Chemical chaperones regulate molecular chaperones in vitro and in cells under combined salt and heat stresses.

Salt and heat stresses, which are often combined in nature, induce complementing defense mechanisms. Organisms adapt to high external salinity by accumulating small organic compounds known as osmolytes, which equilibrate cellular osmotic pressure. Osmolytes can also act as "chemical chaperones" by increasing the stability of native proteins and assisting refolding of unfolded polypeptides. Adaptation to heat stress depends on the expression of heat-shock proteins, many of which are molecular chaperones, that prevent protein aggregation, disassemble protein aggregates, and assist protein refolding. We show here that Escherichia coli cells preadapted to high salinity contain increased levels of glycine betaine that prevent protein aggregation under thermal stress. After heat shock, the aggregated proteins, which escaped protection, were disaggregated in salt-adapted cells as efficiently as in low salt. Here we address the effects of four common osmolytes on chaperone activity in vitro. Systematic dose responses of glycine betaine, glycerol, proline, and trehalose revealed a regulatory effect on the folding activities of individual and combinations of chaperones GroEL, DnaK, and ClpB. With the exception of trehalose, low physiological concentrations of proline, glycerol, and especially glycine betaine activated the molecular chaperones, likely by assisting local folding in chaperone-bound polypeptides and stabilizing the native end product of the reaction. High osmolyte concentrations, especially trehalose, strongly inhibited DnaK-dependent chaperone networks, such as DnaK+GroEL and DnaK+ClpB, likely because high viscosity affects dynamic interactions between chaperones and folding substrates and stabilizes protein aggregates. Thus, during combined salt and heat stresses, cells can specifically control protein stability and chaperone-mediated disaggregation and refolding by modulating the intracellular levels of different osmolytes.

Multiplicação in vitro do porta-enxerto de macieira cv. Marubakaido: efeito da orientação do explante no meio de cultura

Objetivou-se avaliar o efeito da orientação do explante, vertical ou horizontal, no meio de cultura, na multiplicação in vitro, do porta-enxerto de macieira cv. Marubakaido. O meio de cultura utilizado foi o MS com N (nitrogênio) reduzido a ¾ da concentração original, 100mg.L-1 de mio-inositol, 40g.L-1 de sacarose e 6g.L-1 de ágar, suplementado com 4,44mM de BAP (6-benzilaminopurina) e 0,2ml.L-1 de PPM TM ("Plant Preservative Mixture"). Segmentos caulinares com duas gemas e o ápice excisado foram utilizados como explantes. Após a inoculação, os frascos com os explantes foram incubados a 16 horas de fotoperíodo, à temperatura de 25±2ºC, com radiação de 25µmoles.m-2.s-1. O número de brotações, o número de gemas por explante, a taxa de multiplicação e a altura da brotação maior foram avaliados aos quarenta dias de cultivo. O maior número de brotações, o maior número de gemas e a maior taxa de multiplicação foram obtidos com o explante na orientação horizontal no meio de cultura. Não houve diferença significativa quanto à orientação vertical e horizontal do explante no meio de cultura para a altura da brotação maior.

Correlação entre a capacidade proliferativa in vitro e a dominância apical in vivo da bananeira cvs. Grand naine e Nanicão

No presente trabalho, buscou-se correlacionar diferentes graus de dominância apical in vivo com a capacidade proliferativa in vitro da bananeira, através da relação existente entre a fonte de explante e o seu posterior comportamento in vitro. Brotos laterais de Musa acuminata Colla: Nanicão (AAA) e Grand Naine (AAA), oriundos de plantas-matrizes mostrando diferentes graus de dominância apical in vivo (elevada, média e baixa) foram cultivados in vitro, no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da EEI/ EPAGRI-SC, por cinco subcultivos, em intervalos de 30 dias, em meio MS suplementado com BAP (11,1 mmol/l), sacarose (30 g/l), ágar (7 g/l), vitaminas MS e pH 5,8. O grau de dominância apical in vivo influenciou diretamente o comportamento in vitro dos explantes, no que diz respeito à capacidade proliferativa. Brotos laterais oriundos de plantas-matrizes, com grau de dominância apical in vivo baixa, proporcionaram a maior taxa média proliferativa (7,5 brotos/explante) para a cv. Grand Naine, enquanto brotos laterais oriundos de plantas-matrizes com grau de dominância apical média proporcionaram a maior taxa média proliferativa (10,96 brotos/explante) para a cv. Nanicão.

Explantes de cupuaçuzeiro submetidos a diferentes condições de cultura in vitro

Este trabalho objetivou avaliar as respostas morfogenéticas de diferentes explantes de cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum Schum.) submetidos a várias condições de cultura in vitro. A utilização de 2,4-D nas concentrações de 4,52; 6,78 e 9,05 µM promoveu a formação de calos friáveis em eixos embrionários e o TDZ nas concentrações de 2,0 e 3,0 µM induziu uma alta frequência de calos friáveis e menor oxidação em segmentos de folhas jovens. O 2,4-D combinado com KIN, promoveu a iniciação de calos friáveis e o ANA combinado com KIN, a rizogênese em segmentos cotiledonares. Na presença de 2,26 µM de 2,4-D e 13,94 µM de KIN, houve a formação de calos friáveis em segmentos caulinares. A adição de água de coco, 2iP e ANA estimulou o rápido crescimento e a progressão de culturas de calo em eixo embrionário, segmentos caulinares e segmentos de folhas jovens clorofiladas.

Multiplicação in vitro de porta-enxertos do gênero Prunus sob baixas concentrações e diferentes tipos de auxinas

Experimentos testando o tipo de auxina (AIB, AIA e ANA) e concentração (0; 0,01; 0,1 e 1,0 mM) foram realizados para cada um dos quatro porta-enxertos utilizados (G x N22, Mr.S 2/5, Marianna e Mirabolano). Cada porta-enxerto constituiu-se num experimento, uma vez que, apesar de ser o mesmo meio básico, MS ¾, com exceção de Marianna, onde o meio foi o MS, as concentrações da citocinina BAP foram diferentes. A cada meio, foram adicionados os tipos e as concentrações das auxinas a serem testadas. Os porta-enxertos apresentaram comportamentos distintos quanto ao tipo e concentração das auxinas. O AIB e o AIA foram superiores ao ANA nas variáveis analisadas. Na fase de multiplicação, o 'Mirabolano' não respondeu a concentrações de auxinas de até 1,0 mM. O 'G x N22' apresentou as melhores respostas na concentração de 0,01 miM de AIB ou AIA. O porta-enxerto Marianna respondeu positivamente a concentrações de auxinas entre 0,01 e 1,0 miM. O ANA não proporciona bons resultados na multiplicação in vitro de porta-enxertos do gênero Prunus, sendo muitas vezes superado pela testemunha.

Efeito de auxinas e condições de cultivo no enraizamento in vitro de porta-enxertos de macieira 'M-9'

A utilização de mudas com características desejáveis, tanto genéticas quanto sanitárias, é um fator importante para o sucesso na produção de mudas. A micropropagação, em comparação às formas tradicionais de propagação vegetativa, possibilita aumentar a produção e a qualidade das mudas. Nesta técnica, a rizogênese é uma etapa crucial para o desenvolvimento das plantas propagadas in vitro. Neste contexto, objetivou-se testar condições de cultivo, tipos e concentrações de auxinas para o enraizamento in vitro do porta-enxerto de macieira M-9. Como explantes, foram utilizadas brotações (1cm), as quais foram cultivadas em meio MS/2. As auxinas utilizadas foram AIA, ANA e AIB, nas concentrações de 0,0; 0,5; 1,0; 5,0; 10; 20; 50 e 100miM. Foram testadas duas condições de incubação: na primeira, os frascos foram mantidos sob luz (30 dias) e, na segunda, os frascos foram mantidos por cinco dias no escuro com posterior transferência para luz (25 dias). Em ambas as condições, os explantes foram expostos a tratamentos com auxina, durante todo o tempo ou apenas por dez dias, com posterior transferência para meio sem auxina. As variáveis analisadas foram: porcentagem de enraizamento, número e comprimento de raiz, tipo de raiz e porcentagem de sobrevivência de plantas na fase de aclimatização. O AIA induziu maior porcentagem de enraizamento, plantas com melhor sistema radicular e parte aérea nas concentrações mais altas; porém, quando foi utilizado AIB e ANA, essas características foram observadas nas concentrações mais baixas. Os tratamentos em que os explantes foram cultivados por apenas dez dias, em meios com auxinas, apresentaram, em geral, melhores respostas. Observou-se maior porcentagem de plantas aclimatizadas nos tratamentos com AIA.

In vitro culture of Spondias mombin L. nodal segments

Spondias mombin L. shoot cultures were initiated from nodal explants taken from plants propagated by seeds. Explants coming from 4-6 months old plants, previously disinfected, were cultivated on WPM medium supplemented with a wide range of concentrations of BAP (0.0, 0.22, 0.44, 2.22 and 4.44 muM) and NAA (0.0, 0.27 and 2.70 muM). After four weeks, the responses obtained were axillary shoot and root formation. The first response were preferentially induced with the medium containing only BAP, regardless of the BAP concentration. The addition of NAA on medium reduced significantly axillary shoot formation and induced rhizogenesis. Roots were formed on nodal explant basis, preferentially on medium supplemented with 4.44 muM NAA. The medium supplemented with BAP reduced significantly root formation.

Concentrações de ácido indolbutírico e períodos de escuro, no enraizamento "in vitro" de amoreira-preta (Rubus sp.), cv. ébano

O trabalho foi realizado com o objetivo de testar a influência do AIB em condições de escuro, no enraizamento in vitro de amoreira-preta cv. Ébano. Utilizaram-se explantes provenientes da propagação in vitro, os quais foram submetidos a duas concentrações de ácido indolbutírico (AIB) (0,5 e 1,0 mM) e três períodos de escuro (2; 4 e 6 dias). Os explantes foram cultivados em meio contendo sais e vitaminas de MS (Murashige & Skoog, 1962) com os sais minerais reduzidos à metade, acrescidos de mio-inositol (100 mg.L-1), sacarose (30 g.L-1), ágar (7g.L-1) e o pH ajustado para 5,9. Os frascos contendo os explantes, após o tratamento de escuro, foram incubados em sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas, densidade de fluxo luminoso de 31,41W.m-2 e temperatura de 25±3ºC, por 30 dias. Avaliaram-se a porcentagem de enraizamento, número e comprimento de raízes, e formação de calo na base das brotações. Após os explantes serem aclimatizados, avaliou-se a taxa de sobrevivência. Não houve diferenças significativas entre as porcentagens de enraizamento dos diferentes tratamentos. O número de raízes foi maior em meios sem ácido indolbutírico (5,5 raízes/ explante). As raízes mais longas foram observadas em meios sem ácido indolbutírico e quando submetidas 2-4 dias no escuro. Ocorreu maior intensidade de formação de calo quando adicionado ácido indolbutírico ao meio de cultura. Verificou-se alta porcentagem de sobrevivência das brotações na fase de aclimatização (86 - 97%).

Thymus-independent generation of NK1+ T cells in vitro from fetal liver precursors.

NK1.1+TCR alpha beta+ (NK1+) T cells are an unusual subset of mouse TCR alpha beta+ cells found primarily in adult thymus and liver. In contrast to conventional TCR alpha beta+ cells, NK1+ T cells have a TCR repertoire that is highly skewed to V alpha14 and to Vbeta8, -7, and -2. The developmental origin and ligand specificity of NK1+ T cells are controversial. We show here that NK1+ T cells with a typically biased V alpha and V beta repertoire develop in cytokine-supplemented suspension cultures of fetal liver established from either normal or athymic mice. Furthermore, NK1+ T cell development in fetal liver cultures is abrogated in beta2m-deficient mice (which lack MHC class I and other related molecules) and can be partially inhibited by the presence of anti-CD1 mAbs. Moreover, mixing experiments indicate that recombination-deficient SCID fetal liver cells can reconstitute NK1+ T cell development in beta2m-deficient fetal liver cultures. Collectively, our data demonstrate that NK1+ T cells can develop extrathymically from fetal liver precursors and that a beta2m-associated ligand (putatively CD1) present on nonlymphoid cells is essential for their positive selection and/or expansion.

Estabelecimento e multiplicação in vitro de Prunus sp. em diferentes meios de cultivo

O trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar diferentes meios de cultivo no estabelecimento e multiplicação in vitro de espécies do gênero Prunus. Os segmentos nodais de 1,0 cm foram mantidos sob luz fluorescente com radiação de 20 mE.m-2.s-1, fotoperíodo de 16 horas e temperatura de 25±2ºC. No estabelecimento, testaram os meios MS, MS ¾, SH e Villegas, e na multiplicação: SH e MS ¾. O meio MS ¾ foi testado em diferentes concentrações de ágar (4,5; 5,5; 6,5 g.L-1). Avaliaram-se as percentagens de estabelecimento dos explantes, contaminação, oxidação e segmentos não brotados. O meio Villegas apresentou menor oxidação durante o período de estabelecimento in vitro. Com o meio MS ¾, verificou-se maior percentagem de estabelecimento dos explantes. Na fase de multiplicação, avaliaram-se a percentagem de crescimento, a taxa de multiplicação e o número de brotações. O meio MS ¾, com 5,5 g.L-1 de ágar, apresentou os melhores resultados.

Dopamine affects parvalbumin expression during cortical development in vitro.

This study was undertaken to determine how dopamine influences cortical development. It focused on morphogenesis of GABAergic neurons that contained the calcium-binding protein parvalbumin (PV). Organotypic slices of frontoparietal cortex were taken from neonatal rats, cultured with or without dopamine, harvested daily (4-30 d), and immunostained for parvalbumin. Expression of parvalbumin occurred in the same regional and laminar sequence as in vivo. Expression in cingulate and entorhinal preceded that in lateral frontoparietal cortices. Laminar expression progressed from layer V to VI and finally II-IV. Somal labeling preceded fiber labeling by 2 d. Dopamine accelerated PV expression. In treated slices, a dense band of PV-immunoreactive neurons appeared in layer V at 7 d in vitro (DIV), and in all layers of frontoparietal cortex at 14 DIV, whereas in control slices such labeling did not appear until 14 and 21 DIV, respectively. The laminar distribution and dendritic branching of PV-immunoreactive neurons were quantified. More labeled neurons were in the superficial layers, and their dendritic arborizations were significantly increased by dopamine. Treatment with a D1 receptor agonist had little effect, whereas a D2 agonist mimicked dopamine's effects. Likewise, the D2 but not the D1 antagonist blocked dopamine-induced changes, indicating that they were mediated primarily by D2 receptors. Parvalbumin expression was accelerated by dopaminergic reinnervation of cortical slices that were cocultured with mesencephalic slices. Coapplication of the glutamate NMDA receptor antagonist MK801 or AP5 blocked dopamine-induced increases in dendritic branching, suggesting that changes were mediated partly by interaction with glutamate to alter cortical excitability.

Inborn resistance of mice to myxoviruses: macrophages express phenotype in vitro.

A strain of avian influenza A virus was adapted to grow in mouse peritoneal macrophages in vitro. The adapted strain, called M-TUR, induced a marked cytopathic effect in macrophages from susceptible mice. Mice homozygous (A2G) or heterozygous (F1 hybrids between A2G and several susceptible strains) for the gene Mx, shown previously to induce a high level of resistance towards lethal challenge by a number of myxoviruses in vivo, yielded peritoneal macrophages which were not affected by M-TUR. Peritoneal macrophages could be classified as resistant or susceptible to M-TUR without sacrificing the cell donor. Backcrosses were arranged between (A2G X A/J)F1 and A/J mice. 64 backcross animals could be tested individually both for resistance of their macrophages in vitro after challenge with M-TUR, and for resistance of the whole animal in vivo after challenge with NWS (a neurotropic variant of human influenza A virus). Macrophages from 36 backcross mice were classified as susceptible, and all of these mice died after challenge. Macrophages from 28 mice were classified as resistant, and 26 mice survived challenge. We conclude that resistance of macrophages and resistance of the whole animal are two facets of the same phenomenon.

Enraizamento in vitro de porta-enxertos de Prunus

Na micropropagação de Prunus sp., o enraizamento tem sido considerado uma fase crítica, pois determina a sobrevivência das plantas durante a aclimatização. Dentre os fatores importantes ao enraizamento in vitro, destacam-se o genótipo e as auxinas por serem determinantes na indução e na formação de raízes. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de IBA no enraizamento in vitro dos porta-enxertos de espécies do gênero Prunus: cultivares Capdeboscq e GF677, e seleções VP411 e VP417. Para o enraizamento in vitro, brotos com 2-3cm de comprimento foram introduzidos em meio de Lepoivre suplementado com 0,1; 0,5; 1,0 e 2,0 mg.L-1 IBA. Observou-se que o porta-enxerto 'Capdeboscq' apresentou maior taxa de enraizamento e maior número de raízes in vitro, sendo superior aos demais genótipos quanto a estas características. O nível de 1,0 mg.L-1 de IBA esteve associado à maior taxa média de enraizamento (100%, 64% e 64,0%, respectivamente) para os porta-enxertos 'Capdeboscq', 'GF677' e VP411. O nível de 2,0 mg.L-1 de IBA foi superior para a seleção VP417 com taxa de 64% de enraizamento. Para os porta-enxertos 'Capdeboscq' e 'GF677', o número máximo de raízes foi de 9,6 e 5,2 raízes por broto, respectivamente, em resposta ao nível de 2,0 mg.L-1 de IBA, enquanto as seleções VP411 e VP417 apresentaram o maior número de raízes (3,6 e 3,9, respectivamente) em resposta ao nível de 1,0 mg.L-1 de IBA.

Estabelecimento e multiplicação in vitro de porta-enxertos de Prunus

A qualidade genética e sanitária das mudas é de fundamental importância para o sucesso da fruticultura moderna. Para o pessegueiro, a micropropagação vem permitindo a produção clonal massal de plantas, com matrizes e mudas de qualidade genética-sanitária comprovada. O presente trabalho objetivou avaliar a taxa de sobrevivência de explantes no estabelecimento in vitro, bem como avaliar o potencial de multiplicação in vitro de porta-enxertos de Prunus. Explantes constituídos por ápices caulinares e gemas laterais dos porta-enxertos Capdeboscq e GF677 e da seleção VP411 foram estabelecidos e multiplicados in vitro em meio de cultura de Lepoivre suplementado com BAP (0,5 mg.L-1). A taxa média de sobrevivência para os porta-enxertos foi 62,9% para ápices caulinares e 58,8% para gemas laterais. Ápices caulinares e gemas laterais apresentaram 14,8% e 29,8% de contaminação, respectivamente. O genótipo afetou significativamente as taxas de multiplicação in vitro. Quanto ao número de brotos por explantes, o porta-enxerto Capdeboscq e a seleção VP411 foram superiores ao porta-enxerto GF677, resultando em 14,7; 16,0 e 10,5 brotos, respectivamente. Para a altura média dos brotos, os porta-enxertos Capdeboscq e GF677 foram superiores à seleção VP411 com 9,3; 8,9 e 7,8 mm, respectivamente. O porta-enxerto Capdeboscq foi superior ao porta-enxerto GF677 e à seleção VP411 na variável número de brotos >20 mm com 2,0; 1,3 e 1,0 brotos, respectivamente.

Indução de brotações em gema apical e axilar do porta-enxerto de macieira 'EM-9' cultivadas in vitro

O trabalho objetivou comparar dois tipos de explantes (gema apical e gema axilar) do porta-enxerto de macieira 'EM-9' e o tempo de permanência destes explantes no meio de cultura de indução (20, 30 e 40 dias), na capacidade de regeneração in vitro de brotações. O meio de cultura de indução de regeneração constituiu-se dos sais de MS, suplementado com mio-inositol (100 mg.L-1), sacarose (30 g.L-1), ágar (6,0 g.L-1), BAP (4,44 µM) e ANA (0,54 µM). Transcorrido o tempo de permanência no meio de cultura de indução de regeneração, os explantes foram transferidos para meio de cultura de multiplicação, de constituição semelhante ao meio de indução, porém sem a presença de auxina. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que as gemas apicais e axilares do porta-enxerto de macieira 'EM-9', não diferem quanto à capacidade de regeneração in vitro de brotações e, o tempo de permanência das gemas no meio de indução de regeneração, apenas mostrou diferenças para o comprimento médio das brotações, obtendo-se o maior valor com 30 dias.