« Annalles et cronicques du pays et conté de Laval et parties circonvoysines, » par Guillaume LE DOYEN. (1537).

Contient : Justification par Jean Petit de l'assassinat du duc d'Orléans par le duc de Bourgogne, en 1407. Incomplet du commencement. (Cf. Chronique de Monstrelet, t. I, p. 179-242) ; Réponse à la susdite justification de Jean Petit

Pièces relatives à l'histoire de la MAISON D'AUVERGNE (XIIe-XVIIe siècle). II Notes et copies de pièces parmi lesquelles on remarque les suivantes :

Contient : Hommage de Béraud, dauphin d'Auvergne, et de Bertrand de La Tour à l'abbé de Cluny (1376-1394), feuillets d'un registre sur papier de la fin du XIVe siècle ; Mémoire donné au roi, le 15 novembre 1694, sur l'illustration de la famille de Bouillon ; Extraits d'une ancienne généalogie des comtes de Boulogne ; Extrait de la chronique généalogique des seigneurs de Chauvigny ; « Extrait du calendrier des tesmoins vieux et valétudinaires produits par M. le duc de Berry... contre Morinot de Tourzel, seigneur d'Alegre, au mois juillet 1414 » ; Extrait des titres de Turenne ; « Extrait des comptes d'Oliergues, commençant en 1329. » ; Listes de titres communiqués à de Bar par Baluze ; Extraits des titres à l'abbaye du Bouchet (1192-1505) ; Extraits des titres et des obituaires de Brioude ; Lettre de M. d'Anfreville (6 sept. 1708) ; Armoiries diverses envoyées à Baluze et (f. 92) lettre de M. Mantaigue, de Vic-le-Comte (9 octobre 1703) ; Lettre de David, prieur de l'abbaye du Bouchet, s. d ; Copie de lettres de [Gui] Allard relatives à la maison de La Tour du Pin (1698) et de la réponse de Baluze ; Lettre de [Gui] Allard (Grenoble, 10 février 1698) ; Lettre de M. Estienne (14 octobre 1701) ; Comptes de gravures d'armoiries par l'histoire de la maison d'Auvergne

Genetic and maternal contributions to offspring viability under different environmental conditions in various salmonids

Summary : Due to anthropogenic impacts and natural fluctuations, fish usually have to cope with constantly changing and often hostile environments. Whereas adult fish have various possibilities to counteract unfavourable environmental conditions, embryos have much fewer options. Besides by their developing immune system, they are protected by the egg envelopes and several immune substances provided by their mothers. In addition to this, they may also adjust their hatching timing in reaction to various risks. However, individuals may vary in their defensive potential. This variation may be either based on their genetics and/or on differential maternal investments and may be dependent on the experienced stress. Nevertheless, in fish, the impact of such parental contributions on embryo and/or juvenile viability is still poorly investigated. The main objective of this thesis was to investigate the importance of paternal (i.e. genetic) and maternal (i.e. genetic + egg investment) contributions to offspring viability under different environmental conditions and at different life stages. In order to investigate this, we used gametes of various salmonids for in vitro fertilisation experiments based on full-factorial breeding designs. The individual studies are summarised in the following chapters: In the first chapter, we tested the effectiveness of the embryonic immune system in Lake whitefish (Coregonus palaea). Namely, we investigated paternal and maternal contributions to the embryos' tolerance to different kinds of pathogen exposure. Additionally, we tested whether an early sub-léthal exposure has a positive or a negative effect on an embryo's susceptibility to later pathogen exposures with the same pathogen. We found that pre-challenged embryos were more susceptible to future challenges. Moreover, pathogen susceptibility was dependent on maternal investments and/or the embryos' own genetics, depending on the challenge level. Chapter 2 summarises a similar study with brown trout (Salmo trutta). In addition to the previously described investigations, we analysed if genetic effects on offspring viability are mediated either by parental MHC genotypes or relatedness based on neutral microsatellite markers, and we tested if males signal their genetic quality either by their body size or their melanin-based skin colouration. We found that embryo survival was lower at higher stress levels and dependent on the embryos' genetics. Addirionally, parents with similar and/or, very common MHC genotypes had higher offspring viabilities. Finally, darker males produced more viable offspring. In the first two chapters we investigated the embryos' defensive potential based on their immune system, i.e. their pathogen tolerance. In chapter 3 we investigate whether hatching timing of Lake whitefìsh (C. palaea) is dependent on parental contributions and/or on pathogen pressure, and whether there are parental-environmental interactions. We found that whitefish embryos hatch earlier under increasing pathogen pressure. Moreover, hatching timing was affected by embryo genetics and/or maternally provided resources, but the magnitude of the effect was dependent on the pathogen. pressure. We also found a significant paternal-environmental interaction, indicating that the hatching efficiency of a certain sib group is dependent on the pathogen environment. Chapter 4 describes an analogous study with brown trout (S. trutta), with similar findings. In the former chapters, we only looked at offspring performance during the embryonic period, and only under semi-natural conditions. In chapter 5 we now test the performance and viability of embryonic and juvenile brown trout (S. trutta) under natural conditions. To measure embryo viability, we put them in brood boxes, buried them in the gravel of a natural river, and analysed survival after several months. To investigate juvenile survival and performance, wé reared embryos under different stress levels in the laboratory and subsequently released the resulting hatchlings in to a closed river section. Juvenile size and survival was then determined one year later. Additionally, we investigated if sires differ in their genetic quality, determined by embryo and juvenile survival as well as juvenile size, and if they signal their quality by either body size or melanin-based body darkness. We found hat juvenile size was dependent on genetic effects and on maternal investment, whereas this was neither the case for embryo nor for juvenile survival. Additionally, we found that offspring of darker males grew larger, and larger juveniles had also an increased survival. Finally, we found acarry-over effect of the early non-lethal challenge: exposing embryos to higher stress levels resulted in smaller juveniles. To evaluate the long-term performance of differently treated groups, mark-recapture studies are inevitable. For this purpose, effective mass-marking techniques are essential. In chapter 6 we tested the suitability of the fluorescent pigment spray marking method for the mass marking of European graylings (Thymallus thymallus), with very promising results. Our in vitro fertilisation studies on whitefish may reveal new insights on potential genetic benefits of mate choice, but the mating system of whitefish under natural conditions is still poorly investigated. In order to study this, we installed underwater cameras at the spawning place of a Coregonus suidteri population, recorded the whole mating period and subsequently analysed the recordings. Confirmations of previous findings as well as exciting new observations are listed and discussed in chapter 7. Dus aux impacts anthropogéniques et aux fluctuations naturelles, les poissons doivent faire face à des environnements en perpétuel changement. Ces changements font que les poissons doivent s'adapter à de nouvelles situations, souvent hostiles pour eux. Les adultes ont différentes possibilités d'échapper à un environnement peu favorable, ce n'est par contre pas le cas des embryons. Les embryons sont protégés d'une part par leur système immunitaire en développement, d'autre part, par la coquille de l'eeuf et différentes substances immunitaires fournies par leur mère. De plus, ils sont capables d'influencer leur propre date d'éclosion en réponse à différents facteurs de stress. Malgré tout, les individus varient dans leur capacité à se défendre. Cette variation peut être basé sur des facteurs génétiques et/ou sur des facteurs maternels, et est dépendante du stress subi. Néanmoins, chez les poissons, l'impact de telles contributions parentales sur la survie d'embryons et/ou juvéniles est peu étudié. L'objectif principal de cette thèse a été d'approfondir les connaissances sur l'importance de la contribution paternelle (c.a.d. génétique) et maternelle (c.a.d. génétique + investissement dans l'oeuf) sur la survie des jeunes dans différentes conditions expérimentales et stades de vie. Pour faire ces analyses, nous avons utilisé des gamètes de divers salmonidés issus de croisements 'full-factorial'. Les différentes expériences sont résumées dans les chapitres suivants: Dans le premier chapitre, nous avons testé l'efficacité du système immunitaire des embryons chez les corégones (Coregonus palea). Plus précisément nous avons étudié la contribution paternelle et maternelle à la tolérance des embryons à différents niveaux de stress pathogène. Nous avons aussi testé, si une première exposition non létale à un pathogène avait un effet positif ou négatif sur la susceptibilité d'un embryon a une deuxième exposition au même pathogène. Nous avons trouvé que des embryons qui avaient été exposés une première fois étaient plus sensibles au pathogène par la suite. Mais aussi que la sensibilité au pathogène était dépendante de l'investissement de la mère et/ou des gènes de l'embryon, dépendamment du niveau de stress. Le deuxième chapitre résume une étude similaire avec des truites (Salmo truffa). Nous avons examiné, si la survie des jeunes variait sous différentes intensités de stress, et si la variance observée était due aux gènes des parents. Nous avons aussi analysé si les effets génétiques sur la survie des juvéniles étaient dus au MHC (Major Histocompatibility Complex) ou au degré de parenté des parents. De plus, nous avons analysé si les mâles signalaient leur qualité génétique par la taille du corps ou par leur coloration noire, due à la mélanine. On a trouvé que la survie des embryons était plus basse quand le niveau de stress était plus haut mais que la variation restait dépendante de la génétique des embryons. De plus, les parents avec des MHC similaires et/ou communs avaient des embryons avec une meilleure survie. Par contre, des parents avec un degré de parenté plus haut produisent des embryons avec une survie plus mauvaise. Finalement nous avons montré que les mâles plus foncés ont des embryons qui survivent mieux, mais que la taille des mâles n'a pas d'influence sur la survie de ces mêmes embryons. Dans les deux premiers chapitres, nous avons étudié le potentiel de défense des embryons basé sur leur système immunitaire, c.a.d. leur tolérance aux pathogènes. Dans le troisième chapitre, nous nous intéressons à la date d'éclosion des corégones (C. palea), pour voir si elle est influencée par les parents ou par la pression des pathogènes, et si il y a une interaction entre ces deux facteurs. Nous avons trouvé que les jeunes naissent plus rapidement lorsque la pression en pathogènes augmente. La date d'éclosion est influencée par la génétique des embryons et/ou l'investissement des parents, mais c'est la magnitude des effets qui est dépendante de la pression du pathogène. Nous avons aussi trouvé une interaction entre l'effet paternel et l'environnement, ce qui indique que la rapidité d'éclosion de certains croisements est dépendante des pathogènes dans l'environnement. Le chapitre 4 décrit une étude analogue avec de truites (S. truffa), avec des résultats sitzimilaires. Dans les précédents chapitres nous nous sommes uniquement concentrés sur les performances des jeunes durant leur stade embryonnaire, et seulement dans des conditions semi naturelles. Dans le chapitre 5 nous testons la performance et la viabilité des embryons et de juvéniles de truites (S. truffa) dans des conditions naturelles. Nous avons trouvé que la taille des juvéniles était dépendante d'effets génétiques et de l'investissement maternel, mais ceci n'était ni les cas pour les survie des embryons et des juvéniles. De plus, nous avons trouvé que les jeunes des mâles plus foncés devenaient plus grands et que les grands ont un meilleur taux de survie. Finalement nous avons trouvé un 'carry-over effect' d'une première exposition non létale à un pathogène: exposer des embryons à des plus hauts niveaux de stress donnait des juvéniles plus petits. Pour évaluer la performance à long terme de groupes traités dé manières différentes, une méthode de marquage-recapture est inévitable. Pour cette raison, des techniques de marquage en masse sont nécessaires. Dans le chapitre 6, nous avons testé l'efficacité de la technique `fluorescent pigment spray marking' pour le marquage en masse de l'Ombre commun (Thymallus thymallus), avec des résultats très prometteurs. Les études de fertilisations in vitro avec les corégones nous donnent une idée du potentiel bénéfice génétique que représente la sélection d'un bon partenaire, même si le système d'accouplement des corégones en milieu naturel reste peu connu. Pour combler cette lacune, nous avons installé des caméras sous-marines autour de la frayère d'une population de corégones (C. suidteri), nous avons enregistré toute la période de reproduction et nous avons analysé les données par la suite. Ainsi, nous avons été capables de confirmer bien des résultats trouvés précédemment, mais aussi de faire de nouvelles observations. Ces résultats sont reportés dans le septième chapitre, où elles sont comparées avec des observations antérieures.

IRF6 is a mediator of the Notch pro-differentiation and tumour suppressive function in keratinocytes

I. Résumé large publicIRF6 est un médiateur de Notch dans la différenciation des kératinocytes et dans sa fonction de suppresseur de tumeursLa peau est l'organe le plus important du corps humain, elle représente chez l'adulte une surface d'environ 1,5 m2 et elle est composée de 2000 milliards de cellules. La peau est composée de plusieurs types cellulaires dont les kératinocvtes. Ces cellules, qui se trouvent dans la couche la plus externe de la peau (Pépiderme), nous protègent de la déshydratation et des agressions externes telles que les infections et rayons ultraviolets. Cette fonction de « barrière » est mise en place grâce à un processus appelé différenciation des kératinocvtes durant lequel les kératinocytes deviennent matures et finalement meurent pour former la couche cornée la plus externe difficilement pénétrable. L'homéostasie tissulaire est un mécanisme qui régule l'équilibre entre prolifération, différentiation et mort cellulaire. Une perturbation de cet équilibre peut mener à la formation d'une tumeur. Il existe différents types de tumeurs de la peau. Nous nous sommes intéressés aux «carcinomes spino-cellulaires» (SCC) qui se développent à partir des keratinocytes en différenciation. Notch est une molécule impliquée positivement dans la différenciation des kératinocytes et joue un rôle prépondérant dans la suppression des tumeurs kératinocytaires comme les SCC dans lesquelles Notch est faiblement exprimé. L'implication de Notch dans la différenciation et dans la carcinogenèse kératinocytaire n'est plus controversée, mais les mécanismes qui sont à la base de ces fonctions restent encore à élucider. IRfF6 est une protéine qui, d'après sa structure, a été classée parmi une famille de régulateurs de la défense de l'organisme (IRFs). Des études ultérieures ont montré qu'IRf 6 n'a pas de rôle dans la réponse immunitaire mais qu'il est plutôt impliqué dans le développement de l'épiderme. Dans ce travail, nous avons établi que, dans les kératinocytes, l'expression d'IPJF6 est contrôlé par Notch et que, comme pour ce dernier, elle est réduite dans les SCCs. De plus, nous avons observé qu'IRF6 régule les mêmes gènes que Notch, et qu'il est en effet un médiateur de la fonction de Notch dans la différenciation des kératinocytes. Parmi les gènes contrôlés par l'axe Notch-IRF6 il y en a trois qui sont sur-exprimés dans les SCCs et qui sont réprimés par cet axe. Il s'agit d'une part d'IRF3 et IRF7, deux autres membres de la famille IRF, et du récepteur EGFR (Epidermal growth factor receptor), un oncogène (un gène impliqué dans l'accélération de la formation de tumeurs). Dans leur ensemble, ces découvertes nous informent sur les mécanismes impliqués dans les fonctions pro-differentiatrice et tumeur suppressive de Notch. Plus encore, elles ouvrent des perspectives intéressantes quant au développement de nouvelles approches thérapeutiques dans le traitement des cancers.II. RésuméLa voie de signalisation de Notch joue un rôle très important dans la différenciation cellulaire et dans la carcinogenèse de nombreux tissus. Dans les kératinocytes, elle agit comme suppresseur de tumeurs, fonction altérée dans les cancers spino cellulaires SCC (tumeurs kératinocytaires) de part la perte d'expression de Notch.Bien que les fonctions pro-différenciatrice et tumeur-suppressive de la voie de signalisation de Notch soient aujourd'hui reconnues, les mécanismes sous-jacents restent à explorer.Dans ce travail, nous montrons qu'IRF6, un membre de la famille des régulateurs de la voie de l'interféron (IRF), ne possédant pas de rôles dans la réponse immunitaire mais essentiel dans le développement de l'épiderme, est d'autant plus exprimé que le kératinocytes sont différenciées alors que son expression est drastiquement diminuée dans les SCC. De façon intéressante, l'expression d'IRF6 durant la différenciation kératinocytaire est directement contrôlée par Notch.Dans les kératinocytes l'expression accrue d'IRP6 a les mêmes effets que 1'activation de la voie de Notch induisant les marqueurs de différentiation des couches supra-basales de l'épiderme et inhibant ceux de la couche basale impliqués dans la prolifération cellulaire. Cependant IRF6 n'est pas impliqué dans la régulation d'autres cibles de Notch, comme p21WAFI/CiP' et Hesl. Comme Notch, IRF6 contrôle négativement l'expression de EGFR et IRF3/7. De ce fait EGFR et IRF3 et IRF7 sont fortement exprimés dans les SCCs humaines où l'expression de Notch et IRF6 est fortement réduite.En conclusion, nous avons démontré qu'IRF6 est une cible directe de Notch/CSL dans les keratinocytes qui medie les effets "non-canonique" de cette voie de signalisation dans la différentiation et dans la suppression tumorale.III. SummaryThe Notch pathway is an important regulator of differentiation and carcinogenesis. In keratinocytes it acts as tumour suppressor and the Notch gene is markedly reduced in keratinocyte-derived squamous cell carcinoma (SCC). While the pro-differentiation and tumour suppressive functions of Notch signalling in keratinocytes are well established, the underlying mechanisms are still poorly understood, We report here that Interferon Regulatory Factor 6 (IRF6), an IRF family member with an essential role in epidermal development, is downmodulated in SCC and is induced in differentiating cells. We observed that the induction of IRF6 in differentiating keratinocytes is suppressed by Notch inhibition. IRF6 expression is also decreased in mice with keratinocyte-specific deletion of the Notch 1/2.Moreover we show that the expression of this gene is induced by Notch activation through a CSL-dependent mechanism even under conditions of protein synthesis inhibition, with endogenous Notch 1 binding to the IRF6 promoter.Increased IRJF6 expression is necessary for the impact of Notch activation on differentiation markers K1 and Involucrin, and proliferation markers integrins and p63, but not on other "canonical" Notch targets like p21WAF1/Cipl, Hes1 and Hey1. Like Notch 1, IRF6 down-modulates expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) as well as two other IRF family members, IRF3 and 7, which we previously linked to positive control of p63 expression. Expression of IRF3, IRF7 and EGFR is enhanced in cutaneous squamous cell carcinomas, illustrating a strikingly opposite pattern compared to Notch and IRF6.Thus, IRF6 is a primary Notch target in keratinocytes, which mediates the effects of this pathway on differentiation and contributes to tumor suppression.

Subthalamic nucleus deep brain stimulation for Parkinson's disease : "Are we where we think we are ?

ABSTRACT High frequency electrical deep brain stimulation (DBS) of the subthalamic nucleus (STN) is a worldwide recognized therapy for the motor symptoms of Parkinson's disease in fluctuating patients who are progressively disabled despite medical treatment adjustments. However, such improvements emerge despite a lack of understanding of either the precise role of STN in human motor control or the mechanism(s) of action of DBS. Through the question "are we where we think we are", this thesis is first dedicated to the control of the position of the preoperatively defined target and of the implanted electrodes on magnetic resonance imaging (MRI). This anatomical approach will provide a way to identify more precisely the structure(s) involved by electrical stimulation. Then, a study of the correlation existing between the position of the preoperative target and the position of the electrode is performed. In this part, a unique opportunity is given to identify factors that may affect these correlation results. Finally, the whole work represents a « quality assessment » of the crucial steps of STN DBS: first, the target and the implanted electrode localisation procedures that have been developed in collaboration with the Radiological department; second the implantation procedure that has been performed nowadays on more than 50 parkinsonian patients in the Neurosurgical department of the Centre Hospitalier Universitaire Vaudois in collaboration with the Neurological department. This work is especially addressed to the multidisciplinary medical team involved in the surgical treatment of movement disorders, including also neurophysiologists, neuropsychologists and psychiatrists. RESUME La stimulation électrique à haute fréquence du noyau sous-thalamique est à ce jour mondialement reconnue pour le traitement des symptômes moteurs de la maladie de Parkinson chez des patients sévèrement atteints et chez qui la réponse fluctuante au traitement médicamenteux ne peut être améliorée de façon satisfaisante. Cependant, les résultats observés surviennent malgré une compréhension approximative et controversée du rôle réel du noyau sous-thalamique dans le contrôle du mouvement volontaire aussi bien que des mécanismes d'action de la stimulation cérébrale profonde. A travers la question « sommes-nous où nous pensons être », cette thèse est tout d'abord consacrée à l'étude du contrôle de la position de la cible définie avant l'intervention et de la position des électrodes implantées sur l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Cette approche anatomique permettra d'identifier plus précisément la (les) structure(s) influencées par la stimulation électrique. Ensuite, une étude de la corrélation existant entre la position de la cible préopératoire et la position des électrodes implantées est effectuée. Elle a pour but de mettre en évidence les facteurs influençant les résultats de cette corrélation. Enfin, le travail dans son ensemble est un « contrôle de qualité » des étapes cruciales de la stimulation du noyau sous-thalamique : premièrement, des méthodes de localisation de la cible et des électrodes implantées effectuées sur IRM, développées en collaboration avec le service de Radiologie ; deuxièmement, de la méthode d'implantation utilisée à ce jour chez plus de 50 patients dans le service de Neurochirurgie du Centre Hospitalier Universitaire Vaudois en collaboration avec le service de Neurologie. Ce travail s'adresse spécialement aux équipes médicales pluridisciplinaires impliquées dans le traitement chirurgical des mouvements anormaux, incluant également des neurophysiologistes, des neuropsychologues et des psychiatres.

New insights into the role of microRNAs in pancreatic ß-cell maturation and plasticity

Le diabète est une maladie chronique caractérisée par une élévation du taux de sucre dans le sang aussi appelé « glycémie » reflétant un état pathologique. L'élévation de la glycémie au long cours a des répercussions délétères sur nombreux de nos tissus et organes d'où l'apparition de complications sévères chez les sujets diabétiques pouvant atteindre les yeux, les reins, le système nerveux, le système cardiovasculaire et les membres inférieurs. La carence en une hormone essentielle à notre organisme, l'insuline, est au coeur du développement de la maladie. L'insuline induit la captation du glucose circulant dans le sang en excès suite à une prise alimentaire riche en glucides et favorise son utilisation et éventuellement son stockage dans les tissus tels que le foie, le tissu adipeux et les muscles. Ainsi, l'insuline est vitale pour réguler et maintenir stable notre niveau de glycémie. Les cellules bêta du pancréas sont les seules entités de notre corps capables de produire de l'insuline et une perte de fonctionnalité associée à leur destruction ont été mises en cause dans le processus pathologique du diabète de type 2. Cependant la pleine fonctionnalité et la maturation des cellules bêta n'apparaissent qu'après la naissance lorsque le pancréas en développement a atteint sa masse adulte définitive. Enfin, une fois la masse des cellules bêta définitive établie, leur nombre et volume restent relativement constants au cours de la vie adulte chez un sujet sain. Néanmoins, au cours de périodes critiques les besoins en insuline sont augmentés tel qu'observé chez les femmes enceintes et les personnes obèses qui ont une perte de sensibilité à l'insuline qui se traduit par la nécessité de sécréter plus d'insuline afin de maintenir une glycémie normale. Dans l'hypothèse où la compensation n'a pas lieu ou n'est pas aboutie, le diabète se développe. Le processus de maturation postnatale ainsi que les événements compensatoires sont donc des étapes essentielles et de nombreuses questions sont encore non résolues concernant l'identification des mécanismes les régulant. Parmi les acteurs potentiels figurent de petites molécules d'ARN découvertes récemment appelées microARNs et qui ont été rapidement suggérées très prometteuses dans l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans le cadre du diabète et d'autres pathologies. Les microARNs vont réguler l'expression de notre génome sans en modifier la séquence, phénomène également appelé épigénétique, ce qui résulte en des différences de comportement et de fonction cellulaires. Les microARNs sont donc susceptibles de jouer un rôle clé dans l'ensemble des processus biologiques et notre environnement associé à nos prédispositions génétiques peuvent grandement modifier leur niveau et donc leur action, qui à son tour se répercutera sur notre état physiologique. En effet nous avons identifié des changements de microARNs dans les cellules d'îlots pancréatiques de modèles animaux (rats et souris) associés à un état de résistance à l'insuline (grossesse et obésité). Par le biais d'expériences in vitro sur des cellules bêta extraites de rats et conservées en culture, nous avons pu analyser de plus près l'implication des microARNs dans la capacité des cellules bêta à sécréter de l'insuline mais aussi à se multiplier et à survivre au sein d'un environnement toxique. Ainsi, nous avons identifié des microARNs qui participent positivement à la compensation des cellules bêta, sous la direction d'hormones telles les estrogènes ou d'une hormone libérée par l'intestin au cours de la digestion (l'inerétine GLP1) et qui est largement utilisée comme agent thérapeutique dans la médication contre le diabète. Dans un second temps nous avons utilisé une stratégie similaire afin de déterminer le rôle de microARNs préalablement détectés comme étant changés au cours du développement postnatal des cellules bêta chez le rat. Cette étude a également mené à l'identification de microARNs participant à la maturation et à l'expansion de la masse des cellules bêta sous l'influence de la composition du régime alimentaire et des besoins en insuline adéquats qui en dépendent. Ces études apportent la vision de nouveaux mécanismes moléculaires impliquant les microARNs et démontrant leur importance pour le bon fonctionnement des cellules bêta et leur capacité d'adaptation à l'environnement. -- Les cellules bêta sont une composante des îlots pancréatiques de Langerhans et sont des cellules hautement différenciées qui ont l'unique capacité de sécréter de l'insuline sous l'influence des nutriments suite à une prise alimentaire. L'insuline facilite l'incorporation de glucose dans ses tissus cibles tels le foie, le tissu adipeux et les muscles. Bien que les besoins en insuline soient relativement constants au cours de la vie d'un individu sain, certaines conditions associées à un état de résistance à l'insuline, telles la grossesse ou l'obésité, requièrent une libération d'insuline majorée. En cas de résistance à l'insuline, une dysfonction des cellules bêta plus ou moins associée à leur mort cellulaire, conduisent à une sécrétion d'insuline insuffisante et au développement d'une hyperglycémie chronique, caractéristique du diabète de type 2. Jusqu'à présent, les mécanismes moléculaires sous- jacents à la compensation des cellules bêta ou encore menant à leur dysfonction restent peu connus. Découverts récemment, les petits ARNs non-codant appelés microARNs (miARNs), suscitent un intérêt grandissant de par leur potentiel thérapeutique pour la prise en charge et le traitement du diabète. Les miARNs sont de puissants régulateurs de l'expression génique qui lient directement le 3'UTR de leurs ARN messagers cibles afin d'inhiber leur traduction ou d'induire leur dégradation, ce qui leur permet de contrôler des fonctions biologiques multiples. Ainsi, nous avons pris pour hypothèse que les miARNs pourraient jouer un rôle essentiel en maintenant la fonction des cellules bêta et des processus compensatoires afin de prévenir le développement du diabète. Lors d'une première étude, une analyse transcriptomique a permis l'identification de miARNs différemment exprimés au sein d'îlots pancréatiques de rattes gestantes. Parmi eux, le miR-338-3p a démontré la capacité de promouvoir la prolifération et la survie des cellules bêta exposées à des acides gras saturés et des cytokines pro-inflammatoires, sans altérer leur propriété sécrétrice d'insuline. Nous avons également identifié deux hormones reconnues pour leurs propriétés bénéfiques pour la physiologie de la cellule bêta, l'estradiol et l'incrétine GLP1, qui régulent les niveaux du miR-338-3p. Ce miARN intègre parfaitement les voies de signalisation de ces deux hormones dépendantes de l'AMP cyclique, afin de contrôler l'expression de nombreux gènes conduisant à son action biologique. Dans un projet ultérieur, notre objectif était de déterminer la contribution de miARNs dans l'acquisition de l'identité fonctionnelle des cellules bêta en période postnatale. En effet, directement après la naissance les cellules bêta sont reconnues pour être encore immatures et incapables de sécréter de l'insuline spécifiquement en réponse à l'élévation de la glycémie. Au contraire, la réponse insulinique induite par les acides aminés ainsi que la biosynthèse d'insuline sont déjà fonctionnelles. Nos recherches ont permis de montrer que les changements de miARNs corrélés avec l'apparition du phénotype sécrétoire en réponse au glucose, sont régis par la composition nutritionnelle du régime alimentaire et des besoins en insuline qui en découlent. En parallèle, le taux de prolifération des cellules bêta est considérablement réduit. Les miARNs que nous avons étudiés coordonnent des changements d'expression de gènes clés impliqués dans l'acquisition de propriétés vitales de la cellule bêta et dans la maintenancé de son identité propre. Enfin, ces études ont permis de clairement démontrer l'importance des miARNs dans la régulation de la fonction des cellules bêta pancréatiques. -- Beta-cells are highly differentiated cells localized in the pancreatic islets and are characterized by the unique property of secreting insulin in response to nutrient stimulation after meal intake. Insulin is then in charge of facilitating glucose uptake by insulin target tissues such as liver, adipose tissue and muscles. Despite insulin needs stay more or less constant throughout life of healthy individuals, there are circumstances such as during pregnancy or obesity which are associated to insulin resistance, where insulin needs are increased. In this context, defects in beta-cell function, sometimes associated with beta-cell loss, may result in the release of inappropriate amounts of insulin leading to chronic hyperglycemia, properly defined as type 2 diabetes mellitus. So far, the mechanisms underlying beta- cell compensation as well as beta-cell failure remain to be established. The recently discovered small non-coding RNAs called microRNAs (miRNAs) are emerging as interesting therapeutic targets and are bringing new hope for the treatment of diabetes. miRNAs display a massive potential in regulating gene expression by directly binding to the 3'UTR of messenger RNAs and by inhibiting their translation and/or stability, enabling them to modify a wide range of biological functions. In view of this, we hypothesized that miRNAs may play an essential role in preserving the functional beta-cell mass and permitting to fight against beta-cell exhaustion and decompensation that can lead to diabetes development. In a first study, global profiling in pancreatic islets of pregnant rats, a model of insulin resistance, led to the identification of a set of differentially expressed miRNAs. Among them, miR-338- 3p was found to promote beta-cell proliferation and survival upon exposure of islet cells to pro- apoptotic stimuli such as saturated fatty acids or pro-inflammatory cytokines, without impairment in their capacity to release insulin. We also discovered that miR-338-3p changes are driven by two hormones, the estradiol and the incretin GLP1, both well known for their beneficial impact on beta- cell physiology. Consistently, we found that miR-338-3p integrates the cAMP-dependent signaling pathways regulated by these two hormones in order to control the expression of numerous genes and execute its biological functions. In a second project, we aimed at determining whether miRNAs contribute to the acquisition of beta-cell identity. Indeed, we confirmed that right after birth beta-cells are still immature and are unable to secrete insulin specifically in response to elevated concentrations of glucose. In contrast, amino acid-stimulated insulin release as well as insulin biosynthesis are already fully functional. In parallel, newborn beta-cells are proliferating intensively within the expanding pancreas. Interestingly, we demonstrated that the miRNA changes and the subsequent acquisition of glucose responsiveness is influenced by the diet composition and the resulting insulin needs. At the same time, beta-cell proliferation declines. The miRNAs that we have identified orchestrate expression changes of essential genes involved in the acquisition of specific beta-cell properties and in the maintenance of a mature beta-cell identity. Altogether, these studies clearly demonstrate that miRNAs play important roles in the regulation of beta-cell function.

Multisensory Integration and Perceptual Enhancement

We perceive our environment through multiple sensory channels. Nonetheless, research has traditionally focused on the investigation of sensory processing within single modalities. Thus, investigating how our brain integrates multisensory information is of crucial importance for understanding how organisms cope with a constantly changing and dynamic environment. During my thesis I have investigated how multisensory events impact our perception and brain responses, either when auditory-visual stimuli were presented simultaneously or how multisensory events at one point in time impact later unisensory processing. In "Looming signals reveal synergistic principles of multisensory integration" (Cappe, Thelen et al., 2012) we investigated the neuronal substrates involved in motion detection in depth under multisensory vs. unisensory conditions. We have shown that congruent auditory-visual looming (i.e. approaching) signals are preferentially integrated by the brain. Further, we show that early effects under these conditions are relevant for behavior, effectively speeding up responses to these combined stimulus presentations. In "Electrical neuroimaging of memory discrimination based on single-trial multisensory learning" (Thelen et al., 2012), we investigated the behavioral impact of single encounters with meaningless auditory-visual object parings upon subsequent visual object recognition. In addition to showing that these encounters lead to impaired recognition accuracy upon repeated visual presentations, we have shown that the brain discriminates images as soon as ~100ms post-stimulus onset according to the initial encounter context. In "Single-trial multisensory memories affect later visual and auditory object recognition" (Thelen et al., in review) we have addressed whether auditory object recognition is affected by single-trial multisensory memories, and whether recognition accuracy of sounds was similarly affected by the initial encounter context as visual objects. We found that this is in fact the case. We propose that a common underlying brain network is differentially involved during encoding and retrieval of images and sounds based on our behavioral findings. - Nous percevons l'environnement qui nous entoure à l'aide de plusieurs organes sensoriels. Antérieurement, la recherche sur la perception s'est focalisée sur l'étude des systèmes sensoriels indépendamment les uns des autres. Cependant, l'étude des processus cérébraux qui soutiennent l'intégration de l'information multisensorielle est d'une importance cruciale pour comprendre comment notre cerveau travail en réponse à un monde dynamique en perpétuel changement. Pendant ma thèse, j'ai ainsi étudié comment des événements multisensoriels impactent notre perception immédiate et/ou ultérieure et comment ils sont traités par notre cerveau. Dans l'étude " Looming signals reveal synergistic principles of multisensory integration" (Cappe, Thelen et al., 2012), nous nous sommes intéressés aux processus neuronaux impliqués dans la détection de mouvements à l'aide de l'utilisation de stimuli audio-visuels seuls ou combinés. Nos résultats ont montré que notre cerveau intègre de manière préférentielle des stimuli audio-visuels combinés s'approchant de l'observateur. De plus, nous avons montré que des effets précoces, observés au niveau de la réponse cérébrale, influencent notre comportement, en accélérant la détection de ces stimuli. Dans l'étude "Electrical neuroimaging of memory discrimination based on single-trial multisensory learning" (Thelen et al., 2012), nous nous sommes intéressés à l'impact qu'a la présentation d'un stimulus audio-visuel sur l'exactitude de reconnaissance d'une image. Nous avons étudié comment la présentation d'une combinaison audio-visuelle sans signification, impacte, au niveau comportementale et cérébral, sur la reconnaissance ultérieure de l'image. Les résultats ont montré que l'exactitude de la reconnaissance d'images, présentées dans le passé, avec un son sans signification, est inférieure à celle obtenue dans le cas d'images présentées seules. De plus, notre cerveau différencie ces deux types de stimuli très tôt dans le traitement d'images. Dans l'étude "Single-trial multisensory memories affect later visual and auditory object recognition" (Thelen et al., in review), nous nous sommes posés la question si l'exactitude de ia reconnaissance de sons était affectée de manière semblable par la présentation d'événements multisensoriels passés. Ceci a été vérifié par nos résultats. Nous avons proposé que cette similitude puisse être expliquée par le recrutement différentiel d'un réseau neuronal commun.

PH01 gene family in Arabidopsis thaliana and Physcomitrella patens

Summary Inorganic phosphate (Pi) is a main limiting nutrient to the growth and production yield of plants in many agro-ecosystems. Plants have evolved a series of metabolic and developmental adaptations to cope with low Pi availability. PH01 has been identified as a protein involved in the loading of Pi into the xylem of roots in Arabidopsis. In this study, the PHO1 gene family in both higher plant Arabidopsis and lower plant Physcomitrella was characterized. Additional ten PHO1 homologues in Arabidopsis and three homologues in Physcomitrella were identified. All proteins harbor a SPX tripartite domain in the N-terminal hydrophilic portion and an EXS domain in the highly conserved C-terminal hydrophobic portion. RT-PCR analysis of the Arabidopsis PHO1 genes revealed a broad pattern of expression in leaves, roots, stems, and flowers for most genes, although two genes are expressed exclusively in flowers, indicating their potential roles not only in Pi transport but also in Pi homeostasis within the Arabidopsis plant. The regulation of gene expression by different nutrient-starvations showed that some genes are strongly up-regulated by elements other than Pi, e.g. by NO3, Mg, and Zn starvation. Northern blot and RT-PCR analysis showed distinct expression patterns of the three Physcomitrella PHO1 genes. The investigation of Pi starvation effects on some Pi-deprivation responsive genes demonstrates that Physcomitrella has evolved a similar mechanism as higher plants to respond to Pi deficiency. Promoter activity analysis for the Physcomitrella PHO1 family genes using promoter-GUS fusions revealed their expression in protonemata and gametophores but at different levels and with different patterns, suggesting these genes may play distinct roles in Pi transport and/or Pi homeostasis in the moss plant. Single knockout mutants of the three genes were generated by gene targeting and one of them displayed a reduced Pi content in the protonemata under Pi starvation. The evolution of the PHO1 family in land plants was also discussed. Together, these findings indicate that the PHO1 family genes, present in a broad range of plant species from lower plants to flowering plants, play important roles in Pi transport and homeostasis. Résumé Le phosphate inorganique (Pi) est un nutriment essentiel à la croissance des plantes et au rendement de la production végétale. Dans beaucoup d'agro-écosystèmes, ce nutriment est limitant. Les plantes ont développé des adaptations métaboliques et développementales pour palier à la faible disponibilité du Pi. Il a été démontré que la protéine PHOI est indispensable au transfert du Pi dans le xylème des racines d' Arabidopsis. Cette étude porte sur la famille de gènes définie par PHO1 ; ceci, dans deux organismes modèles : la plante Arabidopsis pour les végétaux supérieurs, et la mousse Physcomitrella pour les végétaux inférieurs. Dix homologues à PHOI dans Arabidopsis et trois homologues dans Physcomitrella ont été identifiés. Toutes les protéines encodées présentent un domaine tripartite SPX dans leur partie N terminale hydrophile et un domaine EXS dans la partie C terminale hydrophobe hautement conservée d'entre eux. L'analyse par RT-PCR de l'expression des gènes PHO1 dans Arabidopsis révèle une expression ectopique pour la plupart, à l'exception de deux gènes dont l'expression est uniquement florale ; ceci suggère l'implication de cette famille non seulement dans le transport mais aussi dans l'homéostasie du Pi dans Arabidopsis. L'observation de l'expression de ces gènes en fonction de l'absence de différents nutriments montre que certains gènes sont fortement régulés lors de carences en NO3, Mg et Zn. L'analyse par northern blot et RT-PCR met en évidence des profils d'expression distincts pour les trois gènes de Physcomitrella. Les effets de la carence en Pi sur Physcomitrella ont été étudiés par le biais de gènes dépendants connus pour Arabidopsis, les résultats suggèrent un mode de réponse à cette carence conservé entre les végétaux inférieurs et supérieurs. La localisation tissulaire de l'expression de la famille PHO1 dans la mousse a été étudiée au moyen du gène rapporteur GUS fusionné aux différents promoteurs. Ceci a révélé leur expression dans les protonemata et les gametophores, mais à des intensités et avec des profils différents, ce qui suggère des implications distinctes dans le transport et/ou l'homéostasie du Pi dans la mousse. Des simples mutants knockout ont été générés pour chaque gène de mousse ; l'un d'eux présente une diminution du contenu protonemal en Pi lorsque soumis à une carence en Pi. L'évolution de la famille PHO1 dans les plantes terrestres est également discutée. Ensemble, ces résultats indiquent que les gènes de la famille PHO1 sont présents dans une large gamme de plantes allant des végétaux inférieurs aux supérieurs, et cette étude démontre que leur conservation se justifie potentiellement par le fait qu'ils sont probablement impliqués dans des mécanismes conservés de transport et d'homéostasie du Pi.

Active smoking and the risk of type 2 diabetes : a systematic review and meta-analysis

Rapport de synthèse : Introduction : plusieurs études observationnelles suggèrent qu'il existe une association entre le tabagisme actif et l'incidence du diabète de type 2. Toutefois de telles études n'ont jamais été synthétisées de façon systématique. Objectif : conduire une revue systématique avec meta-analyse des études évaluant l'association entre le tabagisme actif et l'incidence du diabète de type 2. Méthode : nous avons effectué une recherche dans les bases de donnée électroniques MEDLINE et EMBASE de 1966 à mai 2007, et l'avons complétée par une recherche manuelle des bibliographies des articles clés retenus ainsi que par la recherche d'abstracts de congrès scientifiques et le contact d'experts. Pour être inclues dans notre revue, les études devaient avoir un design de type cohorte, reporter un risque de glycémies jeun élevée, d'intolérance au glucose ou de diabète de type 2 en relation avec le statut tabagique des participants lors du recrutement et devaient exclure les sujets avec un diabète au début de l'étude. Deux auteurs ont sélectionné de façon indépendante les études et ont extrait les données. Les risques relatifs de diabète étaient ensuite compilés, utilisant un modèle de type « random effect ». Résultats : la recherche a aboutit à 25 études de cohorte prospectives (N=1'165'374 participants) et a reporté en tout 45'844 cas de diabète de type 2 pendant une durée de suivi s'étendant sur 5 à 30 années. Sur les 25 études, 24 reportaient un risque augmenté de diabète chez les fumeurs par comparaison aux non fumeurs. Le risque relatif (RR) commun de toutes les études était de 1.44 (intervalle de confiance (IC) à 95% : 1.31-1.58). Le risque de diabète était plus élevé chez les fumeurs de plus de 20 cigarettes par jour (RR : 1.61, IC 95% : 1.43-1.80) en comparaison aux fumeurs ayant une consommation inférieure (RR : 1.29, IC 95% : 1.13-1.48) et le risque était moindre pour les anciens fumeurs (RR :1.23; IC 95% : 1.14-1.33) comparé aux fumeurs actifs. Ces éléments parlent en faveur d'un effet dose-réponse et donc d'une relation de causalité, sans pour autant la prouver. Conclusion : notre étude révèle que le tabagisme actif est associé avec un risque augmenté de 44% de diabète de type 2. Des recherches futures sont nécessaires pour évaluer si cette association est causale et pour clarifier les mécanismes d'action. Dans l'intervalle, les professionnels de santé devraient mentionner l'éviction du diabète comme une raison supplémentaire d'arrêter de fumer ou de ne pas commencer à fumer.

Rôle des molécules de co-stimulations et de CD93 dans la différenciation en plasmocytes

Le développement des cellules B est constitué d'une première phase qui se déroule dans la moelle en absence d'antigène et d'une deuxième phase qui se déroule dans les organes lymphoïdes secondaires et qui débute uniquement en présence d'antigène. Cette deuxième partie est extrêmement importante et doit être très bien régulée pour lutter efficacement contre les pathogènes, ainsi que pour éviter de nombreuses maladies de type auto-immunes. Ce travail est basé à l'origine sur l'étude de souris mutantes dans lesquelles une protéine des cellules T est modifiée, impliquant une très forte activation des cellules B en absence d'antigène et de manière non spécifique. Ces souris constituent donc un outil de travail très intéressant pour étudier tout d'abord le mécanisme aboutissant à l'activation des cellules B dans ce contexte particulier. De plus comme ces souris contiennent énormément de cellules sécrétant des anticorps, à savoir les plasmocytes, il est facile d'étudier leur phénotype. Cela nous a permis de démontrer qu'un récepteur membranaire, CD93 est exprimé à leur surface. Cette observation a ensuite été confirmée dans des souris normales, de type sauvage. L'utilisation de ce marqueur de surface nous a permis de caractériser plus en détail les étapes du développement des plasmocytes. De plus nous avons tenté de trouver la fonction jouée par cette molécule à la surface de ces cellules, en utilisant des souris dans lesquelles ce récepteur a été supprimé. Si les premières étapes de l'activation des cellules B étaient normales, ces souris n'étaient par contre pas capables de produire des anticorps à long-terme dans le sang. Nous avons pu montrer que la survie des plasmocytes en l'absence de CD93 est moins efficace dans la moelle, probablement du au fait qu'en absence de cette molécule, les plasmocytes ont plus de difficultés à adhérer dans ce que l'on appelle des niches de survie. Nous avons essayé ensuite de déterminer si CD93 peut être utilisé comme cible thérapeutique dans le cadre de maladies auto-immunes ou de lymphomes. Bien que CD93 soit exprimé à la surface des cellules d'intérêt dans les souris souffrant de lupus, il n'a pas été possible de les éliminer avec un anticorps dirigé contre CD93. De plus nous n'avons pas pu mettre en évidence l'expression de CD93 à la surface des plasmocytes humains induits in vitro. SUMMARY : Antigen dependent B cell activation is a key aspect of the adaptive immunity which is involved in the efficient response against pathogens, but also in vaccination and in numerous pathologies. The aim of this project was to investigate two key aspects of the late B cell development, namely the role of costimulatory molecules in the immunological synapse between T and B cells and the characterization of a new plasma cell marker, CD93. This work was initially based on the study of the LatY136F mutant mouse. The latter harbors a point mutation in the LAT adaptor protein which is involved in T cell receptor signaling. As a consequence of this mutation, CD4 T cells in the periphery expand strongly and are polarized in a TH2 manner leading to a normal but exaggerated B cell response. For this reason, these mice provide a useful tool to investigate different aspects of the late B cell development. The first part of the project was focused on the role played by costimulatory molecules in LotY136F CD4 T cell mediated B cell activation. In vitro studies showed that CD80/CD86, IL-4 and LFA-1 were required for LatY136FT cells to activate B cells whereas CD40 and IcosL were not necessary. In vivo we showed that CD80/CD86 was required for initial T cell expansion whereas CD40 and IcosL deficiency led to a less efficient B cell activation. The large amount of plasma cells present in LatY136F mice allows investigating in more details their phenotype and CD93 was found to be expressed on their surface, This observation was confirmed in wild type B cells activated either in vivo or in vitro with T-independent or T-dependent antigens. Moreover we found that CD93 expression can occur either before CD138/Blimp-1 induction or after, showing that two independent pathways can lead to the formation of CD93/CD138 double positive population, which was shown to be the more mature. Indeed, their phenotype correlated with modified transcriptional network, high isotype switched antibody secretion and cell cycle arrest. Analysis of CD93 deficient mice demonstrated that the initial B cell activation after immunization was normal, but also showed that these mice failed to maintain a high antibody secretion level at later time points both after primary and boost immunization. This was shown to be due to a less efficient survival of the long-lived plasma cells in the bone marrow niches, most likely related with a defective adhesion process in absence of CD93. We investigated the possibility to use CD93 as a target to treat plasma cell pathologies, but even if this molecule is expressed on cells of interest in the bone marrow of lupus mice, it was not possible to deplete them using anti-CD93 antibodies. Moreover we were not able to show its expression on the surface of in vitro activated B cells and multiple myeloma cell lines of human origin. In conclusion, our data helped understand both the mechanisms leading to the polyclonal B cell activation occurring in the LatY136F KI mouse and the role played by CD93 on the surface of plasma cells, which could potentially open the way to therapeutic application.

Functional diversity of CD8+ T-cell subsets in chronic infection

Certains pathogènes tels que le virus de l'hépatite C ainsi que le virus de l'immunodéficience humaine sont capables de détourner les mécanismes de défense du système immunitaire adaptatif afin d'établir des infections chroniques chez l'homme. La souche clone-13 du virus de la chorioméningite lymphocytaire est utilisée comme modèle d'études d'infection virale chronique chez la souris. Les raisons qui expliqueraient la persistance de certains virus ne sont pas encore bien définies. Toutefois, il a été montré qu'une exposition prolongée à un environnement inflammatoire ainsi que la présence prolongée de l'antigène sont des facteurs qui vont déclencher un procédé de différentiation particulier des lymphocytes T CD8+. Ces cellules sur-expriment alors des récepteurs inhibiteurs tels que PD-1 tandis que leur capacité à produire des cytokines diminue. Ce procédé de différentiation est appelé « exhaustion » et serait à l'origine de la génération de réponses lymphocytaires non ou peu fonctionnelles entraînant de ce fait la persistance de l'infection. Néanmoins, il a également été démontré que ces lymphocytes maintiennent des fonctions effectrices et qu'ils permettent de limiter la réplication du virus. Afin d'étudier la fonction effectrice résiduelle de ces lymphocytes T, nous avons transféré des cellules provenant de souris infectées chroniquement dans des souris receveuses naïves qui ont à leur tour été infectées avec le virus. Grâce à ces expériences, nous avons démontré que les cellules transférées contiennent des cellules qui sont capables de i) re-proliférer, ii) de protéger les souris contre une infection virale, et de iii) survivre en l'absence d'antigène. Nous avons remarqué que les cellules stimulées de façon chronique maintiennent le même phénotype lorsqu'elles sont transférées dans des souris naïves soumises à une infection virale aiguë. Nous avons de ce fait conclu que les cellules stimulées chroniquement contiennent une sous-population de cellules qui comporte des attributs de cellules T mémoire. D'autre part, nous avons pu identifier le facteur de transcription Tcf-1 comme l'élément essential pour la génération des cellules T ressemblant à des cellules mémoires. D'autre part, nous avons étudié l'impact du niveau de stimulation via le récepteur des cellules T (TCR) sur le phénotype adopté par les lymphocytes T au cours d'une infection chronique. Dans ce but, nous avons généré des souches de virus recombinants qui expriment un épitope modifié de manière à réduire le niveau de stimulation via le TCR. D'autre part, nous avons utilisé un mélange de deux souches virales de manière à moduler spécifiquement la quantité d'un épitope tout en conservant la même charge virale. Nous avons montré que la quantité d'antigène avait plus d'influence sur le phénotype des lymphocytes T que la force d'interaction entre le complexe peptide-CMH et le TCR. De plus, l'apparition de ce phénotype ne semble pas avoir d'impact sur la prolifération des cellules en réponse à une infection primaire ou secondaire. Ainsi, nous proposons un modèle par lequel le procédé d'« exhaustion » des cellules T correspond à une différentiation cellulaire particulière qui est indépendante de la capacité de prolifération des cellules. De manière générale, ces découvertes apportent de nouvelles connaissances sur les sous-catégories de lymphocytes T CD8+ qui sont générés pendant une infection virale chronique. Nous pensons que la réponse effectrice du système immunitaire est maintenue pendant de longues périodes grâce à la présence de cellules par partagent certaines caractéristiques avec des cellules mémoires. L'étude approfondie de ces cellules peut avoir des implications importantes sur l'optimisation des stratégies utilisant l'immunothérapie pour combattre les infections chroniques et cancers.

Analysis of viral- and tumor antigen-specific CD4 T cell responses in healthy donors and melanoma patients

Résumé Des tentatives pour développer des traitements anti-cancéreux basés sur l'utilisation d'antigènes tumoraux ont commencé il y a plus de 10 ans. Depuis quelques années, un certain intérêt s'est portée sur une sous-population particulière des cellules du système immunitaire, les lymphocytes T CD4. Ces cellules jouent un rôle central dans les réponses immunitaires tant contre les virus que contre les cellules tumorales. Comme d'autres lymphocytes T, ces cellules sont activées de manière spécifique en reconnaissant un morceau d'antigène, appelé peptide. Ces peptides proviennent soit de protéines des cellules de l'hôte, soit des protéines étrangères (virus ou bactéries) soit de cellules transformées (cellules tumorales) et sont présentés aux lymphocytes T par des molécules du soi appelées CMH (complexe majeur d'histocompatibilité). Dans le cas des lymphocytes T CD4, ces molécules sont plus précisément des molécules du CMH de classe II (CMH II). Mis à part l'intérêt porté aux réponses médiées par les lymphocytes T cytotoxiques, un intérêt croissant pour les lymphocytes T CD4 s'est développé à cause de la place centrale qu'occupent ces cellules dans les réponses immunitaires. L'identification d'épitopes présentés par des molécules du CMH de classe II dérivés d'un grand nombre d'antigènes tumoraux, ainsi que le développement de techniques permettant de suivre les réponses immunitaires, offre des opportunités pour étudier de manière quantitative et qualitative les lymphocytes T CD4 spécifiques pour un antigène particulier chez des patients cancéreux. De plus, ces épitopes permettent d'induire des réponses médiées par les lymphocytes T CD4 et CD8 chez ces mêmes patients. Dans ce travail, notre premier but était de valider l'utilisation de multimères formés par des complexes peptide:molécules de CMH de class II (pCMH II) pour quantifier la réponse des cellules T CD4 dirigée contre l'épitope HA307-319 dérivé de la protéine hémaglutinine du virus de la grippe et présenté par HLA-DRB1*0401. En analysant des échantillons provenant de volontaires sains ayant reçus un vaccin contre la grippe, nous avons pu démontrer une expansion et une activation transitoires des lymphocytes T CD4 spécifiques pour le peptide HA307-319 après vaccination. De plus, les multimères pCMH II nous ont permis d'analyser plus en détails hétérogénéité des cellules T CD4 spécifiques pour le peptide HA307-319 présents dans le sang périphérique d'individus sains. Par la suite, notre but a été d'analyser les réponses des lymphocytes T CD4 spécifiques pour l'antigène Melan-A chez des patients atteints de mélanome métastatique. Nous avons tout d'abord démontré la présence de cellules T CD4 spécifiques pour l'épitope Melan-A51-73, présenté par HLA-DRBl*0401, qui avait déjà été préalablement décrit. Ensuite, nous avons décrit et caractérisé 2 nouveaux peptides issus de Melan-A qui sont présentés aux cellules T CD4 par différentes molécules du CMH de clans II. Des cellules spécifiques pour ces deux épitopes ont été trouvées chez 9/ 16 patients analysés. De plus, des multimères pCMH II chargés avec un des épitopes nous ont permis de détecter ex vivo des lymphocytes T CD4 spécifiques pour Melan-A dans le sang périphérique d'un patient atteint de mélanome. Mis ensemble, tous ces résultats suggèrent une potentielle utilisation des multimères pCMH II pour analyser en détail les lymphocytes T CD4 spécifiques d'antigènes définis. Cependant, le suivi ex vivo de telles cellules ne semble être possible que dans des cas bien particuliers. Néanmoins, les nouveaux épitopes issus de Melan-A et présentés par des molécules du CMH de classe II que nous avons décrits dans cette étude aideront à étudier plus en détails les lymphocytes T CD4 spécifiques pour Melan-A chez des patients atteints de mélanome, un sujet d'étude sur lequel peu de résultats sont à ce jour disponibles. Summary Attempts to develop cancer vaccines based on molecularly defined tumorassociated antigens were initiated more than 10 years ago. Apart from CTLmediated anti-tumor immunity, interests are. now focused on CD4 T cells that are central players of immune responses. The identification of MHC class-II-restricted epitopes from numerous tumor antigens together with the development of monitoring tools offers the opportunity to quantitatively and qualitatively study antigen-specific CD4 T lymphocytes in cancer patients and to induce both CTL and T helper responses in cancer patients. In this work, we first aimed at validating the use of peptide:MHC class II complex (pMHC II) multimers to quantitate the CD4 T cell response against the hemagglutinin-derived epitope HAso~-si9 from influenza virus presented by HLA-DRBl*0401. By analysing samples from healthy volunteers vaccinated with ananti-influenza vaccine, we could demonstrate a transient expansion and activation of HA-specific CD4 T cells after treatment. Moreover, pMHC II multimers helped us to study the heterogeneity of HAspecific CD4 T cells found in peripheral blood of healthy individuals. Then, we aimed to analyse Melan-A-specific CD4 T cell responses in metastatic melanoma patients. We first demonstrated the presence of CD4 T cells specific for the previously described Melan-A51_73 epitope presented by HLA-DRB 1 *0401 in peripheral blood of those patients. Second, we described and characterised 2 new Melan-A-derived peptides that are presented by different MHC II molecules to CD4 T cells. Specific cells for these epitopes were found in 9/ 16 rnelánoma patients analysed. In addition, pMHC II multimers loaded with one of the two epitopes allowed us to detect ex vivo Melan-A-specific CD4 T cells in peripheral blood of a melanoma patient. Together, these results suggest a potential use of pMHC II multimers in analysing in detail antigen-specific CD4 T cells. However, ex vivo monitoring of such cells will be possible only in particular conditions. Nevertheless, the new Melan-A-derived MHC II-restricted epitopes described here will help to study in more detail Melan-A-specific CD4 T cells in melanoma patients, a field where only scarce data are available.

Les sociétés d'état industrielles et commerciales togolaises face aux mutations socio-économiques contemporaines : le cas de Togo Télécom

Résumé L'étude de l'adaptation d'une entreprise aux mutations socio-économiques affectant son environnement sociétal donc de sa régulation, requiert de prime abord de comprendre et de caractériser ces mutations. I1 importe ensuite de déterminer les actions et stratégies déployées par cette entreprise en réponse aux pressions environnementales, ainsi que leurs éventuelles retombées sur les caractéristiques de l'environnement qui ont suscité ces réponses. Pour prendre part à cette réflexion, nous nous concentrons sur les conditions d'adaptation de la société d'État Togolaise :Togo Télécom, et nous tentons de confronter la réalité de cette évolution aux différents modèles de l'adaptation élaborés par la théorie des organisations. Une analyse concrète des enjeux soulevés par l'environnement de Togo Télécom et de leurs implications pour la société et pour la Nation a été réalisée au sein de l'organisation. Elle a pris appui sur les documents écrits pertinents à la recherche et sur le recueil des avis et perceptions des acteurs politiques, économiques, syndicaux et institutionnels concernés par l'avenir de l'entreprise. Les résultats indiquent que la société a su globalement entreprendre une réforme interne bénéfique qui lui a permis de faire face aux nouvelles réalités de son environnement malgré le boulet de la dette, tout en s'assurant l'attachement et le support de ses parties prenantes. Cette réforme a pu être mise en place notamment grâce à la remarquable capacité d'adaptation de ces parties prenantes et elle a également été à l'origine de la création d'un "réseau "redéfinissant l'organisation du travail sur le marché ainsi que les rôles, les problèmes et les caractéristiques de l'environnement sociétal. Afin de replacer cette relation particulière dans la théorie des organisations, la présente recherche s'applique à montrer comment le modèle de l'entreprise dominée par son environnement permet d'enrichir notre compréhension des solutions déployées par l'entreprise pour s'adapter; il est ici question d'analyser les comportements et réponses de la société à la lumière des principaux modèles théoriques, afin d'une part de déterminer comment chacun se prête à l'analyse d'un cas pratique et d'autre part de faire ressortir les forces et faiblesses de chaque modèle afin de tendre vers un modèle plus intégratif des réalités de notre cas. Dans cet ordre d'idée, notre recherche à l'instar de Morin (i98z) et de Giddens (1987), nous indique entre autres qu'il est primordial de ne pas isoler la théorie des organisations, dans des visions trop unilatérales, avec des points de vue partiels, mais d'adhérer à la réalité linéaire de la récursivité de l'adaptation des sociétés d'État industrielles et commerciales Africaines car ces organisations possèdent des propriétés spécifiques qui dépassent l'univers des ressources, des compétences ou des jeux d'acteurs qui les composent (Morin (198?)).

Evaluation of the immune response to infection with metastatic and non-metastatic "Leishmania guyanensis" parasites

ABSTRACT : Les infections par le parasite Leishmania guyanensis se caractérisent par une dissémination depuis le site initial d'infection jusqu'aux tissus naso-pharyngés, responsable de la Leishmaniose à lésions secondaires muco-cutanées (LMC). Les lésions des patients atteints de LMC montrent une massive infiltration de cellules immunitaires, une réponse immunitaire élevée et la présence de parasites (bien qu'en très faible quantité). La LMC engendre une augmentation de l'expression de TNFa ainsi qu'un défaut dans le contrôle de la réponse immunitaire caractérisé par une absence de réponse à l'IL 10. La réponse immunitaire de l'hôte ainsi que la virulence du parasite sont deux facteurs reconnus pour le contrôle de l'infection. Le mécanisme de la pathogenèse de la LMC restent grandement incompris, surtout le mécanisme de dissémination de l'infection du site d'inoculation jusqu'aux sites secondaires d'infection (métastases) ainsi que les détails de la réponse de l'hôte contre le pathogène. Dans un modèle d'infection d' hamsters avec des parasites du Nouveau Monde, la classification des parasites Leishmania se fait en fonction de leur capacité à développer des métastases. Ce modéle d'infection a permis de caractériser différentes souches de parasites selon la classification de l'Organisation Mondiale de la Sante (OMS) tel que la souche de référence W>É-II/BR/78/M5313 qui est reconnue comme hautement métastatique alors que ces clones dérivés de M5313 montrent de grandes variations quand a leur capacité à créer des métastases. Les clones 13 et 21 sont métastatiques (M+) alors que les clones 3 et 17 sont nonmétastatiques (NI-). Les objectifs de cette thèse ont été d'étudier le rôle de la réponse immunitaire innée des macrophages après infection in vitro avec différents clones métastatiques et non-métastatiques du parasite L. guyanensis, ainsi que d'étudier la réponse immunitaire générée suite à une infection in vivo par les clones M+ et M- de L. guyanensis dans un modèle marin. L'analyse de la .réponse immunitaire des macrophages in vitro montrent qu'il y aune augmentation significative de leur statut d'activation après infection par des parasites M+ indiquée par la modulation des marqueurs d'activation de surface CD80, CD86 et CD40, ainsi que une augmentation significative de CXCL 10, CCLS, IL6 et TNFa au niveau transcription de l'ARNm et au niveau de la protéine. Cette phénomène d'activation a été observée chez les deux souches de souris C57BL/6 et BALB/c. L'utilisation d'un inhibiteur d'entrée des parasites (Cytochalsin D) ou d'un inhibiteur des fonctions endosomales (Chloroquine) diminue de manière significative la réponse des macrophages aux parasites M+. L'utilisation de macrophages déficients en TLR, MyD88, et TRIF a démontré que la réponse générée après infection par les parasites M+ était dépendante de la voie de signalisation de TRIF et TLR3. Lors d'infection in vivo par des parasites M5313, au moins 50% des souris BALB/c présentent un phénotype sensible caractérisé par des lésions non-nécrotiques qui ne guérissent pas, persistent plus de 13 semaines après infection et contiennent un nombre considérable de parasites. Ces souris développent une réponse immunitaire de type T helper 2 (Th2) avec un niveau élevé d'IL-4 et d'IL-10. Les autres souris ont un phénotype non-sensible, les souris développant peu ou pas de lésion, avec peu de parasites et une réponse immunitaire diminuée, caractérisée par un niveau faible d'IFNy, d'IL4 et d'IL10. De plus, les souris BALB/c infectées par un parasite L. guyanensis isolé à partir des lésions muco-cutanées d'un patient humain atteint de LMC ont démontrés un phénotype similaire aux souris infectées par la souche M5313 avec 50% des souris développant des lésions persistantes, alors qu'un parasite dérivé des lésions cutanées humains n'a montré qu'une faible sensibilité avec une lésion transitoire qui finit par guérir. Nous avons montré que la sensibilité de ces souris BALB/c dépend de l'IL-4 et de l'IL-10 car les souris IL-10-/sur fond génétique BALB/c ainsi que les souris BALB/c traitée avec de l'anti-IL4 étaient capables de contrôler l'infection par M5313. Les souris C57BL/6 sont résistantes à l'infection par le parasite M5313. Elles développent une lésion transitoire qui guérit 9 semaines après infection. Ces souris résistantes ont un très faible taux de parasites au site d'infection et développent une réponse immunitaire de type Thl avec un niveau élevé d'IFNr et peu d'IL4 et d'IL10. Les infections in vivo de souris déficientes en MyD88, TRIF, TLR3 ou TLR9 (sur fond génétique C57BL/6) ont indiqué que MyD88 et TLR9 étaient impliqués dans la résistance à l'infection par L. guyanensi, et que TRIF et TLR3 avaient un rôle important dans la sensibilité. Ce travail met en évidence le fait que la réponse immunitaire de l'hôte est modulée par le parasite selon leur caractérisation d'être soit M+ ou M-. Nous avons démontré également que plusieurs gènes et voies de signalisations étaient impliqués dans cette réponse favorisant le développement d'une LMC. ABSTRACT : Leishmania guyanensis parasites are able to disseminate from the initial site of cutaneous skin infection to the nasopharyngeal tissues resulting in destructive secondary lesions and the disease Mucocutaneous Leishmaniasis (MCL). The secondary lesions in patients have intense immune cell infiltration, elevated immune responses and the presence (albeit at low levels) of parasites. More specifically, MCL patients produce higher levels of TNFa and display impairment in their ability to control the immune response due to a defect in their ability to respond to IL10. Little is known about the pathogenesis of MCL, especially about the dissemination of the infection from the site of inoculation to secondary sites (metastasis) and the response of the host to the pathogen. The hamster model of L. guyanensis infection has previously characterized the WHO reference strain, L. guyanensis WHI/BR/78/M5313, as being highly metastatic. Clones of parasites derived from this reference strain show a differential ability to metastasize. This thesis studied the differential immune response generated by macrophages in vitro, or by mice in vivo, following infection with L. guyanensis parasites. A significant increase in the activation status of macrophages derived from C57BL/6 or BALB/c mice was observed after in vitro infection with L. guyanensis parasites when compared to non-metastatic parasites. This change in status was evidenced by the increased expression of surface activation markers, together with the chemokines, CXCL 10, CCLS, and cytokines, IL6 and TNFa. Furthermore, in vitro infection of macrophages isolated from mice deficient in either a specific Toll Like Receptor (TLR) or the adaptor molecules MyD88 or TRIF, indicated that the immune response generated following L. guyanensis metastatic parasite infection was reliant on the TRIF dependent TLR3 signalling pathway. In vivo footpad infection of BALB/c mice with the L. guyanensis M5313 parasites showed a reproducible susceptible phenotype, whereby at least 50% of infected mice developed non-healing, nonnecrosing lesions with high parasitemia that persisted over 13 weeks post infection. This phenotype was characterized by a Th2 type cytokine immune response with increased levels of IL4 and IL10 detected in the draining lymph nodes. IL 10 deficient mice on a BALB/c background, or BALB/c mice treated with anti-IL4 were able to control infection with L. guyanensis M5313 parasites, thereby proving that these cytokines were indeed implicated in the susceptibility to infection. Moreover, infection of BALB/c mice with patient isolated L. guyanensis parasites confirmed that MCL derived parasites were able to induce a susceptibility phenotype similar to that of L. guyanensis M5313. C57BL/6 mice, on the other hand, were highly resistant to infection with L. guyanensis M5313 parasites and produced transient footpad swelling that healed by week 9 post infection, together with low degrees of footpad parasitemia and a Thl polarized immune response. Infection of mice deficient in MyD88, TRIF, TLR3, and TLR9 (on a C57BL/6 background), indicated that MyD88 and TLR9 were involved in the resistance of these mice to infection, and that TRIF and TLR3 were involved in the susceptibility. This study has shown that the host response can be differentially modulated depending on the infecting parasite with several genes and pathways being identified that could be involved in promoting the development of MCL.

A cell therapy approach for erythropoietin delivery using encapsulated human primary fibroblasts

Summary Cell therapy has emerged as a strategy for the treatment of various human diseases. Cells can be transplanted considering their morphological and functional properties to restore a tissue damage, as represented by blood transfusion, bone marrow or pancreatic islet cells transplantation. With the advent of the gene therapy, cells also were used as biological supports for the production of therapeutic molecules that can act either locally or at distance. This strategy represents the basis of ex vivo gene therapy characterized by the removal of cells from an organism, their genetic modification and their implantation into the same or another individual in a physiologically suitable location. The tissue or biological function damage dictates the type of cells chosen for implantation and the required function of the implanted cells. The general aim of this work was to develop an ex vivo gene therapy approach for the secretion of erythropoietin (Epo) in patients suffering from Epo-responsive anemia, thus extending to humans, studies previously performed with mouse cells transplanted in mice and rats. Considering the potential clinical application, allogeneic primary human cells were chosen for practical and safety reasons. In contrast to autologous cells, the use of allogeneic cells allows to characterize a cell lineage that can be further transplanted in many individuals. Furthermore allogeneic cells avoid the potential risk of zoonosis encountered with xenogeneic cells. Accordingly, the immune reaction against this allogeneic source was prevented by cell macro- encapsulation that prevents cell-to-cell contact with the host immune system and allows to easy retrieve the implanted device. The first step consisted in testing the survival of various human primary cells that were encapsulated and implanted for one month in the subcutaneous tissue of immunocompetent and naturally or therapeutically immunodepressed mice, assuming that xenogeneic applications constitute a stringent and representative screening before human transplantation. A fibroblast lineage from the foreskin of a young donor, DARC 3.1 cells, showed the highest mean survival score. We have then performed studies to optimize the manufacturing procedures of the encapsulation device for successful engraftment. The development of calcifications on the polyvinyl alcohol (PVA) matrix serving as a scaffold for enclosed cells into the hollow fiber devices was reported after one month in vivo. Various parameters, including matrix rinsing solutions, batches of PVA and cell lineages were assessed for their respective role in the development of the phenomenon. We observed that the calcifications could be totally prevented by using ultra-pure sterile water instead of phosphate buffer saline solution in the rinsing procedure of the PVA matrix. Moreover, a higher lactate dehydrogenase activity of the cells was found to decrease calcium depositions due to more acidic microenvironment, inhibiting the calcium precipitation. After the selection of the appropriate cell lineage and the optimization of encapsulation conditions, a retroviral-based approach was applied to DARC 3.1 fibroblasts for the transduction of the human Epo cDNA. Various modifications of the retroviral vector and the infection conditions were performed to obtain clinically relevant levels of human Epo. The insertion of a post-transcriptional regulatory element from the woodchuck hepatitis virus as well as of a Kozak consensus sequence led to a 7.5-fold increase in transgene expression. Human Epo production was further optimized by increasing the multiplicity of infection and by selecting high producer cells allowing to reach 200 IU hEpo/10E6 cells /day. These modified cells were encapsulated and implanted in vivo in the same conditions as previously described. All the mouse strains showed a sustained increase in their hematocrit and a high proportion of viable cells were observed after retrieval of the capsules. Finally, in the perspective of human application, a syngeneic model using encapsulated murine myoblasts transplanted in mice was realized to investigate the roles of both the host immune response and the cells metabolic requirements. Various loading densities and anti-inflammatory as well as immunosuppressive drugs were studied. The results showed that an immune process is responsible of cell death in capsules loaded at high cell density. A supporting matrix of PVA was shown to limit the cell density and to avoid early metabolic cell death, preventing therefore the immune reaction. This study has led to the development of encapsulated cells of human origin producing clinically relevant amounts of human EPO. This work resulted also to the optimization of cell encapsulation technical parameters allowing to begin a clinical application in end-stage renal failure patients. Résumé La thérapie cellulaire s'est imposée comme une stratégie de traitement potentiel pour diverses maladies. Si l'on considère leur morphologie et leur fonction, les cellules peuvent être transplantées dans le but de remplacer une perte tissulaire comme c'est le cas pour les transfusions sanguines ou les greffes de moelle osseuse ou de cellules pancréatiques. Avec le développement de la thérapie génique, les cellules sont également devenues des supports biologiques pour la production de molécules thérapeutiques. Cette stratégie représente le fondement de la thérapie génique ex vivo, caractérisée par le prélèvement de cellules d'un organisme, leur modification génétique et leur implantation dans le même individu ou dans un autre organisme. Le choix du type de cellule et la fonction qu'elle doit remplir pour un traitement spécifique dépend du tissu ou de la fonction biologique atteintes. Le but général de ce travail est de développer .une approche par thérapie génique ex vivo de sécrétion d'érythropoïétine (Epo) chez des patients souffrant d'anémie, prolongeant ainsi des travaux réalisés avec des cellules murines implantées chez des souris et des rats. Dans cette perpective, notre choix s'est porté sur des cellules humaines primaires allogéniques. En effet, contrairement aux cellules autologues, une caractérisation unique de cellules allogéniques peut déboucher sur de nombreuses applications. Par ailleurs, l'emploi de cellules allogéniques permet d'éviter les riques de zoonose que l'on peut rencontrer avec des cellules xénogéniques. Afin de protéger les cellules allogéniques soumises à une réaction immunitaire, leur confinement dans des macro-capsules cylindriques avant leur implantation permet d'éviter leur contact avec les cellules immunitaires de l'hôte, et de les retrouver sans difficulté en cas d'intolérance ou d'effet secondaire. Dans un premier temps, nous avons évalué la survie de différentes lignées cellulaires humaines primaires, une fois encapsulées et implantées dans le tissu sous-cutané de souris, soit immunocompétentes, soit immunodéprimées naturellement ou par l'intermédiaire d'un immunosuppresseur. Ce modèle in vivo correspond à des conditions xénogéniques et représente par conséquent un environnement de loin plus hostile pour les cellules qu'une transplantation allogénique. Une lignée fibroblastique issue du prépuce d'un jeune enfant, nommée DARC 3 .1, a montré une remarquable résistance avec un score de survie moyen le plus élevé parmi les lignées testées. Par la suite, nous nous sommes intéressés aux paramètres intervenant dans la réalisation du système d'implantation afin d'optimaliser les conditions pour une meilleure adaptation des cellules à ce nouvel environnement. En effet, en raison de l'apparition, après un mois in vivo, de calcifications au niveau de la matrice de polyvinyl alcohol (PVA) servant de support aux cellules encapsulées, différents paramètres ont été étudiés, tels que les procédures de fabrication, les lots de PVA ou encore les lignées cellulaires encapsulées, afin de mettre en évidence leur rôle respectif dans la survenue de ce processus. Nous avons montré que l'apparition des calcifications peut être totalement prévenue par l'utilisation d'eau pure au lieu de tampon phosphaté lors du rinçage des matrices de PVA. De plus, nous avons observe qu'un taux de lactate déshydrogénase cellulaire élevé était corrélé avec une diminution des dépôts de calcium au sein de la matrice en raison d'un micro-environnement plus acide inhibant la précipitation du calcium. Après sélection de la lignée cellulaire appropriée et de l'optimisation des conditions d'encapsulation, une modification génétique des fibroblastes DARC 3.1 a été réalisée par une approche rétrovirale, permettant l'insertion de l'ADN du gène de l'Epo dans le génome cellulaire. Diverses modifications, tant au niveau génétique qu'au niveau des conditions d'infection, ont été entreprises afin d'obtenir des taux de sécrétion d'Epo cliniquement appropriés. L'insertion dans la séquence d'ADN d'un élément de régulation post¬transcriptionnelle dérivé du virus de l'hépatite du rongeur (« woodchuck ») ainsi que d'une séquence consensus appelée « Kozak » ont abouti à une augmentation de sécrétion d'Epo 7.5 fois plus importante. De même, l'optimisation de la multiplicité d'infection et la sélection plus drastique des cellules hautement productrices ont permis finalement d'obtenir une sécrétion correspondant à 200 IU d'Epo/10E6 cells/jour. Ces cellules génétiquement modifiées ont été encapsulées et implantées in vivo dans les mêmes conditions que celles décrites plus haut. Toutes les souris transplantées ont montré une augmentation significative de leur hématocrite et une proportion importante de cellules présentait une survie conservée au moment de l'explantation des capsules. Finalement, dans la perspective d'une application humaine, un modèle syngénique a été proposé, basé sur l'implantation de myoblastes murins encapsulés dans des souris, afin d'investiguer les rôles respectifs de la réponse immunitaire du receveur et des besoins métaboliques cellulaires sur leur survie à long terme. Les cellules ont été encapsulées à différentes densités et les animaux transplantés se sont vus administrer des injections de molécules anti-inflammatoires ou immunosuppressives. Les résultats ont démontré qu'une réaction immunologique péri-capsulaire était à la base du rejet cellulaire dans le cas de capsules à haute densité cellulaire. Une matrice de PVA peut limiter cette densité et éviter une mort cellulaire précoce due à une insuffisance métabolique et par conséquent prévenir la réaction immunitaire. Ce travail a permis le développement de cellules encapsulées d'origine humaine sécrétant des taux d'Epo humaine adaptés à des traitements cliniques. De pair avec l'optimalisation des paramètres d'encapsulation, ces résultats ont abouti à l'initiation d'une application clinique destinée à des patients en insuffisance rénale terminale.