油菜内源和外源蛋白的表达及环境因素的影响

植物与昆虫的互作关系是个长期进化的过程，虫害给农业生产带来巨大损失。本研究以甘蓝型油菜（Brassica napus）为例，研究了不同环境条件和遗传背景下外源基因的表达与效用，同时利用蛋白质组技术，研究了虫害损伤模拟条件下植物可能存在的内源抗性机制。甘蓝型油菜中转入了人工合成的Bt（Bacillus thuringiensis）杀虫基因，能使植物产生抗虫蛋白抵御虫害。我们在湖北湖南两个实验点进行了大田实验，按植株生长发育的4个不同时期从转基因植株的叶片上采样，研究抗虫蛋白在植物体内的表达动态。植株顶部第三片展开叶的Bt毒蛋白浓度在结荚期前随植物生长而不断增加，而在结荚期出现或增或减的现象。采样叶片的可溶性总蛋白浓度含量一直呈增加的趋势，直到结荚以后出现含量的明显降低。同时，收集了转基因油菜与湘油15号在田间自然杂交形成的杂交后代种子用于栽培，用GFP仪检测杂交后代的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein），并用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）检测并确认带有转基因的杂交植株。为了检测带有转基因的杂交后代油菜中Bt毒蛋白的杀虫效率，用对Bt毒蛋白敏感的试虫品系——初孵棉铃虫幼虫（Helicoverpa armigera）进行杀虫活性检测实验。结果表明，携带Bt基因的杂交湘油及其转基因亲本对试虫的体重增长量均产生了负面影响，可以推断在调查取样的植株生长发育阶段，转基因杂交后代与其转基因亲本植株的杀虫效率没有显著差异。转基因植物及其杂交后代中抗虫蛋白的持续表达及田间带有转基因的自播植物的出现会使害虫产生耐受抗性的潜在可能性增加。 相对于人为增加的抗虫基因，植物在长期对抗昆虫的过程中也进化形成了自我防御机制，能够产生特异的抗性蛋白来应对昆虫的取食。本研究用机械损伤模拟害虫取食，对比了油菜受到物理损伤前后可溶性总蛋白的含量变化并试图通过蛋白质组学技术来检测可能发生变化的蛋白质。Bradford定量测定发现，同一植株同一叶片损伤前后可溶性总蛋白含量差异显著，损伤后蛋白表达量显著增高。蛋白质组双向凝胶电泳及其差异分析显示，损伤前后有8个蛋白质点发生明显的上调或下调。选择其中2个差异蛋白点经过MALDI-TOF质谱鉴定，它们分别是Rubisco小亚基前体以及果糖－1，6－二磷酸醛缩酶和粪卟啉－3－氧化酶的混合物，这些蛋白质在其他植物的抗逆研究中也有报道，它们可能在油菜叶片应答机械损伤过程中对维持植物的生理功能也有重要作用。