Charakterisierung und Analyse der geschlechtsbestimmenden Region von Chironomus riparius

Die durch eine männchenspezifisch auftretende heterochromatische Bande und ein hemizygotes Cla-Element-Cluster gekennzeichnete geschlechtsbestimmende Region („sex determining region“: SDR) auf Chromosom III von C. riparius stellt ein frühes Stadium in der Evolution von Geschlechtschromosomen dar. Diese eindeutig lokalisierte chromosomale Region, die den molekular noch unbekannten männchen¬bestimmenden Faktor M enthalten muss, ist im Vergleich zu den Y-Chromosomen anderer Dipterenarten wie unter anderem M. domestica, die ebenfalls einen dominanten Männchenbestimmer besitzen, relativ klein. Aus diesem Grund bietet die SDR von C. riparius eine Möglichkeit, den männchenbestimmenden Faktor einzugrenzen und zu identifizieren. In der vorliegenden Arbeit konnte ein Bereich einer Größe von ca. 200 kb aus der SDR von C. riparius charakterisiert und analysiert werden. Durch bioinformatische Sequenzanalysen konnten an 20 Stellen der SDR mögliche Genstrukturen nachgewiesen werden. Von den gefundenen möglichen Genen ist bisher die Funktion in C. riparius unbekannt. Bei den Genen mit vermuteter Funktion deutet nichts eindeutig auf eine Beteiligung an der Geschlechtsbestimmung von C. riparius hin. Da allerdings davon auszugehen ist, dass für die Funktion des Männchenbestimmers M ein Gen rekrutiert wurde, welches zur Interaktion mit dem nachgeschalteten Gen der Geschlechts¬bestimmungskaskade fähig ist, muss die geschlechtsbestimmende Funktion des Gens M nicht unbedingt offensichtlich sein. Aus geschlechtsbestimmenden Genkaskaden anderer Dipteren bekannte Gene wie transformer und doublesex konnten im analysierten Bereich nicht nachgewiesen werden, obwohl zumindest zu doublesex homologe Gene im Genom von C. riparius vorkommen. Um möglicherweise proto-X- und proto-Y-Chromosom miteinander vergleichen zu können und einen Hinweis auf die chromosomale Herkunft der analysierten Sequenzen aus der SDR zu erlangen, wurden Sequenzen von 31 teilweise parallel liegenden BAC-Klonen aus der untersuchten Region verglichen. Dabei zeigte sich, dass die Klone zwei Gruppen bilden, deren Sequenzen sich durch 500 SNPs und 110 Indels unterschiedlicher Größe (1-800 Bp) unterscheiden, was für eine Herkunft von zwei sich erst seit kurzer Zeit unterscheidenden Geschlechtschromosomen spricht. Die zwölf größten dieser Indels wurden auf geschlechtsspezifische Unterschiede hin untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Unterschiede zwischen den beiden Klongruppen zwar im 30 Jahre alten Laborstamm, der auch für die Konstruktion der durchsuchten BAC-Bibliotheken verwendet wurde, tatsächlich geschlechtsspezifisch sind, in zwei Wildfangpopulationen jedoch keine derartige Geschlechtsspezifität aufweisen. Somit kann keine Aussage zur Herkunft der untersuchten Klone aus der SDR von C. riparius getroffen werden, und es bleibt unklar, ob die analysierten Sequenzen vom proto-X oder vom proto-Y-Chromosom stammen.

Identification and genetic diversity in phytoplasmas associated with diseases of cassava and other agronomic relevant crops in south-east Asia and Latin America

Identification and genetic diversity of phytoplasmas infecting tropical plant species, selected among those most agronomically relevant in South-east Asia and Latin America were studied. Correlation between evolutionary divergence of relevant phytoplasma strains and their geographic distribution by comparison on homologous genes of phytoplasma strains detected in the same or related plant species in other geographical areas worldwide was achieved. Molecular diversity was studied on genes coding ribosomal proteins, groEL, tuf and amp besides phytoplasma 16S rRNA. Selected samples infected by phytoplasmas belonging to diverse ribosomal groups were also studied by in silico RFLP followed by phylogenetic analyses. Moreover a partial genome annotation of a ‘Ca. P. brasiliense’ strain was done towards future application for epidemiological studies. Phytoplasma presence in cassava showing frog skin (CFSD) and witches’ broom (CWB) diseases in Costa Rica - Paraguay and in Vietnam – Thailand, respectively, was evaluated. In both cases, the diseases were associated with phytoplasmas related to aster yellows, apple proliferation and “stolbur” groups, while only phytoplasma related to X-disease group in CFSD, and to hibiscus witches’ broom, elm yellows and clover proliferation groups in CWB. Variability was found among strains belonging to the same ribosomal group but having different geographic origin and associated with different disease. Additionally, a dodder transmission assay to elucidate the role of phytoplasmas in CWB disease was carried out, and resulted in typical phytoplasma symptoms in periwinkle plants associated with the presence of aster yellows-related strains. Lethal wilt disease, a severe disease of oil palm in Colombia that is spreading throughout South America was also studied. Phytoplasmas were detected in symptomatic oil palm and identified as ‘Ca. P. asteris’, ribosomal subgroup 16SrI-B, and were distinguished from other aster yellows phytoplasmas used as reference strains; in particular, from an aster yellows strain infecting corn in the same country.

Untersuchungen zu Migration, Homing und Effektor-Funktionen humaner T-Lymphozyten in NOD.Cg-Prkdc scid Il2r gtm1Wjl, SzJ-Mäusen im Rahmen der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation

Die akute myeloische Leukämie (AML) zählt zu den aggressivsten neoplastischen Erkrankungenrnder Hämatopoese. Die Mehrheit der Patienten mit AML erreicht nach Induktions-rnChemotherapie den Zustand der kompletten Remission, jedoch erleiden mehr als die Hälfterndieser Patienten anschließend einen Rückfall und versterben an den Folgen der Erkrankungrn[1]. Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (engl.: hematopoietic stem cellrntransplantation, HSCT) stellt die einzig putativ kurative Behandlungsform für rezidierendernPatienten und solche mit schlechter Prognose dar. Jedoch birgt diese Form der Therapiernauch eine Vielzahl an Risiken. Insbesondere das Auftreten einer akuten Transplantat-gegen-rnWirt-Erkrankung (engl.: graft-versus-host disease, GvHD) stellt die Hauptursache für transplantationsassoziierternMortalität und Morbidität dar [2]. Die Depletion von alloreaktiven zytotoxischenrnT Lymphozyten (CTL) aus dem Transplantat ermöglicht zwar die Prävention derrnEntstehung einer GvH-Erkrankung, jedoch häufig unter gleichzeitigem Verlust des förderlichen,rnanti-leukämischen Transplantat-gegen-Leukämie-Effekts (engl.: graft-versus-leukemia,rnGvL) [3]. Um den GvL-Effekt unter Vermeidung einer GvH-Erkrankung zu erhalten, bietetrnsich der gezielte adoptive Transfer von Leukämie-spezifischen, nicht alloreaktiven CTL alsrnattraktive Strategie der Immuntherapie für AML-Patienten nach allogener HSCT an. In derrnvorliegenden Arbeit konnte erfolgreich ein prä-klinisches murines AML-Modell unter Einsatzrndes stark immundefizienten NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ- (NSG-) Mausstamms und primärenrnAML-Blasten durch die Optimierung bereits publizierter Protokolle etabliert werden.rnBei zehn von 17 transplantierten primären AML-Proben konnte ein erfolgreiches Engraftmentrnder humanen Zellen und eine Rekonstitution der humanen Neoplasie in den NSG-Mäusenrnerzielt werden. Die Engraftment-Rate betrug somit 58,82% und lag etwas unter dem aus derrnLiteratur bekannten Wert von 65-70% [4, 5]. Es ließen sich gut, intermediär und schlecht anwachsendernAML-Proben anhand der Engraftment-Stärke und -Reproduzierbarkeit voneinanderrnunterscheiden. Anhand der Analyse von für das Engraftment kritischer Parameter konnternein Zusammenhang zwischen Engraftment-Rate in der Maus und Flt3-Mutationsstatus sowiernFAB-Klassifikation des Patienten hergestellt und somit Angaben aus der Literatur bestätigtrnwerden. Für zwei Patienten-spezifische AML-Modelle, MZ580 und MZ308, konnten in vitrornerfolgreich AML-reaktive, über einzelne bzw. duale HLA-Diskrepanzen restringierte CTLPopulationenrngeneriert und über einen Zeitraum von bis zu 70 Tagen expandiert werden.rnDeren adoptiver Transfer in zuvor mit humanen AML-Blasten inokulierte NSG-Mäuse führternzu einer nahezu vollständigen Eradikation der AML-Blasten und Remission der Versuchstiere.rnAnhand unterschiedlich langer in vitro Kultur-Zeiträume konnte ein für die in vivo ausgeübtenrnEffektor-Funktionen optimaler Reifungszustand der CTL-Populationen von maximalrn28 Tagen bestimmt werden. Die kinetische Analyse der lytischen Aktivität in vivo deutete auf eine relativ schnelle Ausübung der Effektor-Funktionen durch die CTL-Populationen innerhalbrnvon zwei bis 24 Stunden nach adoptivem Transfer hin. Durch die Verwendung von inrnvitro generierten EBV-reaktiven CTL aus einem irrelevanten Spender konnte zudem die Spezifitätrnder in vivo ausgeübten Effektor-Funktionen nachgewiesen werden. Die ex vivo Re-rnIsolation adoptiv transferierter CTL und deren in vitro Analyse in einem IFNγ ELISpot wiesrneine konstante Reaktivität der Zellen ohne Induktion einer Xeno-Reaktivität nach. Die zurrnVerbesserung der Persistenz humaner CTL-Populationen eingesetzten autologen CD4+ TrnZellen zeigten nur im AML MZ308-System eine positive Wirkung. Generell konnte die Persistenzrnin vivo jedoch trotz initialer Substitution mit den Zytokinen IL-2 und IL-7 nicht über einenrnZeitraum von sieben Tagen hinaus aufrechterhalten werden.rnZur Untersuchung des Extravasations-Mechanismus humaner T Zellen über murines Endothelrnwurden sowohl Flusskammer- als auch Transwell-Studien durchgeführt, um die molekularenrnGrundlagen des Adhäsions- und Transmigrationsprozesses aufzuklären. Durch denrnparallelen Einsatz humaner und muriner T Zellen auf murinen Endothelzellen unter Zusatzrnfunktionsblockierender monoklonaler Antikörper konnte gezeigt werden, dass derrnExtravasations-Mechanismus beider Spezies auf Interaktionen homologer Adhäsionsmolekül-rnPaare, nämlich VLA-4–VCAM-1 und LFA-1–ICAM-1, beruht. Für einzelne Moleküle konntenrnin Abhängigkeit der eingesetzten Endothelzellen Unterschiede in der Funktionalität zwischenrnden Spezies identifiziert werden. Der Adhäsionsprozess war durch die Blockade derrnVLA-4–VCAM-1-Interaktion stärker inhibierbar als durch die Blockade von LFA-1–ICAM-1.rnDie Transmigration hingegen war durch die Blockade beider Adhäsionsmolekül-Paare vergleichbarrnstark inhibierbar.

Variabilita' ed evoluzione dei prioni: Mutabilita' in vitro

I prioni, privi di acidi nucleici, esistono come ceppi e possono mutare, in particolare quando attraversano una barriera di specie. Numerosi studi convergono sulla conclusione che le caratteristiche ceppo-specifiche siano inscritte nella conformazione della PrPSc, con la variabilità di ceppo associata a varianti conformazionali della PrPSc. In questo studio ci siamo avvalsi del PMCA, tecnica che riproduce in vitro molti aspetti della biologia dei prioni, per mettere a punto condizioni sperimentali di replicazione che permettessero di osservare fenomeni di mutazione e selezione, onde investigare i meccanismi molecolari e di popolazione alla base della mutabilità dei prioni. In condizioni di replicazione eterologa, che mima la trasmissione tra diverse specie, è stato inizialmente possibile identificare un mutante difettivo della scrapie, caratterizzato da una diversa conformazione della PrPSc e capace di replicare in vitro ma non più in vivo. Le condizioni in cui tale mutante è emerso hanno permesso di sviluppare ulteriori ipotesi di lavoro, basate sul concetto della quasi-specie. Impartendo diversi regimi di replicazione e seguendo l’evoluzione di due ceppi, è stato possibile evidenziare fenomeni di mutazione anche in condizioni di replicazione omologa, in assenza di forti pressioni selettive. In entrambi i ceppi sono emerse varianti conformazionali di PrPSc durante passaggi replicativi ad ampia popolazione, mentre le popolazioni sottoposte a ripetuti colli di bottiglia hanno mostrato un rapido declino del tasso di replicazione. Sono stati infine investigati l’efficacia e il potenziale mutageno di molecole anti-prioniche, ottenendo importanti risultati preliminari sull’efficacia di molecole che legano la PrPC. Questi risultati evidenziano come la mutabilità sia una caratteristica intrinseca dei prioni e supportano l’idea che i prioni siano molto variabili, similmente alle quasi-specie virali, e perciò adattabili e proni a fenomeni di mutazione e selezione. Tali conclusioni hanno impatto su problematiche sanitarie quali lo studio del potenziale zoonotico e i fenomeni di farmaco-resistenza dei prioni.