 250 L were also collected using the impinger method at 300 L/min airflow rate. Samples were collected into 10 ml sterile phosphate-buffered saline with 0.05% Triton X-100, and the collection liquid was subsequently used for DNA extraction. Molecular identification of Aspergillus fumigatus and Stachybotrys chartarum was achieved by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) using the Rotor-Gene 6000 qPCR Detection System (Corbett). Assessment of PM was also conducted with portable direct-reading equipment (Lighthouse, model 3016 IAQ). Particles concentration measurement was performed at five different sizes: PM0.5, PM1, PM2.5, PM5, and PM10. Sixteen different fungal species were detected in indoor air in a total of 5400 isolates in both plants. Penicillium sp. was the most frequently isolated fungal genus (58.9%), followed by Aspergillus sp. (21.2%) and Acremonium sp. (8.2%), in the total underground area. In a partially underground plant, Penicillium sp. (39.5%) was also the most frequently isolated, also followed by Aspergillus sp. (38.7%) and Acremonium sp. (9.7%). Using RT-PCR, only A. fumigatus was detected in air samples collected, and only from partial underground plant. Stachybotrys chartarum was not detected in any of the samples analyzed. The distribution of particle sizes showed the same tendency in both plants; however, the partially underground plant presented higher levels of contamination, except for PM2.5. Fungal contamination assessment is crucial to evaluating the potential health risks to exposed workers in these settings. In order to achieve an evaluation of potential health risks to exposed workers, it is essential to combine conventional and molecular methods for fungal detection. Protective measures to minimize worker exposure to fungi need to be adopted since wastewater is the predominant internal fungal source in this setting.

Assessment of fungal contamination in waste sorting and incineration: case study in Portugal

Organic waste is a rich substrate for microbial growth, and because of that, workers from waste industry are at higher risk of exposure to bioaerosols. This study aimed to assess fungal contamination in two plants handling solid waste management. Air samples from the two plants were collected through an impaction method. Surface samples were also collected by swabbing surfaces of the same indoor sites. All collected samples were incubated at 27◦C for 5 to 7 d. After lab processing and incubation of collected samples, quantitative and qualitative results were obtained with identification of the isolated fungal species. Air samples were also subjected to molecular methods by real-time polymerase chain reaction (RT PCR) using an impinger method to measure DNA of Aspergillus flavus complex and Stachybotrys chartarum. Assessment of particulate matter (PM) was also conducted with portable direct-reading equipment. Particles concentration measurement was performed at five different sizes (PM0.5; PM1; PM2.5; PM5; PM10). With respect to the waste sorting plant, three species more frequently isolated in air and surfaces were A. niger (73.9%; 66.1%), A. fumigatus (16%; 13.8%), and A. flavus (8.7%; 14.2%). In the incineration plant, the most prevalent species detected in air samples were Penicillium sp. (62.9%), A. fumigatus (18%), and A. flavus (6%), while the most frequently isolated in surface samples were Penicillium sp. (57.5%), A. fumigatus (22.3%) and A. niger (12.8%). Stachybotrys chartarum and other toxinogenic strains from A. flavus complex were not detected. The most common PM sizes obtained were the PM10 and PM5 (inhalable fraction). Since waste is the main internal fungal source in the analyzed settings, preventive and protective measures need to be maintained to avoid worker exposure to fungi and their metabolites.

Fungal contamination assessment in Portuguese elderly care centers

Individuals spend 80-90% of their day indoors and elderly subjects are likely to spend even a greater amount of time indoors. Thus, indoor air pollutants such as bioaerosols may exert a significant impact on this age group. The aim of this study was to characterize fungal contamination within Portuguese elderly care centers. Fungi were measured using conventional as well as molecular methods in bedrooms, living rooms, canteens, storage areas, and outdoors. Bioaerosols were evaluated before and after the microenvironments' occupancy in order to understand the role played by occupancy in fungal contamination. Fungal load results varied from 32 colony-forming units CFU m(-3) in bedrooms to 228 CFU m(-3) in storage areas. Penicillium sp. was the most frequently isolated (38.1%), followed by Aspergillus sp. (16.3%) and Chrysonilia sp. (4.2%). With respect to Aspergillus genus, three different fungal species in indoor air were detected, with A. candidus (62.5%) the most prevalent. On surfaces, 40 different fungal species were isolated and the most frequent was Penicillium sp. (22.2%), followed by Aspergillus sp. (17.3%). Real-time polymerase chain reaction did not detect the presence of A. fumigatus complex. Species from Penicillium and Aspergillus genera were the most abundant in air and surfaces. The species A. fumigatus was present in 12.5% of all indoor microenvironments assessed. The living room was the indoor microenvironment with lowest fungal concentration and the storage area was highest.

Aspergillus flavus contamination in two Portuguese wastewater treatment plants

Filamentous fungi from genus Aspergillus were previously detected in wastewater treatment plants (WWTP) as being Aspergillus flavus (A. flavus), an important toxigenic fungus producing aflatoxins. This study aimed to determine occupational exposure adverse effects due to fungal contamination produced by A. flavus complex in two Portuguese WWTP using conventional and molecular methodologies. Air samples from two WWTP were collected at 1 m height through impaction method. Surface samples were collected by swabbing surfaces of the same indoor sites. After counting A. flavus and identification, detection of aflatoxin production was ensured through inoculation of seven inoculates in coconut-milk agar. Plates were examined under long-wave ultraviolet (UV; 365 nm) illumination to search for the presence of fluorescence in the growing colonies. To apply molecular methods, air samples were also collected using the impinger method. Samples were collected and collection liquid was subsequently used for DNA extraction. Molecular identification of A. flavus was achieved by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) using the Rotor-Gene 6000 qPCR detection system (Corbett). Among the Aspergillus genus, the species that were more abundant in air samples from both WWTP were Aspergillus versicolor (38%), Aspergillus candidus (29.1%), and Aspergillus sydowii (12.7%). However, the most commonly species found on surfaces were A. flavus (47.3%), Aspergillus fumigatus (34.4%), and Aspergillus sydowii (10.8%). Aspergillus flavus isolates that were inoculated in coconut agar medium were not identified as toxigenic strains and were not detected by RT-PCR in any of the analyzed samples from both plants. Data in this study indicate the need for monitoring fungal contamination in this setting. Although toxigenic strains were not detected from A. flavus complex, one cannot disregard the eventual presence and potential toxicity of aflatoxins.

Noble metal nanoparticles - Au and Ag - for biodetection

Dissertation submitted for obtainment of the Master’s Degree in Biotechnology, by the Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em áreas endémicas

RESUMO A Leptospirose é uma zoonose re-emergente causada por espiroquetídeos patogénicos do género Leptospira. Em Portugal, é reconhecida, desde 1931, como uma importante doença infecciosa humana, cuja notificação é obrigatória desde 1986 para todos os serovares. Porém, devido ao acentuado polimorfismo clínico e à dificuldade de um diagnóstico laboratorial especializado, esta patologia nem sempre é confirmada. Com efeito, o isolamento do agente é difícil e o método convencional de diagnóstico, baseado no teste serológico de referência TAM (Teste de Aglutinação Microscópica), não é muito sensível na primeira semana da doença. Assim, foram três os principais objectivos desta dissertação: actualizar o padrão epidemiológico da Leptospirose, após uma extensa revisão bibliográfica da doença (Capítulos 1 e 2); esclarecer os aspectos imunológicos relacionados com os marcadores antigénicos que mais influenciam a regulação da resposta humoral na infecção humana, em particular, em área endémica (Capítulo 3); e, por último, promover a identificação molecular de alguns isolados de Leptospira, avaliar o respectivo poder patogénico no modelo murino e contribuir para o diagnóstico precoce da doença humana (Capítulo 4). O primeiro dos temas investigados, com base no estudo retrospectivo de uma larga série de 4.618 doentes sintomáticos analisados representa uma caracterização única da epidemiologia da Leptospirose, em particular, na Região Centro do País, e nas ilhas de São Miguel e Terceira (Açores), nos últimos 18 e 12 anos, respectivamente. Foram confirmados 1.024 (22%) casos, com uma distribuição média de 57 casos/ano, sendo a maior frequência no sexo masculino (67%). As áreas analisadas corresponderam à maioria das notificações em Portugal, com uma taxa de incidência média anual nas ilhas muito superior à registada no continente (11,1 vs 1,7/100.000 habitantes, respectivamente). Os adultos em idade activa (25-54 anos) foram os mais afectados, nos meses de Dezembro e Janeiro. A doença foi causada por serovares de nove serogrupos presuntivos de Leptospira interrogans sensu lato, com predomínio de Icterohaemorrhagiae, Pomona e Ballum, em cerca de 66% dos casos. A seropositividade da Leptospirose esteve associada às formas anictérica e ictérica da doença, sendo evidente uma elevada sub-notificação ( 20 casos/ano). Foram detectados e analisados os diversos factores de risco, verificando-se um risco elevado de transmissão em áreas geográficas onde a circulação dos agentes zoonóticos se processa em ciclos silváticos e/ou domésticos bem estabelecidos. Este estudo confirma que a incidência da Leptospirose em Portugal tem aumentado nos últimos anos, particularmente, nos Açores, onde a seropositividade elevada e a ocorrência de casos fatais confirmam esta patologia como um problema emergente de Saúde Pública. No âmbito do Capítulo 3, investigaram-se os aspectos imunológicos da Leptospirose humana na Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em áreas endémicas Região Centro e nas ilhas de São Miguel e Terceira, caracterizando as proteínas e os lipopolissacáridos (LPS) envolvidos durante as fases aguda (estádio único) e tardia da doença (três estádios), através do follow-up serológico de 240 doentes com confirmação clínica e laboratorial de Leptospirose. Foram incluídos no estudo 463 soros, 320 (69%) dos quais, obtidos durante a fase de convalescença (até 6 anos após o início dos sintomas). Soros de dadores de sangue (n=200) e de doentes com outras patologias infecciosas (n=60) foram usados como controlos. As amostras foram testadas pela técnica de Western Blot com lisados de oito estirpes patogénicas pertencentes aos serogrupos mais prevalentes. O reconhecimento dos antigénios leptospíricos, nos quatro estádios evolutivos, resultou da detecção de reactividade específica anti-IgM e anti IgG, nos diferentes immunoblots. Detectaram-se cinco proteínas major (45, 35, 32, 25 e 22 kDa) comuns a todos os serovares. Os soros estudados com as estirpes dos serogrupos homólogos, previamente identificados pela TAM, reagiram contra as proteínas de 45, 32 e 22 kDa, conhecidas como LipL45, LipL32 e LpL21, respectivamente, sendo estes, os antigénios imunodominantes durante o período estudado, nas duas regiões geográficas. Os doentes açorianos mostraram, ainda, uma reactividade elevada contra os LPS, cujo significado é discutido face aos resultados negativos dos soros controlo para os marcadores referidos. Esta investigação indica, pela primeira vez, uma forte persistência da resposta humoral e o importante papel protector da LipL45, Lip32 e LipL21, anos após o início dos sintomas. Por último, procedeu-se à identificação de estirpes Portuguesas, isoladas de murinos e de um caso humano fatal (L. inadai), numa perspectiva polifásica de intervenção. Utilizaram-se três testes fenotípicos (testes de crescimento sob diferentes temperaturas e na presença de 8-azaguanina, a par de um teste de alteração morfológica induzida pela adição de NaCl 1M). Paralelamente, efectuaram-se ensaios de amplificação do gene rrs (16S ARNr) de Leptospira spp por PCR (Polymerase Chain Reaction), utilizando um par de primers “universais” (331 pb) e um segundo par, que apenas amplifica o gene secY (285 pb) de estirpes patogénicas, para definição da identidade dos isolados em estudo. Da integração dos resultados obtidos, confirmou-se que estes ocupam uma posição taxonómica “intermédia” entre as leptospiras saprófitas e as patogénicas. Desenvolveu-se, ainda, uma investigação (complementar) “in vivo” do carácter taxonómico “intermédio” do referido isolado humano, por cultura e amplificação do respectivo ADN de tecidos de hamsters inoculados para o efeito. Esta metodologia molecular foi posteriormente utilizada, com sucesso, no diagnóstico precoce de doentes com Leptospirose, sendo uma mais-valia na confirmação laboratorial de infecção por Leptospira, na ausência de anticorpos específicos na fase inicial da doença.

Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em Áreas Endémicas

RESUMO A Leptospirose é uma zoonose re-emergente causada por espiroquetídeos patogénicos do género Leptospira. Em Portugal, é reconhecida, desde 1931, como uma importante doença infecciosa humana, cuja notificação é obrigatória desde 1986 para todos os serovares. Porém, devido ao acentuado polimorfismo clínico e à dificuldade de um diagnóstico laboratorial especializado, esta patologia nem sempre é confirmada. Com efeito, o isolamento do agente é difícil e o método convencional de diagnóstico, baseado no teste serológico de referência TAM (Teste de Aglutinação Microscópica), não é muito sensível na primeira semana da doença. Assim, foram três os principais objectivos desta dissertação: actualizar o padrão epidemiológico da Leptospirose, após uma extensa revisão bibliográfica da doença (Capítulos 1 e 2); esclarecer os aspectos imunológicos relacionados com os marcadores antigénicos que mais influenciam a regulação da resposta humoral na infecção humana, em particular, em área endémica (Capítulo 3); e, por último, promover a identificação molecular de alguns isolados de Leptospira, avaliar o respectivo poder patogénico no modelo murino e contribuir para o diagnóstico precoce da doença humana (Capítulo 4). O primeiro dos temas investigados, com base no estudo retrospectivo de uma larga série de 4.618 doentes sintomáticos analisados representa uma caracterização única da epidemiologia da Leptospirose, em particular, na Região Centro do País, e nas ilhas de São Miguel e Terceira (Açores), nos últimos 18 e 12 anos, respectivamente. Foram confirmados 1.024 (22%) casos, com uma distribuição média de 57 casos/ano, sendo a maior frequência no sexo masculino (67%). As áreas analisadas corresponderam à maioria das notificações em Portugal, com uma taxa de incidência média anual nas ilhas muito superior à registada no continente (11,1 vs 1,7/100.000 habitantes, respectivamente). Os adultos em idade activa (25-54 anos) foram os mais afectados, nos meses de Dezembro e Janeiro. A doença foi causada por serovares de nove serogrupos presuntivos de Leptospira interrogans sensu lato, com predomínio de Icterohaemorrhagiae, Pomona e Ballum, em cerca de 66% dos casos. A seropositividade da Leptospirose esteve associada às formas anictérica e ictérica da doença, sendo evidente uma elevada sub-notificação ( 20 casos/ano). Foram detectados e analisados os diversos factores de risco, verificando-se um risco elevado de transmissão em áreas geográficas onde a circulação dos agentes zoonóticos se processa em ciclos silváticos e/ou domésticos bem estabelecidos. Este estudo confirma que a incidência da Leptospirose em Portugal tem aumentado nos últimos anos, particularmente, nos Açores, onde a seropositividade elevada e a ocorrência de casos fatais confirmam esta patologia como um problema emergente de Saúde Pública. No âmbito do Capítulo 3, investigaram-se os aspectos imunológicos da Leptospirose humana na Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em áreas endémicas Região Centro e nas ilhas de São Miguel e Terceira, caracterizando as proteínas e os lipopolissacáridos (LPS) envolvidos durante as fases aguda (estádio único) e tardia da doença (três estádios), através do follow-up serológico de 240 doentes com confirmação clínica e laboratorial de Leptospirose. Foram incluídos no estudo 463 soros, 320 (69%) dos quais, obtidos durante a fase de convalescença (até 6 anos após o início dos sintomas). Soros de dadores de sangue (n=200) e de doentes com outras patologias infecciosas (n=60) foram usados como controlos. As amostras foram testadas pela técnica de Western Blot com lisados de oito estirpes patogénicas pertencentes aos serogrupos mais prevalentes. O reconhecimento dos antigénios leptospíricos, nos quatro estádios evolutivos, resultou da detecção de reactividade específica anti-IgM e anti IgG, nos diferentes immunoblots. Detectaram-se cinco proteínas major (45, 35, 32, 25 e 22 kDa) comuns a todos os serovares. Os soros estudados com as estirpes dos serogrupos homólogos, previamente identificados pela TAM, reagiram contra as proteínas de 45, 32 e 22 kDa, conhecidas como LipL45, LipL32 e LpL21, respectivamente, sendo estes, os antigénios imunodominantes durante o período estudado, nas duas regiões geográficas. Os doentes açorianos mostraram, ainda, uma reactividade elevada contra os LPS, cujo significado é discutido face aos resultados negativos dos soros controlo para os marcadores referidos. Esta investigação indica, pela primeira vez, uma forte persistência da resposta humoral e o importante papel protector da LipL45, Lip32 e LipL21, anos após o início dos sintomas. Por último, procedeu-se à identificação de estirpes Portuguesas, isoladas de murinos e de um caso humano fatal (L. inadai), numa perspectiva polifásica de intervenção. Utilizaram-se três testes fenotípicos (testes de crescimento sob diferentes temperaturas e na presença de 8-azaguanina, a par de um teste de alteração morfológica induzida pela adição de NaCl 1M). Paralelamente, efectuaram-se ensaios de amplificação do gene rrs (16S ARNr) de Leptospira spp por PCR (Polymerase Chain Reaction), utilizando um par de primers “universais” (331 pb) e um segundo par, que apenas amplifica o gene secY (285 pb) de estirpes patogénicas, para definição da identidade dos isolados em estudo. Da integração dos resultados obtidos, confirmou-se que estes ocupam uma posição taxonómica “intermédia” entre as leptospiras saprófitas e as patogénicas. Desenvolveu-se, ainda, uma investigação (complementar) “in vivo” do carácter taxonómico “intermédio” do referido isolado humano, por cultura e amplificação do respectivo ADN de tecidos de hamsters inoculados para o efeito. Esta metodologia molecular foi posteriormente utilizada, com sucesso, no diagnóstico precoce de doentes com Leptospirose, sendo uma mais-valia na confirmação laboratorial de infecção por Leptospira, na ausência de anticorpos específicos na fase inicial da doença.

Evolution of Drug Resistance: Insight on TEM -Lactamases Structure and Activity and Beta-Lactam Antibiotics

Extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) prevalence was studied in the north of Portugal, among 193 clinical isolates belonging to citizens in a district in the boundaries between this country and Spain from a total of 7529 clinical strains. In the present study we recovered some members of Enterobacteriaceae family, producing ESBL enzymes, including Escherichia coli (67.9%), Klebsiella pneumoniae (30.6%), Klebsiella oxytoca (0.5%), Enterobacter aerogenes (0.5%), and Citrobacter freundii (0.5%). β-lactamases genes blaTEM, blaSHV, and blaCTX-M were screened by polymerase chain reaction (PCR) and sequencing approaches. TEM enzymes were among the most prevalent types (40.9%) followed by CTX-M (37.3%) and SHV (23.3%). Among our sample of 193 ESBL-producing strains 99.0% were resistant to the fourth-generation cephalosporin cefepime. Of the 193 isolates 81.3% presented transferable plasmids harboring genes. Clonal studies were performed by PCR for the enterobacterial repetitive intragenic consensus (ERIC) sequences. This study reports a high diversity of genetic patterns. Ten clusters were found for E. coli isolates and five clusters for K. pneumoniae strains by means of ERIC analysis. In conclusion, in this country, the most prevalent type is still the TEM-type, but CTX-M is growing rapidly.