Identification and characterization of a caspase-2 activating complex

Résumé Les caspases sont des protéases essentielles lors de l'induction de l'apoptose ou pour la maturation de certaines cytokines. Elles peuvent être divisées en deux groupes: les caspases initiatrices, qui sont les premières activées lors d'un signal pro-apoptotique, et les caspases effectrices, qui sont activées par les caspases initiatrices et sont responsables du clivage et de la dégradation des substrats cellulaires. Les caspases initiatrices sont activées dans des complexes de haut poids moléculaire: l'apoptosome pour la caspase-9 et le DISC pour la caspase-8. La caspase-2 est également une caspase initiatrice qui contient un domaine CARD. Cependant son mécanisme d'activation n'est pas encore connu. Lors de cette étude, nous avons découvert et caractérisé le complexe qui permet l'activation de la caspase-2. Ce complexe, appelé le PIDDosome, est composé de PIDD/LRDD, de la protéine adaptatrice RAIDD et de la protéase caspase-2. L'expression forcée de PIDD induit l'activation constitutive de la caspase-2. Cela entraîne la mort ou la sensibilisation à la mort des cellules selon la lignée étudiée. Cet effet est expliqué par une perte du potentiel de membrane de la mitochondrie, certainement dû à un effet direct de la caspase-2. Peu de choses sont connues sur PIDD: c'est une protéine contenant un domaine DD qui peut être induite par p53. Nous avons caractérisé PIDD et montré qu'elle est exprimée de façon ubiquitaire. PIDD est constitutivement auto-clivée environ au milieu de la protéine, ce qui génère deux fragments qui restent liés l'un à l'autre. Le fragment N-terminal a une activité régulatrice et le C-terminal une activité effectrice. De plus, PIDD peut se déplacer entre le cytoplasme et le noyau. Enfin, nous avons découvert que PIDD est également impliquée dans l'induction de NF¬ -κB en réponse à des dommages à l'ADN. PIDD est responsable de la modification par sumo de NEMO, étape nécessaire à l'induction de NF-κB après des dommages à l'ADN. Ainsi PIDD semble être à l'intersection de la décision que prend la cellule entre survivre et réparer les dommages, ou entrer en apoptose. Summary Caspases are a family of proteases that fulfill varied and often critical roles in mammalian apoptosis or proteolytic activation of cytokines. Caspases can be divided into two sub-groups: initiator caspases, which are the first activated after a pro-apoptotic signal, and effector caspases, which are activated by initiator caspases and that are responsible for the cleavage and degradation of cellular components. Initiator caspases are activated in high molecular weight platforms such as the apoptosome for caspase-9 or the DISC for caspase-8. Caspase-2 is a CARD-containing initiator caspase whose mechanism of activation was not yet known. In this study we have identified an activating platform for caspase-2. This high molecular weight complex, called the PIDDosome, is composed of PIDD/LRDD, the adaptor protein RAIDD and caspase-2. Constitutive expression of PIDD led to constitutive activation of caspase-2, which in some cell lines was sufficient to induce cell death while in others it merely sensitizes. Active caspase-2 was found to disturb directly the mitochondria by inducing a partial loss of the transmembrane potential. Very little was known on PIDD. It can be induce by p53 and inhibition of its expression by antisense oligonucleotides diminishes p53-dependent apoptosis. We decided to further characterize PIDD function and expression. PIDD possesses seven LRR, two Zu5 domains and one DD. It is ubiquitously expressed and appears to be constitutively cleaved by auto- processing into two main fragments equal in size. The two fragments remain bound to one another and constitute a regulatory N-terminal fragment and an active C-terminal fragment. In addition, PIDD can shuttle between the cytoplasm and the nucleus. Finally, investigating the possible relevance of new interaction partners, we found that PIDD is implicated in DNA damage-induced NF- κB. PIDD binds to RIP1 and to NEMO. In response to DNA damage, PIDD translocates to the nucleus and mediates sumo- modification of NEMO, a necessary step in DNA damage-induced NF-κB. All together these results raise the possibility that PIDD acts as a molecular switch between proliferation and repair, and apoptosis following DNA damage.

L'histoire naturelle au XVIe siècle : regards, lectures et discours sur la nature à travers l'exemple de La nature et diversité des poissons de Pierre Belon (1555)

Plan du travail Nous traiterons de cet aspect historique et contextuel dans la première partie. Les trois premiers chapitres décrivent les fondements antiques et médiévaux de la philosophie naturelle seiziémiste et évoquent l'influence du De animalibus d'Albert le Grand sur les médecins naturalistes. Nous en arriverons alors aux liens qui unissent ces derniers (chapitre IV) et aux conditions matérielles et intellectuelles qui entourent et parfois entravent la parution des ouvrages (chapitre V). Nous nous pencherons ensuite sur l'identité des lecteurs susceptibles d'être intéressés par les traités d'histoire naturelle. Ces lecteurs ont des attentes qui méritent aussi un examen quant à leur origine, car elles conditionnent pour une part variable, mais importante, le contenu des oeuvres (chapitre VI). Confrontés à des critiques, à des obstacles institutionnels parfois séculaires, les médecins naturalistes se défendent pour une part en reprenant les arguments de leurs prédécesseurs médiévaux. Mais nous les verrons mettre en place de nouvelles stratégies, en relation étroite avec le renouveau bien connu de la dialectique et de la rhétorique, qui trouve ses racines en Italie du nord à la fin du XVe siècle. Ce point sera développé dans la seconde partie, qui servira de transition essentielle dans notre exposé. C'est là que nous découvrirons que la rhétorique ne s'impose pas uniquement comme un rituel renouvelé de la dispute médiévale : elle n'entre pas seulement en jeu lorsqu'il s'agit de défendre ses intérêts contre des rivaux ou des adversaires académiques (chapitre VII). Les médecins naturalistes mettent au contraire au point des instruments au service d'un processus heuristique qui s'inspire des nouveaux canons de la rhétorique, dont Rudolph Agricola est un des théoriciens principaux (chapitre VIII). Ces observations nous amèneront à repréciser ce qu'il faut entendre par philosophie naturelle au XVIe siècle, notamment au travers de l'autorité de personnages comme Théodore Gaza (chapitre IX) et à définir les fondements généraux de l'histoire naturelle seiziémiste, en adoptant des points de vue divers : examen des tables des matières d'ouvrages, des réflexions des médecins naturalistes, avec à leur tête Conrad Gesner, ou encore étude de la pénétration de l'histoire naturelle dans quelques récits des voyageurs aux Amériques (chapitre X et XI). Arrivé à ce point de l'exposé, le lecteur aura constaté que la solidité de l'histoire naturelle seiziémiste tient à une stratégie discursive soigneusement élaborée. Le développement détaillé et l'application de ce nouveau processus, qui s'ancre au plus profond du discours descriptif de la nature, seront décrits dans la troisième partie. Nous commencerons par y rappeler quels sont les instruments antiques de la description des particulares, l'accident et la différence, que les médecins naturalistes adaptent à leurs exigences heuristiques (chapitre XII). Nous verrons le rôle de "nota", outil discursif méconnu, qui désigne les éléments décisifs ou arguments par lesquels les médecins naturalistes identifient les espèces décrites par les anciens en les confrontant aux espèces réelles (chapitre XIII). Une fois présenté l'instrument descriptif, se pose la question de son utilisation par les médecins naturalistes et de son évaluation par rapport au fonctionnement de la taxonomie moderne (chapitre XIV). La différence entre les deux regards sur la nature apparaîtra comme fondamentale : les médecins naturalistes assignent à leurs investigations des limites, inhérentes à l'origine sacrée de leur quête, qui relève de la philosophie, elle-même subordonnée à la théologie. Cela se percevra par exemple dans la description des animaux du Nouveau Monde. Les conséquences de cette constatation sont considérables : elles remettent en cause le statut du "savant" du XVIe siècle, qui ne saurait être assimilé à l'observateur extérieur tel que l'érige la science des Lumières. Belon et ses collègues se disent plutôt des "contemplateurs" et des interprètes, ce qui les rapprochent de la figure du poète, avec qui ils entretiennent des rapports ambivalents. C'est la relation même du médecin naturaliste au langage de la nature qui s'en trouve affectée : le savant n'a pas la maîtrise du discours, dans la mesure où les signes qu'il interprète et, dans une certaine mesure, ordonne, du latin : les noms d'espèces, entre autres dans les titres de notices descriptives, pour mieux cerner la relation entre la langue antique et la vernaculaire, ainsi que la notion de langue originelle chez les médecins naturalistes (chapitre XVIII). Les points communs qui émergeront de cette confrontation feront disparaître le clivage anachronique entre langue latine et langue vernaculaire, de même que l'hypothèse de l'insuffisance lexicale de la seconde, dont les médecins naturalistes auraient en vain voulu faire l'instrument de la science moderne (chapitre XIX). Le chapitre XX aura pour but d'établir le lien et l'adéquation entre les caractéristiques du discours descriptif ainsi mises en évidence et les fondements véritables de l'histoire naturelle seiziémiste.

1-11-19, Toussaint au cimetière de Bagneux [cénotaphe à la mémoire des soldats morts pour la France] : [photographie de presse] / [Agence Rol]

Référence bibliographique : Rol, 56740

[Gerardus Petrus dit Gerard] Leene [coureur cycliste néerlandais participant au meeting de la Toussaint, 1er novembre 1919] : [photographie de presse] / [Agence Rol]

Référence bibliographique : Rol, 56715

[Préparation du 14 juillet 1919 à Paris, transport d'un élément de décor] : [photographie de presse] / [Agence Rol]

Référence bibliographique : Rol, 54854

[Pyramide de canons pris à l'ennemi au rond-point des Champs-Elysées, le 13 juillet 1919] : [photographie de presse] / [Agence Rol]

Référence bibliographique : Rol, 54892

[Pyramide de canons pris à l'ennemi au rond-point des Champs-Elysées, le 13 juillet 1919] : [photographie de presse] / [Agence Rol]

Référence bibliographique : Rol, 54891

[Pyramide de canons pris à l'ennemi au rond-point des Champs-Elysées, le 13 juillet 1919] : [photographie de presse] / [Agence Rol]

Référence bibliographique : Rol, 54890

[Pyramide de canons pris à l'ennemi au rond-point des Champs-Elysées, autour du 13 juillet 1919] : [photographie de presse] / [Agence Rol]

Référence bibliographique : Rol, 54858

New human kallikrein 14: enzymatic characterization and inhibitors development.

RESUME DESTINE A UN LARGE PUBLIC En biologie, si une découverte permet de répondre à quelques questions, en général elle en engendre beaucoup d'autres. C'est ce qui s'est produit récemment dans le monde des kallicréines. De la famille des protéases, protéines ayant la faculté de couper plus ou moins spécifiquement d'autres protéines pour exercer un rôle biologique, la famille des kallicréines humaines n'était composée que de 3 membres lors du siècle dernier. Parmi eux, une kallicréine mondialement utilisée pour détecter le cancer de la prostate, le PSA. En 2000, un chercheur de l'hôpital universitaire Mont Sinaï à Toronto, le Professeur Eleftherios Diamandis, a découvert la présence de 12 nouveaux gènes appartenant à cette famille, situés sur le même chromosome que les 3 premières kallicréines. Cette découverte majeure a placé les spécialistes des kallicréines face à une montagne d'interrogations car les fonctions de ces nouvelles protéases étaient totalement inconnues. La kallicréine humaine 14 (hK14) présente un intérêt particulier, car elle se retrouve associée à différents cancers, notamment les carcinomes ovariens et mammaires. Cette association ne répond cependant pas à la fonction de cette protéase. L'objectif de ce travail de thèse était donc de découvrir, dans un premier temps, la spécificité de cette nouvelle kallicréine, c'est-à-dire le type de coupure qu'elle engendre au niveau des protéines qu'elle cible. Utilisant une technologie de pointe qui exploite la propriété des bactériophages à se répliquer dans les bactéries à l'infini, des dizaines de millions de combinaisons protéiques aléatoires ont été présentées à hK14, qui a pu sélectionner celles qui lui étaient favorables pour la coupure. Cette technique qualitative porte le nom de Phage Display Substrate. Une fois la sélection réalisée, il fallait transférer ces séquences coupées ou substrats dans un système permettant de donner une valeur quantitative à l'efficacité de coupure. Pour cela nous avons développé une technologie qui permet d'évaluer cette efficacité en utilisant des protéines fluorescentes de méduse, modifiées génétiquement, dont l'excitation de la première (CFP : cyan fluorescent protein) par la lumière à une certaine longue d'onde permet le transfert d'énergie à la seconde (YFP : yellow fluorescent protein), via un substrat qui les lie. Pour que ce transfert d'énergie se produise, il faut que les deux protéines fluorescentes soient proches, comme c'est le cas lorsqu'elles sont liées par un substrat. La coupure de ce lien provoque un changement de transfert d'énergie qui est quantifiable en utilisant un spectrofluoromètre. Cette technologie permet donc de suivre la réaction d'hydrolyse (coupure) des protéases. Afin de poursuivre certaines expériences permettant de mieux comprendre la fonction biologique d'hK14 ainsi que son éventuelle implication dans le cancer, nous avons développé des inhibiteurs spécifiques d'hK14. Les séquences qui on été le plus efficacement coupées par hK14 ont été utilisées pour transformer deux types d'inhibiteurs classiques, qui circulent dans notre sang, en inhibiteurs d'hK14 hautement efficaces et spécifiques. Selon les résultats obtenus in vitro, ils pourront être évalués in vivo en tant que traitement potentiel contre le cancer. RESUME Les protéases sont des enzymes impliquées dans des processus physiologiques mais aussi parfois pathologiques. La famille des kallicréines tissulaires humaines représente le plus grand groupe de protéases humaines, dont plusieurs pourraient participer au développement de certaines maladies. D'autre part, ces protéases sont apparues comme des marqueurs de pathogénicité potentiels, notamment dans les cas de cancers hormono-dépendants. La kallicréine humaine 14 a été récemment découverte et son implication dans quelques maladies, particulièrement dans le cas de tumeurs, semble probable. En effet, son expression génique est augmentée au niveau des tissus cancéreux de la prostate et du sein et son expression protéique s'est révélée plus élevée dans le sérum de patientes atteintes d'un cancer du sein ou des ovaires. Cependant, comme c'est le cas pour la plupart des kallicréines, sa fonction est encore inconnue. Afin de mieux connaître son rôle biologique et/ou pathologique, nous avons décidé de caractériser son activité enzymatique. Nous avons tout d'abord mis au point un système de substrats entièrement biologique permettant d'étudier in vitro l'activité des protéases. Ce système est basé sur le phénomène de FRET, à savoir le transfert d'énergie de résonance fluorescente qui intervient entre deux molécules fluorescentes voisines si le spectre d'émission de la protéine donneuse chevauche le spectre d'excitation de la protéine receveuse. Nous avons fusionné de manière covalente une protéine fluorescente bleue (CFP) et une jaune (YFP) en les liant avec diverses séquences. Par clivage de la séquence de liaison, une perte du transfert d'énergie peut être mesurée par un spectrofluoromètre. Cette technologie représente un moyen facile de suivre la réaction d'hydrolyse des protéases. Les conditions optimales de production de ces substrats CFP-YFP ont été déterminées, de même que les paramètres pouvant éventuellement influencer le FRET. Ce système possède une grande résistance à la protéolyse non spécifique et est applicable à un grand nombre de protéase. Contrairement aux substrats fluorogéniques, il permet d'étudier les acides aminés se trouvant des deux côtés du site de clivage. Ce système étant entièrement biologique, il est le reflet des interactions protéine-protéine et représente un outil biologique facile, bon marché et rapide pour caractériser les protéases. Dans un premier temps, hK14 a été mise en présence d' une banque de haute diversité de pentapeptides aléatoires présentée à la surface de phages afin d'identifier des substrats spécifiques. Ensuite, le système CFP-YFP a été employé pour trier les peptides sélectionnés afin d'identifier les séquences de substrats les plus sensibles et spécifiques pour hK14. Nous avons montré, qu'en plus de sa prévisible activité de type trypsine, hK14 possède aussi une très surprenante activité de type chymotrypsine. Les séquences les plus sensibles ont été choisies pour cribler la banque de donnée Swissprot, permettant ainsi l'identification de 6 substrats protéiques humains potentiels pour hK14. Trois d'entre eux, la laminine α-5, le collagène IV et la matriline-4, qui sont des composants de la matrice extracellulaire, ont démontré une grande susceptibilité à l'hydrolyse par hK14. De plus, la séparation éléctrophorétique a montré que la dégradation de la laminine α-5 et de la matriline-4 par hK14 devait se produire aux sites identifiés par la technologie du phage display. Pour terminer, nous avons transformé, par mutagenèse dirigée, deux serpines (inhibiteurs de protéases de type sérine) connues, AAT et ACT (alpha anti-trypsine et alpha anti-chymotrypsine), qui inhibent un vaste éventail d'enzymes humaines en inhibiteurs d'hK14 hautement efficaces et spécifiques. Ces inhibiteurs pourront être utilisés d'une part pour poursuivre certaines expériences permettant de mieux comprendre l'implication d'hK14 dans des voies physiologiques ou dans le cancer et d'autre part pour les évaluer in vivo en tant que traitement potentiel contre le cancer. SUMMARY Proteases consist of enzymes involved in physiological events, but also, in case of dysregulation, in pathogenicity. The human tissue kallikrein family represents the largest human protease cluster and includes several members that either could participate in the course of certain diseases or emerged as potential biological markers, especially in hormone dependent cancers. The human kallikrein 14 has been recently discovered and suggested implications in some disorders, particularly in tumors since its gene expression is up-regulated in prostate and breast cancer tissues and its protein expression increased in the serum of patients with breast and ovarian cancers. However, like most kallikreins, its function remains unknown. To better understand hK14 biological and/or pathological role, we decided to characterize its enzymatic activity. First of all, we developped a biological system suitable for in vitro study of protease activity. This system is based on the so-called FRET phenomenon, that is the Fluorescence Resonance Energy Transfer that occurs between two nearby fluorescent proteins if the emission spectrum of the donor overlaps the excitation spectrum of the acceptor. We fused covalently a cyan fluorescent protein (CFP) and a yellow fluorescent protein (YFP) with diverses sequences. Upon cleavage of the linker sequence by protease, the loss of energy transfer can be measured by a spectrofluorometer allowing an easy following of hydrolysis reaction. The optimal conditions to produce in bacterial system these CFP-YFP substrates were determined as well as the parameters that could eventually influence the FRET. This system demonstrated a high degree of resistance to non-specific proteolysis and applicability to various conditions corresponding to a great number of existing proteases. Other avantages are the possibility to study the amino acids located both sides of the cleavage site as well as the interest to work in a full biological system reflecting protein-protein interaction. A phage substrate library with exhaustive diversity was used prior to CFP-substrate-YFP system to isolate specific human kallikrein 14 substrates. After that the CFP-YFP system was used to sort peptides and identify highly sensitive and specific substrate sequences for hK14. We showed that besides its predictable trypsin-like activity, hK14 also possesses a surprising chymotrypsin-like activity. The screening of the Swissprot database was achieved with the most sensitive sequences and allowed the identification of 6 potential human protein substrates for hK14. Three of them, laminin α-5, collagen IV and matrilin-4, which are components of the extracellular matrix were incubated with hK14, by which they were efficiently hydrolyzed. Moreover, electrophoretic separation revealed that degradation of laminin α-5 and matrilin-4 by hK14 generated fragments with identical molecular size than the predicted N-terminal fragments that would result from hK14 specific cleavage, proving the value of phage display substrate to identify potential substrates. Finally, with site-directed mutagenesis, we transformed two well-known serpins (serine protease inhibitors), AAT and ACT (alpha anti-trypsin and alpha anti-chymotrypsin), which inhibit a vast spectrum of human enzymes into highly efficient and specific hK14 inhibitors. These inhibitors will be used to pursue experiments that could help understand hK14 implication in physiological pathways as well as in cancer biology and also to perform their in vivo evalution as potential cancer treatment.