Padronização da metodologia do RT-PCR utilizado para identificação do mRNA da alfa-amilase em sementes de milho

Durante a germinação das sementes, os carboidratos de reserva são degradados pela atividade de a-amilase. A identificação de mRNA é uma ferramenta fundamental para a definição da cinética de síntese de alfa-amilase. Objetivou-se padronizar a metodologia do RT-PCR para identificar o mRNA do gene de a-amilase em sementes de milho. Após três dias de germinação das cultivares Saracura-BRS 4154 e CATI-AL34, extraiu-se o RNA total pelo método do tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio, com algumas modificações. A partir do RNA total extraído foi obtido cDNA com utilização de "random primers". A amplificação por PCR de uma porção do gene da alfa-amilase foi realizada com os "primers": "sense" - CGACATCGACCACCTCAAC; "antisense" - TTGACCAGCTCCTGCCTGTC; gelatina; DMSO e 1,25 unidades de Taq DNA polimerase por reação e completados com água tratada com DEPC. Os ciclos para a amplificação foram 94ºC durante 4 minutos, seguidos por 34 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 42ºC durante 1 minuto e 72ºC durante 1,5 minutos e, finalmente, 72ºC por 5 minutos. O produto do RT-PCR apresentou uma banda de 249 pares de base (pb) bem definida, para as duas cultivares estudadas, não ocorrendo bandas inespecíficas. A técnica do RT-PCR mostrou ser uma metodologia eficiente para a identificação da expressão de alfa-amilase durante a germinação das sementes e pode ser usado para estudo qualitativo e quantitativo da cinética de síntese dessa enzima em experimentos de germinação.

Adequação da metodologia do teste de deterioração controlada para sementes de brócolis (Brassica oleracea L. - var. itálica)

A eficiência dos testes de vigor na avaliação da qualidade de sementes, depende da sua padronização para as diferentes espécies. Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram elaborar as curvas de absorção de água para determinar o período necessário ao ajuste do teor de água das sementes e aprimorar o teste de deterioração controlada para sementes de brócolis. Foram utilizadas sementes de três variedades: dois lotes de Piracicaba precoce, dois lotes de Flórida e quatro lotes de Ramoso. Os lotes foram caracterizados mediante a determinação do teor de água e germinação; o vigor foi determinado pelos testes de primeira contagem, comprimento de plântula, emergência e índice de velocidade de emergência. Foram determinadas as curvas de absorção de água por 84 horas. Para averiguar a eficiência do teste de deterioração controlada para sementes de brócolis, foi feito o ajuste do conteúdo de água das sementes para: 18, 20, 21, 23 e 24%, sendo estas expostas a 45ºC em banho-maria, por 24 horas. O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. As curvas de absorção permitiram estimar os períodos de 15, 20, 22, 32 e 48 horas para elevação do teor de água a 18, 20, 21, 23 e 24% respectivamente. O teste de deterioração controlada, para sementes de brócolis, propiciou resultados promissores, tendo sido eficiente na separação de lotes, em todos os teores de água estudados, tanto quanto os testes de emergência de plântula e índice de velocidade de emergência.

Detecção de soja geneticamente modificada tolerante ao glifosato por métodos baseados na atividade de enzimas

Avanços na engenharia genética permitiram a obtenção de plantas geneticamente modificadas tolerantes a determinados herbicidas. O uso de sementes de plantas geneticamente modificadas está aumentando rapidamente, havendo a necessidade de desenvolver métodos de identificação e detecção rápidos, práticos e de baixo custo, que possam ser padronizados.O objetivo desta pesquisa foi desenvolver um método bioquímico de deteccção de soja tolerante ao glifosato. Foram comparados dois genótipos de soja, um tolerante ao glifosato e seu parental não geneticamente modificado. As sementes foram submetidas a tratamentos de pré-embebição por 16 horas, em água e em solução de herbicida contendo 0,6% do ingrediente ativo e, mantidas a seguir em germinador à temperatura de 25°C por sete dias. Após, foi realizada a extração e a determinação da atividade da enzima peroxidase pela avaliação dos eletroforegramas e de reação colorimétrica. Os resultados obtidos permitiram concluir que é possível diferenciar cultivares de soja quanto à tolerância ao herbicida glifosato através da reação colorimétrica. Há diferença nos eletroforegramas de atividade da enzima peroxidase entre os cultivares tolerante e suscetível ao glifosato.

Bioensaios na detecção e quantificação de sementes de soja geneticamente modificada resistente ao glifosato

O cultivo mundial de soja geneticamente modificada (GM) resistente ao glifosato é crescente e a presença dessas sementes em lotes de sementes convencionais tornou-se um problema para o comércio internacional da soja. Reconhecendo a importância dos novos mercados e dos produtos GM, a Tecnologia de Sementes terá que assegurar a pureza genética dos produtos derivados da biotecnologia através de testes confiáveis, práticos e de baixo custo. Nesse contexto, os objetivos do trabalho foram verificar a eficiência do teste de germinação com herbicida no substrato (bioensaios) na detecção e na quantificação de misturas de cultivares GM em amostras de sementes convencionais. Amostras de sementes convencionais foram preparadas com 0, 1, 3 e 5% de sementes de soja GM e submetidas aos métodos de pré-embebição, substrato umedecido e imersão em herbicida, instaladas em bandejas plásticas contendo 25 sementes, com e sem associação ao kit de detecção de OGM. Na seqüência, amostras contaminadas com 0, 1, 3, 5 e 8% de sementes de soja GM foram semeadas em rolos de papel (25 e 50 sementes/rolo) e bandejas plásticas com 25 sementes seguindo o método de pré-embebição em herbicida. Aos seis dias após a instalação, avaliaram-se comprimento de hipocótilo, comprimento de raiz, número de raízes secundárias e comprimento da maior raiz secundária. O método de pré-embebição é o mais eficiente para a detecção e quantificação da presença de sementes de soja GM, permitindo 100% de acertos na detecção, independentemente da porcentagem de contaminantes nas amostras convencionais de sementes de soja e apresenta exatidão na quantificação da presença de até 3% de sementes de soja GM em amostras convencionais, sendo sua precisão condicionada ao porcentual de mistura presente na amostra.

Comparação de métodos na detecção de sementes de soja geneticamente modificada resistente ao glifosato

Pesquisas tem sido conduzidas visando determinar métodos de detecção de organismos geneticamente modificados (OGM), devido, principalmente, à importância sobre a atividade comercial. Atualmente, são utilizados bioensaios, que avaliam características fenotípicas das plântulas, testes de ELISA e Kits, que possibilitam identificar proteínas transgênicas específicas de DNA. O objetivo deste trabalho foi comparar a eficiência dos métodos para detectar sementes de soja Roundup Ready (RR). Amostras de sementes de soja geneticamente modificada (GM) resistente ao glifosato e de sementes do parental suscetível foram submetidas a bioensaios (pré-embebidas, umedecidas em substrato, imersas em solução contendo glifosato e pulverização de plântulas), Kit Trait Test e detecção pelo método da PCR. Os bioensaios são métodos mais eficientes comparando a relação custo/benefício na detecção de sementes de soja GM, sendo o método de pré-embebição o mais indicado e a análise das características morfológicas de plântulas é importante nos bioensaios para detecção de sementes de soja GM.

Adequação da metodologia do teste de tetrazólio para avaliação da qualidade fisiológica de sementes de melancia

O presente trabalho teve o objetivo de adequar a metodologia do teste de tetrazólio para a avaliação da qualidade fisiológica de sementes melancia. Na primeira etapa, buscando definir o procedimento mais adequado para a condução deste teste, foram avaliados os seguintes procedimentos para a remoção do tegumento da semente: umedecimento em papel toalha e imersão em água por 16 e 24 h a 25ºC; imersão em água, em câmara BOD a 40ºC, por 30, 40 e 60 minutos. Para a remoção da membrana remanescente que envolve o embrião, foi feita a imersão em água, em câmara BOD a 40ºC, por 40 e 60 minutos. Em seguida, os embriões foram imersos em solução de tetrazólio 0,075% a 40ºC, no escuro, por 30, 40 e 60 minutos para coloração. Paralelamente, foram conduzidos testes de germinação e emergência de plântulas em solo, estabelecendo-se critérios para avaliação da viabilidade e do vigor. Na segunda etapa, a metodologia definida como a mais adequada para o teste de tetrazólio foi aplicada a oito lotes de sementes, comparando-se os resultados com os obtidos nos testes de germinação, primeira contagem de germinação, envelhecimento acelerado e emergência das plântulas em solo. Os resultados indicaram que o teste de tetrazólio é eficiente para avaliar a viabilidade e o vigor das sementes de melancia. É possível estabelecer cinco classes de viabilidade, sendo vigorosas as sementes das classes 1 e 2 , viáveis as das classes 1 a 3 e não viáveis e mortas as das classes 4 e 5, respectivamente. Para a condução do teste, as sementes devem ser imersas em água a 40ºC por 40 minutos para retirar o tegumento e por mais 60 minutos para a remoção da membrana interna remanescente; em seguida, devem ser imersas em solução de tetrazólio 0,075%, a 40ºC, por 60 minutos para o desenvolvimento de coloração adequada.

Bioensaio em casa-de-vegetação na detecção e quantificação de sementes de soja geneticamente modificada

Preocupações com os atributos intrínsecos e extrínsecos de qualidade nos alimentos têm crescido nas últimas décadas e a polêmica acirrou-se com a entrada no mercado dos alimentos geneticamente modificados (GM) de consumo global. Esta situação tem levado institutos de pesquisa, agências de inspeção e companhias de vários países a desenvolver estratégias e métodos para detecção de sementes de plantas GM. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi verificar a eficiência de bioensaio em casa-de-vegetação na detecção e quantificação de misturas de sementes GM em amostras convencionais. Amostras de sementes convencionais foram preparadas com 0, 1, 3 e 5% de sementes de soja GM e semeadas em bandejas plásticas contendo areia peneirada. As bandejas foram mantidas em casa-de-vegetação climatizada e, após quinze dias da instalação do experimento, aplicou-se o herbicida glifosato sobre as plântulas. Catorze dias depois da aplicação do herbicida, avaliou-se o número de plântulas sobreviventes, sem sintomas da ação do glifosato, determinando se a plântula era ou não geneticamente modificada . O bioensaio em casa-de-vegetação é eficiente para detecção e estimativa da quantidade de sementes de soja GM em amostras de soja convencional.

Sistema hidropônico com uso de solução de herbicida na detecção de soja geneticamente modificada resistente ao glifosato

Os objetivos deste estudo foram verificar a eficiência do sistema hidropônico com uso de solução herbicida na detecção de cultivares de soja GM resistentes ao glifosato e convencionais e estabelecer um protocolo de detecção em sistema hidropônico. Foram utilizadas amostras de sementes de dois genótipos geneticamente modificados e os respectivos parentais não geneticamente modificados (não-GM). Foram realizados cinco ensaios para estabelecer o protocolo de detecção; nos ensaios I e II foi realizada a pré-germinação das sementes, seguida da colocação das plântulas em recipientes contendo solução nutritiva, com posterior transferência para solução de herbicida (as concentrações utilizadas foram 0; 0,12; 0,24; 0,36; 0,48% do equivalente ácido do glifosato), e finalmente, as plântulas retornaram para a solução nutritiva. Nos ensaios III, IV e V, as sementes foram colocadas diretamente em recipientes contendo solução de herbicida e depois transferidas para solução nutritiva. Os parâmetros avaliados foram porcentagem de plântulas normais, comprimento de plântula, de raiz e de parte aérea e número de raízes secundárias. O sistema hidropônico permite a detecção de sementes de soja resistente ao glifosato em 5 dias, após tratamento com solução de glifosato. O protocolo de detecção de sementes de soja GM em sistema hidropônico recomendado é a permanência das sementes em contato com a solução do herbicida na concentração de 0,12% do equivalente ácido do glifosato por quatro horas, seguido da transferência das sementes para a solução nutritiva até completar cinco dias, utilizando como parâmetro de avaliação o comprimento de plântulas e a presença de raízes secundarias das plântulas de soja GM.

Secafé: metodologia para acelerar a germinação das sementes de café

Para analisar o uso do hipoclorito de sódio na degradação do pergaminho, como alternativa à remoção manual, bem como verificar seu efeito sobre a germinação das sementes, foram utilizadas sementes de café arábica da variedade Catuaí 44, provenientes da área experimental da Empresa Fertilizantes Heringer, no município de Manhuaçú, MG, com umidade inicial de 28,14%. Os tratamentos foram constituídos pela combinação de cinco concentrações de hipoclorito de sódio (0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10%) e quatro tempos de embebição (6, 12, 18 e 24h), além de duas testemunhas, uma com pergaminho e outra sem pergaminho, o qual foi retirado manualmente. O experimento foi conduzido no delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 5 x 4, com 2 testemunhas adicionais, utilizando-se oito repetições de 50 sementes. Os testes utilizados para a avaliação da qualidade fisiológica das sementes foram: germinação, primeira contagem de germinação e classificação do vigor das plântulas. As concentrações de zero e 2,5% de hipoclorito de sódio não foram eficientes na retirada do pergaminho em todos os tempos de exposição. As concentrações iguais ou superiores a 5% foram efetivas na remoção do pergaminho mesmo nos menores tempos de exposição das sementes. O tratamento que proporcionou melhores resultados de germinação foi a embebição das sementes em solução de hipoclorito de sódio na concentração de 5% no tempo de 6 horas, apresentando-se superior à testemunha com pergaminho e semelhante à testemunha cujo pergaminho foi retirado manualmente. Conclui-se que a utilização do hipoclorito de sódio constitui alternativa eficiente para a retirada do pergaminho, sem causar prejuízo à germinação das sementes de café com 28,14% de umidade, podendo ser de grande utilidade na realização do teste de germinação em laboratório.

Ajuste de metodologias para a identificação de cultivares de soja quanto à tolerância ao glifosato

Os bioensaios constituem numa alternativa prática e eficiente para detecção de sementes de soja geneticamente modificada (GM), tolerante ao glifosato. Contudo, deve ser verificada sua utilização na identificação das sementes quando o lote é de soja GM, ou seja, quando sementes de soja convencional são a minoria. Objetivou-se com este trabalho ajustar a metodologia de dois bioensaios de detecção de sementes de soja GM e testar os melhores protocolos, um de cada bioensaio, na detecção e quantificação de misturas simuladas, contendo genótipos contrastantes quanto à tolerância ao herbicida. Nos bioensaios, foram testadas três umidades do substrato (2,0; 2,5 e 3,0 vezes o seu peso seco), cinco soluções do herbicida (0; 0,01; 0,03; 0,06 e 0,12 %) no método papel umedecido com glifosato e quatro soluções (0; 0,3; 0,6 e 1,2 %) no método pré - embebição de sementes. A umidade 3,0 e solução 0,03 % constituíram o protocolo mais eficiente para detecção no método do papel umedecido. A umidade 2,0 e solução 0,3 % se destacaram no método da pré-embebição das sementes. Foi mais prático e rápido detectar plântulas tolerantes do que plântulas sensíveis em ambos os testes. Em amostras com maior taxa de contaminação, foi mais fácil detectar e mais difícil quantificar misturas com exatidão. Os erros foram relativamente raros considerando os acertos.

Detecção de fungos em sementes de pau-brasil (Caesalpinia echinata) coletadas durante sua formação e dispersão

O pau-brasil é uma espécie florestal que tem imenso potencial de utilização, porém, atualmente, encontra-se enquadrada na categoria de extinção sendo importantes as ações que contribuírem para retirá-la desse contexto. As espécies florestais tropicais regeneram-se por vários mecanismos e, dentre estes, a semente é um dos principais, devendo-se atentar para sua qualidade sanitária e fisiológica. Existem poucos relatos sobre a ocorrência de fungos em sementes de pau-brasil e os trabalhos existentes não esclarecem em que momento da formação das sementes ocorre a incidência desses fungos. Objetivou-se através deste trabalho verificar a incidência de fungos durante o processo de formação e dispersão das sementes de pau-brasil. Foram analisadas, pelo método do papel de filtro, sementes coletadas em diferentes momentos da sua formação (após antese e após deiscência). Os principais fungos detectados foram Cladosporium cladosporioides, Pestalotiopsis maculans, Fusarium sp. e Epicoccum sp. Outros fungos encontrados em menor incidência foram Aspergillus spp., Nigrospora sp. e Penicillium sp. C. cladosporioides e Pestalotiopsismaculans estavam presentes nas sementes desde o início, na coleta aos 40 dias pós-antese, tendo a incidência aumentada ao longo do tempo, atingindo 100% nas sementes com um e dois dias de deiscência. Fusarium sp. foi detectado nas sementes coletadas após a deiscência, tendo sua incidência aumentada à medida que as sementes permaneceram no solo.

Validação de metodologia para o teste de germinação em sementes de nabo forrageiro (Raphanus sativus L. var. oleiferus)

Para várias espécies vegetais, testes como o de germinação não tem seus procedimentos descritos nas Regras para Análise de Sementes (RAS) utilizadas no Brasil pela falta de padronização e validação metodológica. Dentre elas, o nabo forrageiro, que tem sido considerada uma cultura promissora para a produção de biodiesel, tem sua germinação avaliada por metodologia recomendado para a espécie Raphanus sativus , mas tem especificidade de variedade (var oleiferus) com características de plantas e sementes, que diferem das demais variedades da espécie. Para assegurar a padronização de metodologias para o comércio internacional de sementes é necessário estabelecer critérios para validação de metodologia, cuja descrição deve ser clara e completa com procedimentos que propiciem exatidão, robustez, precisão (reprodutibilidade e repetibilidade). O objetivo neste estudo foi avaliar o processo de validação de duas metodologias para o teste de germinação em sementes de nabo forrageiro, utilizando para as análises estatísticas o procedimento padrão da ISTA, bem como técnicas complementares. Os testes de germinação foram realizados em oito laboratórios com cinco lotes, utilizando substrato areia e papel em temperatura alternada 20-30 ºC. As técnicas estatísticas foram utilizadas para: verificar a homogeneidade dos lotes (teste H), identificar a presença de valores discrepantes (método de Hampel) e outliers nas variâncias (teste de Levene para média); avaliar os efeitos de laboratórios e lotes (Análise de Variância); verificar a repetibilidade, reprodutibilidade, exatidão e robustez (limites críticos de repetibilidade, reprodutibilidade, estatísticas h e k de Mandel), comparar as diferentes metodologias de germinação (testes F) e reavaliar o nível de qualidade dos lotes (Análise Discriminante). Tanto no aspecto estatístico, como fitotécnico, as metodologias para o teste de germinação em sementes de nabo forrageiro com a utilização do substrato areia e papel, temperatura alternada 20-30 ºC podem ser considerados validadas, pois apresentam exatidão, robustez e precisão adequadas.

Avaliação do potencial de uso da restrição hídrica em teste de sanidade de sementes de trigo visando à detecção de fungos

Objetivou-se, com o presente trabalho, avaliar a viabilidade do uso da restrição hídrica, em substituição ou alternativa ao uso da técnica de congelamento de sementes de trigo, no teste de incubação em substrato de papel, blotter test. O trabalho consistiu na comparação das duas técnicas por meio do exame de 60 amostras de sementes, coletadas em diferentes áreas do Estado de Minas Gerais e outras regiões do país, tendo como restritor hídrico o soluto manitol, no potencial de -1,10 MPa, valor este determinado preliminarmente com base na capacidade de redução da germinação das sementes de trigo em condições do teste de sanidade. A incidência média de Bipolaris sorokiniana não foi afetada por nenhuma das técnicas comparadas, havendo, por outro lado, um maior estímulo da restrição hídrica em relação à Pyricularia grisea, Aspergillus ochraceus, Cladosporium cladosporioides e Epicoccum purpuracens. Para Alternaria alternata, Drechslera tritici-repentis e Fusarium graminearum, os maiores valores de incidência ocorreram no método do congelamento.

A metodologia de Lamarck

Neste artigo, o método científico de Jean-Baptiste Lamarck é estudado sob o ponto de vista de seu discurso metodológico, bem como sob o ponto de vista de sua prática científica. Essa metodologia é comparada à preconizada por Condillac, assim como à dos "ideólogos" (idéologues) grupo no qual se costuma incluir o próprio Lamarck. Mostra-se que o discurso metodológico de Lamarck assemelha-se ao dos ideólogos; no entanto, sua prática científica não se coaduna com esse enfoque. Em vez de seguir uma abordagem empirista, a obra de Lamarck se fundamenta em princípios metafísicos gerais sobre a natureza. Sob o ponto de vista dos ideólogos, seu trabalho deveria ser rejeitado - o que de fato ocorreu - como um mero sistema (système) metafísico - no sentido pejorativo utilizado pelos seguidores de Condillac. No entanto, o presente artigo argumenta que esse é justamente um importante e inovador aspecto da obra de Lamarck, que permitiu a eclosão do evolucionismo moderno.

Del "know how" al poder: la metodologia d'avaluació d'intangibles empresarials en competència i la seva aplicació en un entorn oligopolístic

Sometimes, behind the entrepreneurial profit the degree of monopoly is concealed. What it occurs with the models of investments evaluation when the skill of the employer consists on having capacity to capture the regulator?