Specific role of neuronal nitric-oxide synthase when tethered to the plasma membrane calcium pump in regulating the beta-adrenergic signal in the myocardium

The cardiac neuronal nitric-oxide synthase (nNOS) has been described as a modulator of cardiac contractility. We have demonstrated previously that isoform 4b of the sarcolemmal calcium pump (PMCA4b) binds to nNOS in the heart and that this complex regulates beta-adrenergic signal transmission in vivo. Here, we investigated whether the nNOS-PMCA4b complex serves as a specific signaling modulator in the heart. PMCA4b transgenic mice (PMCA4b-TG) showed a significant reduction in nNOS and total NOS activities as well as in cGMP levels in the heart compared with their wild type (WT) littermates. In contrast, PMCA4b-TG hearts showed an elevation in cAMP levels compared with the WT. Adult cardiomyocytes isolated from PMCA4b-TG mice demonstrated a 3-fold increase in Ser(16) phospholamban (PLB) phosphorylation as well as Ser(22) and Ser(23) cardiac troponin I (cTnI) phosphorylation at base line compared with the WT. In addition, the relative induction of PLB phosphorylation and cTnI phosphorylation following isoproterenol treatment was severely reduced in PMCA4b-TG myocytes, explaining the blunted physiological response to the beta-adrenergic stimulation. In keeping with the data from the transgenic animals, neonatal rat cardiomyocytes overexpressing PMCA4b showed a significant reduction in nitric oxide and cGMP levels. This was accompanied by an increase in cAMP levels, which led to an increase in both PLB and cTnI phosphorylation at base line. Elevated cAMP levels were likely due to the modulation of cardiac phosphodiesterase, which determined the balance between cGMP and cAMP following PMCA4b overexpression. In conclusion, these results showed that the nNOS-PMCA4b complex regulates contractility via cAMP and phosphorylation of both PLB and cTnI.

Novel functional interaction between the plasma membrane Ca2+ pump 4b and the proapoptotic tumor suppressor Ras-associated factor 1 (RASSF1)

Plasma membrane calmodulin-dependent calcium ATPases (PMCAs) are enzymatic systems implicated in the extrusion of calcium from the cell. We and others have previously identified molecular interactions between the cytoplasmic COOH-terminal end of PMCA and PDZ domain-containing proteins. These interactions suggested a new role for PMCA as a modulator of signal transduction pathways. The existence of other intracellular regions in the PMCA molecule prompted us to investigate the possible participation of other domains in interactions with different partner proteins. A two-hybrid screen of a human fetal heart cDNA library, using the region 652-840 of human PMCA4b (located in the catalytic, second intracellular loop) as bait, revealed a novel interaction between PMCA4b and the tumor suppressor RASSF1, a Ras effector protein involved in H-Ras-mediated apoptosis. Immunofluorescence co-localization, immunoprecipitation, and glutathione S-transferase pull-down experiments performed in mammalian cells provided further confirmation of the physical interaction between the two proteins. The interaction domain has been narrowed down to region 74-123 of RASSF1C (144-193 in RASSF1A) and 652-748 of human PMCA4b. The functionality of this interaction was demonstrated by the inhibition of the epidermal growth factor-dependent activation of the Erk pathway when PMCA4b and RASSF1 were co-expressed. This inhibition was abolished by blocking PMCA/RASSSF1 association with an excess of a green fluorescent protein fusion protein containing the region 50-123 of RASSF1C. This work describes a novel protein-protein interaction involving a domain of PMCA other than the COOH terminus. It suggests a function for PMCA4b as an organizer of macromolecular protein complexes, where PMCA4b could recruit diverse proteins through interaction with different domains. Furthermore, the functional association with RASSF1 indicates a role for PMCA4b in the modulation of Ras-mediated signaling.

Geographical variation in inorganic arsenic in paddy field samples and commercial rice from the Iberian Peninsula

This study investigated total arsenic and arsenic speciation in rice using ion chromatography with mass spectrometric detection (IC-ICP-MS), covering the main rice-growing regions of the Iberian Peninsula in Europe. The main arsenic species found were inorganic and dimethylarsinic acid. Samples surveyed were soil, shoots and field-collected rice grain. From this information soil to plant arsenic transfer was investigated plus the distribution of arsenic in rice across the geographical regions of Spain and Portugal. Commercial polished rice was also obtained from each region and tested for arsenic speciation, showing a positive correlation with field-obtained rice grain. Commercial polished rice had the lowest i-As content in Andalucia, Murcia and Valencia while Extremadura had the highest concentrations. About 26% of commercial rice samples exceeded the permissible concentration
for infant food production as governed by the European Commission. Some cadmium data is also presented, available with ICP-MS analyses, and show low concentration in rice samples.

Preparation and characterization of novel nanocomposites of inorganic/polysaccharide type

O uso de polímeros naturais no âmbito da preparação de nanocompósitos não tem sido tão amplamente estudado quando comparado com os polímeros sintéticos. Assim, esta tese tem como objectivo estudar metodologias para a preparação de novos materiais nanocompósitos sob a forma de dispersões e filmes utilizando polissacarídeos como matriz. A tese está dividida em cinco capítulos sendo o último capítulo dedicado às conclusões gerais e a sugestões para trabalhos futuros. Inicialmente é apresentada uma breve revisão bibliográfica sobre os principais temas colocando esta tese em contexto. Considerações sobre o uso de polímeros naturais e a sua combinação com a utilização de nanopartículas inorgânicas para a fabricação de novos bionanocomposites são descritas e os objectivos e outline da tese são também apresentados. No segundo capítulo, a preparação de partículas de sílica puras ou modificadas bem como a sua caracterização por FTIR, SEM, TEM, TGA, DLS (tamanho e potencial zeta) e medições de ângulo de contacto são discutidas. De modo a melhorar a compatibilidade da sílica com os polissacarídeos, as partículas SiO2 foram modificados com dois compostos do tipo organosilano: 3- metacril-oxipropil-trimetoxissilano (MPS) e 3-aminopropil-trimetoxissilano (APS). As partículas SiO2@MPS foram posteriormente encapsuladas com de poli(metacrilato de glicidilo) utilizando a técnica de polimerização em emulsão. A utilização dos nanocompósitos resultantes na preparação de dispersões de bionanocompósitos não foi bem sucedida e por esse motivo não os estudos não foram prosseguidos. O uso de SiO2@APS na preparação de dispersões bionanocomposite foi eficiente. No terceiro capítulo é apresentada uma revisão sobre dispersões bionanocompósitas e respectiva caracterização destacando aspectos fundamentais sobre reologia e microestrutura. Em seguida, é discutido o estudo sistemático realizado sobre o comportamento reológico de dispersões de SiO2 utilizando três polissacarídeos distintos no que concerne a carga e as características gelificantes: a goma de alfarroba (não iónica), o quitosano (catiónico) e a goma xantana (aniónica) cujas propriedades reológicas são amplamente conhecidas. Os estudos reológicos realizados sob diferentes condições demonstraram que a formação de géis frágeis e/ou bem estruturados depende do tamanho SiO2, da concentração, do pH e da força iónica. Estes estudos foram confirmados por análises microestruturais usando a microscopia electrónica a baixas temperaturas (Cryo-SEM). No quarto capítulo, são apresentados os estudos relativos à preparação e caracterização de filmes bionanocompósitos utilizando quitosano como matriz. Primeiramente é apresentada uma revisão sobre filmes de bionanocompósitos e os aspectos fundamentais das técnicas de caracterização utilizadas. A escolha do plasticizante e da sua concentração são discutidas com base nas propriedades de filmes de quitosano preparados. Em seguida, o efeito da concentração de sílica e dos métodos utilizados para a dispersar na matriz de polissacarídeo, bem como o efeito da modificação da superfície da sílica é avaliado. As características da superfície e as propriedades de barreira, mecânicas e térmicas são discutidas para cada conjunto de filmes preparados antes e após a sua neutralização. Os resultados obtidos mostraram que a dispersão das cargas no plasticizante e posterior adição à matriz polissacarídica resultaram apenas em pequenas melhorias já que o problema da agregação de sílica não foi ultrapassado. Por esse motivo foram preparados filmes com SiO2@APS os quais apresentaram propriedades melhores apesar da agregação das partículas não ter sido completamente impedida. Tal pode estar relacionado com o processo de secagem dos filmes. Finalmente, no capítulo 5, são apresentadas as principais conclusões obtidas e algumas sugestões para trabalho futuro.

Novel microporous silicates and mesoporous MCM materials derivatised with inorganic and organometallic complexes

Os materiais microporosos e mesoporosos são potenciais catalisadores heterogéneos. Os zeólitos e outros materiais microporosos do tipo zeolítico tradicionais, têm átomos tetracoordenados no esqueleto. Nos últimos anos, um vasto número de titanossilicatos contendo Ti(IV) hexacoordenado e Si(IV) tetracoordenado, com estruturas tridimensionais, têm sido alvo de grande interesse. Um dos objectivos desta tese foi preparar silicatos microporosos, contendo átomos metálicos com número de coordenação superior a quatro, e possuindo quer novas estruturas quer propriedades físicas e químicas interessantes. Neste contexto, foi preparado um novo ítriossilicato de sódio, AV-1, análogo do raro mineral montregianite, Na4K2Y2Si16O38·10H2O. Este material é o primeiro sólido microporoso que contem quantidades estequiométricas de sódio (e ítrio) no esqueleto. Foi, também, sintetizado um silicato de cério, AV-5, análogo estrutural do mineral montregianite com potencial aplicação em optoelectrónica. Nesta tese é, ainda, descrita a síntese e caracterização estrutural de um silicato de cálcio hidratado, AV-2, análogo do raro mineral rhodesite (K2Ca4Na2Si16O38.12H2O). Na continuação do trabalho desenvolvido em Aveiro na síntese de novos titanossilicatos surgiu o interesse de preparar novos zirconossilicatos microporosos por síntese hidrotérmica. Foram preparados dois novos materiais análogos dos minerais petarasite Na5Zr2Si3O18(Cl,OH)·2H2O (AV-3) e kostylevite, K2Si3O9·H2O (AV-8). Foram, também, obtidos análogos sintéticos dos minerais parakeldyshite e wadeite, por calcinação a alta temperatura de AV-3 e de umbite sintética. A heterogeneização de complexos organometálicos na superfície de materiais mesoporosos do tipo M41S permite associar a grande actividade catalítica e a presença de sítios activos localizados típicos dos complexos organometálicos, com a robustez e fácil separação, características dos materiais mesoporosos siliciosos. Nesta dissertação relata-se a derivatização dos materiais MCM-41 e MCM-48 através da reacção de [SiMe2{(h5-C5H4)2}]Fe e [SiMe2{(h5-C5H4)2}]TiCl2 com os grupos silanol das superfícies mesoporosas. Os materiais MCMs derivatizados com ansa-titanoceno foram testados na epoxidação de cicloocteno a 323 K na presença de hidrogenoperóxido de t-butilo. Estudou-se a heterogeneização dos sais de complexos com ligação metal-metal [Mo2(MeCN)10][BF4]4, [Mo2(m-O2CMe)2(MeCN)6][BF4]2 e [Mo2(m- O2CMe)2(dppa)2(MeCN)2][BF4]2 via imobilização nos canais do MCM-41. A imobilização dos catalisadores homogéneos na superfície do MCM-41 envolve a saída dos ligandos nitrilo lábeis, preferencialmente em posição axial, através da reacção com os grupos Si-OH da sílica. Verificou-se que a ligação Mo-Mo se mantém intacta nos produtos finais. É provável que estes materiais sejam eficientes catalisadores heterogéneos em reacções de polimerização. As técnicas de caracterização utilizadas nesta tese foram a difracção de raios-X de pós, a microscopia electrónica de varrimento, a espectroscopia de ressonância magnética nuclear do estado sólido (núcleos 13C, 23Na e 29Si), as espectroscopias de Raman e infravermelho com transformadas de Fourier, as análises termogravimétricas e as análises de adsorção de água e azoto.

Síntese de receptores para o reconhecimento e transporte de aniões

Nesta tese, realizada no âmbito do Programa Doutoral em Química da Universidade de Aveiro, foram desenvolvidas duas famílias de receptores sintéticos: macrocíclicos baseados na plataforma tetraazacalix[2]areno[2]triazina; e acíclicos construídos a partir de diaminas simples. A plataforma macrocíclica foi decorada nos átomos de azoto em ponte com unidades de reconhecimento molecular contendo fragmentos com grupos amida para o reconhecimento de aniões ou com grupos ácidos carboxílicos para a coordenação de metais de transição. Os receptores acíclicos foram obtidos por acoplamento de diaminas (etilenodiamina, orto-fenilenodiamina ou 2-aminobenzilamina) com uma unidade lipofílica incorporando um anel heterocíclico (derivados de oxadiazole ou furano) e com um derivado isocianato. Estas moléculas assimétricas com um grupo amida e um grupo ureia como unidades de reconhecimento molecular foram avaliadas como receptores e transportadores transmembranares de aniões biologicamente relevantes (Cl- e HCO3-). Os resultados experimentais obtidos serão descritos ao longo de três capítulos, após um primeiro capítulo bibliográfico. No Capítulo 1 começa-se por fazer uma revisão bibliográfica sucinta sobre o desenvolvimento recente de receptores funcionais baseados em azacalixarenos bem como das suas aplicações, designadamente no reconhecimento molecular. Numa segunda parte apresenta-se uma revisão sucinta de receptores derivados de (tio)ureias, relacionados com os receptores sintetizados no âmbito desta tese e com propriedades de reconhecimento e transporte transmembranar de aniões. No Capítulo 2 reporta-se uma série de macrociclos novos com os átomos de azoto em ponte de tetraazacalix[2]areno[2]triazina funcionalizados com bromoacetato de metilo. Foram preparados três novos macrociclos com quatro grupos éster, como braços pendentes, a partir de percursores tetraazacalix[2]areno[2]triazina com os anéis de triazina substituídos com cloro, metilamina ou hexilamina. Os grupos acetato foram hidrolisados em condições básicas, tendo cada um dos derivados dialquilamina originado um composto com quatro grupo carboxílicos, enquanto o análogo diclorado originou uma mistura de compostos com dois grupos carboxílico e com os átomos de cloro substituídos por grupos hidroxilo. Subsequentemente, as propriedades de coordenação dos derivados alquilamina para cobre(II) foram avaliadas por espectroscopia de UV-Vis, tendo-se obtido constantes de estabilidades semelhantes (logk ≈ 6,7). No Capítulo 3 descrevem-se três macrociclos obtidos através da funcionalização dos átomos de azoto em ponte de tetraazacalix[2]areno[2]triazina com grupos amida derivados de N-Boc-etilenodiamina, benzilamina e (S)-metilbenzilamina. A afinidade destes receptores para a série de aniões carboxilato (oxalato, malonato, succinato, glutarato, diglicolato, pimelato, suberato, fumarato, maleato, ftalato e isoftalato) e inorgânicos (Cl-, H2PO4- e SO42-) por titulação de RMN de 1H, foi avaliada. Estes macrociclos conjuntamente com os descritos no Capítulo 2 são os primeiros exemplos reportados na literatura de receptores sintéticos baseados na plataforma de tetraazacalix[2]areno[2]triazina com grupos funcionais nos azotos em ponte. O receptor derivado de N-Boc-etilenodiamina, com oito grupos N-H, entre os três receptores, é o que apresenta maior afinidade para os aniões estudados. No Capítulo 4 é descrita a síntese 59 compostos acíclicos (vide supra) obtidos em três passos de síntese com bons rendimentos. No design desta biblioteca de moléculas a afinidade para aniões dos grupos ureia foi modelada pela inserção de diferentes substituintes arilo ou alquilo, com propriedades electrónicas distintas. A introdução destes grupos em conjugação com um anel de oxadiazole ou furano permitiu também modelar a lipofília destes compostos. A afinidade destes receptores para aniões cloreto e bicarbonato, e em alguns casos para fumarato e maleato, foi investigada por titulação de RMN de 1H. Estes compostos apresentaram constantes de associações compatíveis com o transporte transmembranar de cloreto. Por outro lado estes receptores apresentaram afinidades elevadas para fumarato e maleato, com seletividade para este último. São também discutidos os resultados dos ensaios de transporte de cloreto por estes receptores através de vesículas de em POPC. No Capítulo 5 encontram-se as conclusões gerais desta tese de Doutoramento. No Capitulo 6 encontram-se os dados espectroscópicos e os restantes detalhes experimentais para todos os compostos sintetizados.

Removal of cyanobacteria and cyanotoxins from drinking water by powdered activated carbon adsorption/ultrafiltration

Tese dout., Ciências e Tecnologias do Ambiente, Universidade do Algarve, 2009

Application of permeation liquid membrane and scanned stripping chronopotentiometry to metal speciation analysis of colloidal complexes

The potential of permeation liquid membrane (PLM) to obtain dynamic metal speciation information for colloidal complexes is evaluated by measurements of lead(II) and copper(II) complexation by carboxyl modified latex nanospheres of different radii (15, 35, 40 and 65 nm). The results are compared with those obtained by a well characterized technique: stripping chronopotentiometry at scanned deposition potential (SSCP). Under the PLM conditions employed, and for large particles or macromolecular ligands, membrane diffusion is the rate-limiting step. That is, the flux is proportional to the free metal ion concentration with only a small contribution from labile complexes. In the absence of ligand aggregation in the PLM channels, good agreement was obtained between the stability constants determined by PLM and SSCP for both metals.

The role of hypoxia in the regulation of membrane transporters

ATP binding cassette (ABC) and solute carrier (SLC) transporters are responsible for the majority of the transcellular movement of various substrates, including drugs, among epithelial cells. Despite the well characterized regulation of influx (SLC) and efflux (ABC) transporters by endogenous mediators, such as inflammatory cytokines, little is known about how changes in oxygen levels may affect expression of these transporters. In this study we showed that the expression of SLC22A4, SLC22A5, SLC22A1, SLC02B1, SLC10A2, ABCC2 and ABCC3 transporters is upregulated by hypoxia in HT29 colon carcinoma cells, but not in HepG2 hepatocarcinoma cells. Moreover, OCTN1 (SLC22A4), OCT1 (SLC22A1) and OATP-B (SLC02B1) transporter expression is also induced by inflammatory cytokines but in a smaller extent than in hypoxia. Furthermore our experiments indicate that there is no cross talk between HIF-1 and NF-κB pathways in HT-29 cells, but these two pathways act simultaneously activating common genes, such as, some SLC and ABC transporters. Our preliminary results from studies with an in vivo murine model of colitis, suggest that HIF-1is stabilized and OCTN1 is strongly induced during severe inflammation, which can be relevant for a recovery from the inflammatory process. We have also been interested in the distribution of HIF-1α variants among different ethnic groups as well as their contribution for cancer risk. Thus, we have demonstrated that there is an ethnicity-related variation in the frequency of the C1772T (P582S) single nucleotide polymorphism (SNP) in the HIF-1α gene. Furthermore, we performed a case-control study in a breast cancer population and our results suggest that there is no association between this SNP or the rare G1790A (A588T) SNP and the incidence of breast cancer. Taken together, the results obtained in this study contribute to a better knowledge of drug influx and efflux during hypoxia and inflammation as well as to the understanding of the pharmacogenetic variability of the HIF-1.

Beryllium-7 sorption to inorganic particles in Tahsis Inlet, Nootka Sound, B.C.

Senior thesis written for Oceanography 445

Red cell PMVs, plasma membrane-derived vesicles calling out for standards

Plasma membrane-derived vesicles (PMVs) or microparticles are vesicles (0.1–1 μm in diameter) released from the plasma membrane of all blood cell types under a variety of biochemical and pathological conditions. PMVs contain cytoskeletal elements and some surface markers from the parent cell but lack a nucleus and are unable to synthesise macromolecules. They are also defined on the basis that in most cases PMVs express varying amounts of the cytosolic leaflet lipid phosphatidylserine, which is externalised during activation on their surface. This marks the PMV as a biologically distinct entity from that of its parent cell, despite containing surface markers from the original cell, and also explains its role in events such as phagocytosis and thrombosis. There is currently a large amount of variation between investigators with regard to the pre-analytical steps employed in isolating red cell PMVs or RPMVs (which are slightly smaller than most PMVs), with key differences being centrifugation and sample storage conditions, which often leads to result variability. Unfortunately, standardization of preparation and detection methods has not yet been achieved. This review highlights and critically discusses the variables contributing to differences in results obtained by investigators, bringing to light numerous studies of which RPMVs have been analysed but have not yet been the subject of a review.

Determination of tartaric acid in wines by FIA with tubular tartrate-selective electrodes

A flow injection analysis (FIA) system comprising a tartrate- (TAT) selective electrode has been developed for determination of tartaric acid in wines. Several electrodes constructed for this purpose had a PVC membrane with a complex of quaternary ammonium and TAT as anion exchanger, a phenol derivative as additive, and a more or less polar mediator solvent. Characterization of the electrodes showed behavior was best for membranes with o-nitrophenyl octyl ether as solvent. On injection of 500 μL into a phosphate buffer carrier (pH = 3.1; ionic strength 10–2 mol/L) flowing at 3 mL/min, the slope was 58.06 ± 0.6 with a lower limit of linear range of 5.0 × 10–4 mol/L TAT and R2 = 0.9989. The interference of several species, e.g. chloride, bromide, iodide, nitrate, gallic acid, tannin, sucrose, glucose, fructose, acetate, and citrate, was evaluated in terms of potentiometric selectivity coefficients. The Hofmeister series was followed for inorganic species and the most interfering organic ion was citrate. When red and white wines were analyzed and the results compared with those from an independent method they were found to be accurate, with relative standard deviations below 5.0%.

New and low cost plastic membrane electrode with low detection limits for sulfadimethoxine determination in aquaculture waters

Sulfadimethoxine (SDM) is one of the drugs, often used in the aquaculture sector to prevent the spread of disease in freshwater fish aquaculture. Its spread through the soil and surface water can contribute to an increase in bacterial resistance. It is therefore important to control this product in the environment. This work proposes a simple and low-cost potentiometric device to monitor the levels of SDM in aquaculture waters, thus avoiding its unnecessary release throughout the environment. The device combines a micropipette tip with a PVC membrane selective to SDM, prepared from an appropriate cocktail, and an inner reference solution. The membrane includes 1% of a porphyrin derivative acting as ionophore and a small amount of a lipophilic cationic additive (corresponding to 0.2% in molar ratio). The composition of the inner solution was optimized with regard to the kind and/or concentration of primary ion, chelating agent and/or a specific interfering charged species, in different concentration ranges. Electrodes constructed with inner reference solutions of 1 × 10−8 mol/L SDM and 1 × 10−4 mol/L chromate ion showed the best analytical features. Near-Nernstian response was obtained with slopes of −54.1 mV/decade, an extraordinary detection limit of 7.5 ng/mL (2.4 × 10−8 mol/L) when compared with other electrodes of the same type. The reproducibility, stability and response time are good and even better than those obtained by liquid contact ISEs. Recovery values of 98.9% were obtained from the analysis of aquaculture water samples.

A label-free DNA aptamer-based impedance biosensor for the detection of E. coli outer membrane proteins

A label-free DNA aptamer-based impedance biosensor for the detection of E. coli outer membrane proteins (OMPs) was developed. Two single stranded DNA sequences were tested as recognition elements and compared. The aptamer capture probes were immobilized, with and without 6-mercapto-1-hexanol (MCH) on a gold electrode. Each step of the modification process was characterized by Faradaic impedance spectroscopy (FIS). A linear relationship between the electron-transfer resistance (Ret) and E. coli OMPs concentration was demonstrated in a dynamic detection range of 1 × 10−7–2 × 10−6 M. Moreover, the aptasensor showed selectivity despite the presence of other possible water contaminates and could be regenerated under low pH condition. The developed biosensor shows great potential to be incorporated in a biochip and used for in situ detection of E. coli OMPs in water samples.