Régulation de la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires par l’activation in vivo du récepteur natriurétique de type C

Le remodelage vasculaire dû à l’hyper-prolifération cellulaire des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) observé chez les rats spontanément hypertendus (RSH) est associé à l’hypertension artérielle. Nous avons précédemment démontré que le traitement in vivo des RSH par l’agoniste spécifique du récepteur du peptide natriurétique de type C (NPR-C), le C-ANP4-23 atténue l’hyper-prolifération des CMLVs. Nous avons entrepris cette étude afin d’investiguer si l’effet antiprolifératif du C-ANP4-23 agit par l’entremise de l’inhibition de la surexpression des protéines du cycle cellulaire, et afin d’en explorer les mécanismes sous-jacents. Pour cette étude, des RSH et des rats Wistar Kyoto (WKYs) âgés de deux semaines ont été injectés en intra-péritonéale par le C-ANP4-23 de 2 jusqu’à 8 semaines d’âge, deux fois par semaine et sacrifiés à la 9ème semaine. La pression artérielle a été mesurée par méthode Queue-coiffe, la prolifération des CMLVs a été déterminée par incorporation de thymidine et par test MTT, et l’expression des protéines a été quant à elle déterminée par technique d’immunobuvardage de type Western. Les CMLVs des RSH ont démontré une prolifération élevée en comparaison avec celles des WKYs, et le traitement par le C-ANP4-23 a atténué l’hyperprolifération à un niveau de contrôle. De plus, la surexpression des cyclines D1/A/E, des kinases cyclines dépendantes 2 et 4 (cdk2, cdk4), de la forme phosphorylée de la protéine du rétinoblastome et des protéines Gαi des CMLV des RSH a été atténuée à un niveau de contrôle. Par ailleurs, l’hyperphosphorylation d’ERK1/2, AKT, EGF-R, PDGF-R, IGF-R et de c-Src a significativement diminué par le traitement au C-ANP4-23. En outre, le niveau élevé de l’anion superoxyde (O2-), l’activité de la NADP(H) oxydase et de ses sous unités chez les RSH ont été atténués par le C-ANP4-23 .Ces résultats indiquent que l’activation in vivo de NPR-C atténue la surexpression des protéines du cycle cellulaire via l’inhibition de l’activité élevée du stress oxydatif, de c-Src et de l’activation de EGF-R, PDGF- R, IGF-R, de la signalisation de MAPK et la surexpression des protéines Gαi résultant ainsi en l’inhibition de l’hyperprolifération des CMLVs des RSH. Ainsi, il peut être suggéré que le C-ANP4-23 pourrait être utilisé comme agent thérapeutique pour le traitement des complications vasculaires associées à l’hypertension et à l’athérosclérose.

Caractérisation d’un effecteur de phosphoinositides chez le parasite de la malaria "Plasmodium falciparum"

La malaria est une maladie infectieuse causant plus de 500 000 morts chaque année. La maladie est causée par un protozoaire de la famille Plasmodium. L’apparition de souches résistantes aux traitements actuels et l’absence de vaccin efficace rendent la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques urgente. Le parasite possède un complexe apical, un groupement de vacuoles sécrétoires spécialisées contenant les protéines responsables de l’invasion du globule rouge. Nous nous intéressons aux mécanismes gouvernant le transport intracellulaire de ces protéines et à la biogenèse du complexe apical lors de la formation des nouveaux parasites. Plus particulièrement, nous nous intéressons au rôle des phosphoinositides dans le recrutement des protéines à la membrane de l’appareil de Golgi. Par analyse bio-informatique du génome de P. falciparum, nous avons identifié plusieurs protéines effectrices liant potentiellement les phosphoinositides. Les travaux présentés dans ce mémoire concernent Mal13P1.188, une protéine possédant un domaine Pleckstrin homology. Nous proposons que Mal13P1.188 ait un rôle dans la génération du complexe apical en recrutant les protéines le constituant à la membrane du Golgi par la liaison avec les phosphoinositides. Afin de vérifier nos hypothèses, nous avons généré une lignée de parasite dont le gène de Mal13P1.188 est fusionné avec une GFP et une hémagglutinine. À l’aide de cette lignée de parasite, nous avons pu identifier Mal13P1.188 à proximité de l’appareil de Golgi lorsque les parasites étaient sous la forme schizont du cycle érythrocytaire. D’autres expériences ont permis de confirmer que le domaine Pleckstrin homology de Mal13P1.188 était capable de reconnaître les différentes formes de phosphoinositides. Finalement, d’autres travaux devront être faits sur Mal13P1.188 afin de déterminer si elle est essentielle à la survie du parasite.

Augmentation de l’expression de la chaine α1 de la laminine 111, un potentiel traitement pour la Dystrophie musculaire de Duchenne

La protéine hétérotrimérique laminine-111 permet le lien entre la matrice-extracellulaire et l’intégrine α7β1 du sarcolemme, remplaçant ainsi dans les muscles dystrophiques, des liens normalement assurés par le complexe de la dystrophine. L’injection de laminine-111 dans des souris mdx a permis, entre autre, l’augmentation de l’expression de l’intégrine α7β1, d’empêcher les bris du sarcolemme lors de la contraction musculaire, de restaurer un niveau normal de la créatine kinase sérique, ainsi que d’augmenter la résistance et la force dans les muscles déficients en dystrophine. Ces résultats suggèrent que l’augmentation de la laminine-111 est un potentiel traitement pour la DMD. Les chaines β1 et γ1 de la laminine sont déjà exprimées dans le muscle humain adulte, mais la chaine α1 de la laminine (Lamα1) est exprimée uniquement pendant le stade très précoce 16 cellules de l’embryogenèse. Nous avons donc développé une méthode alternative à l’injection répétée de Laminine-111 en induisant l’expression endogène du gène LAMA1, afin de reformer le complexe trimérique α1β1γ1, la laminine 111. Ceci a été réalisé avec une technologie récente, le système CRISPR/Cas9, dont la Cas9 a été désactivée (dCas9) puis couplée à un domaine d’activation de la transcription, le VP160 (dCas9-VP160). L’utilisation d’un ou plusieurs ARN guides (ARNg) a permis de cibler le promoteur du gène LAMA1. L’ARNm de Lamα1 (qRT-PCR) ainsi que la protéine (immunohistochimie et immunobuvardage) n’ont pas été détecté dans le contrôle négatif, des myoblastes murins (C2C12). Cependant, une expression significative a été observée dans ces myoblastes transfectés avec des plasmides codant pour dCas9-VP160 et un ARNg. L’analyse protéique in vivo, dans des muscles de souris électroporés avec le même plasmide, a démontré une forte augmentation de la chaine α1 de la laminine. Des augmentations plus importantes de l’ARNm de Lamα1 ont été observées en utilisant 2 ARNg, suggérant un effet synergique. L’augmentation de l’expression de Lamα1 par le système de CRISPR/Cas9 devrait être étudiée d’avantage afin de vérifier si cette stratégie pourrait s’avérer efficace dans des cas de myopathies.

Cartographie des cassures bicaténaires du remodelage chromatinien du spermatide et développement des outils techniques associés.

Résumé : La phase haploïde de la spermatogenèse (spermiogenèse) est caractérisée par une modification importante de la structure de la chromatine et un changement de la topologie de l’ADN du spermatide. Les mécanismes par lesquels ce changement se produit ainsi que les protéines impliquées ne sont pas encore complètement élucidés. Mes travaux ont permis d’établir la présence de cassures bicaténaires transitoires pendant ce remodelage par l’essai des comètes et l’électrophorèse en champ pulsé. En procédant à des immunofluorescences sur coupes de tissus et en utilisant un extrait nucléaire hautement actif, la présence de topoisomérases ainsi que de marqueurs de systèmes de réparation a été confirmée. Les protéines de réparation identifiées font partie de systèmes sujets à l’erreur, donc cette refonte structurale de la chromatine pourrait être génétiquement instable et expliquer le biais paternel observé pour les mutations de novo dans de récentes études impliquant des criblages à haut débit. Une technique permettant l’immunocapture spécifique des cassures bicaténaires a été développée et appliquée sur des spermatides murins représentant différentes étapes de différenciation. Les résultats de séquençage à haut débit ont montré que les cassures bicaténaires (hotspots) de la spermiogenèse se produisent en majorité dans l’ADN intergénique, notamment dans les séquences LINE1, l’ADN satellite et les répétions simples. Les hotspots contiennent aussi des motifs de liaisons des protéines des familles FOX et PRDM, dont les fonctions sont entre autres de lier et remodeler localement la chromatine condensée. Aussi, le motif de liaison de la protéine BRCA1 se trouve enrichi dans les hotspots de cassures bicaténaires. Celle-ci agit entre autres dans la réparation de l’ADN par jonction terminale non-homologue (NHEJ) et dans la réparation des adduits ADN-topoisomérase. De façon remarquable, le motif de reconnaissance de la protéine SPO11, impliquée dans la formation des cassures méiotiques, a été enrichi dans les hotspots, ce qui suggère que la machinerie méiotique serait aussi utilisée pendant la spermiogenèse pour la formation des cassures. Enfin, bien que les hotspots se localisent plutôt dans les séquences intergéniques, les gènes ciblés sont impliqués dans le développement du cerveau et des neurones. Ces résultats sont en accord avec l’origine majoritairement paternelle observée des mutations de novo associées aux troubles du spectre de l’autisme et de la schizophrénie et leur augmentation avec l’âge du père. Puisque les processus du remodelage de la chromatine des spermatides sont conservés dans l’évolution, ces résultats suggèrent que le remodelage de la chromatine de la spermiogenèse représente un mécanisme additionnel contribuant à la formation de mutations de novo, expliquant le biais paternel observé pour certains types de mutations.

Rôle du facteur de transcription HNF1α dans la promotion du diabète par l’intermédiaire d’hormones intestinales

HNF1α (hepatocyte nuclear factor-1α) est un facteur de transcription exprimé dans le foie, le pancréas, les reins, l’estomac, l’intestin grêle et le côlon. Il a été démontré que des mutations du gène codant pour cette protéine sont associées à un diabète non insulinodépendant MODY3. De plus, les souris déficientes pour l’expression de Hnf1α souffrent d’hyperglycémie. Ces animaux mutants semblent produire de l’insuline mais présentent cependant une altération de la sécrétion de cette hormone au niveau du pancréas. Dans une précédente étude, nous avons démontré que certains marqueurs de cellules entéroendocrines impliqués dans l’homéostasie du glucose étaient modulés chez les animaux mutants comparativement aux animaux contrôles notamment la ghréline, le Gip, la somatostatine. Notre hypothèse de recherche est que la perte de Hnf1α conditionne la promotion du diabète par l’intermédiaire d’hormones intestinales. Nous avons observé, chez les animaux mutants, une augmentation de l’expression du transcrit, du nombre de cellules positives ainsi que des taux plasmatiques de ghréline. Cette hormone étant reliée à l’homéostasie du glucose, nous avons suivi les variations de la glycémie et des taux d’insuline chez nos animaux. Nous avons observé une hyperglycémie accompagnée d’une diminution des taux d’insuline chez nos animaux mutants. Ces souris présentent une prise alimentaire augmentée, une polyurie et une polydipsie élevées, symptômes connus du diabète. Le traitement de 6 jours sur les souris Hnf1α[indice supérieur -/-] avec un antagoniste commercial du récepteur à la ghréline GHSR1a, le (D-Lys3)-GHRP-6 de BACHEM®, montre un rétablissement de la glycémie proche des valeurs normales, de même qu’une augmentation significative des taux d’insuline plasmatiques des souris traitées, une diminution de la polyurie, de la polydipsie et de la glycosurie. Les souris mutantes traitées avec cet antagoniste voient leur tolérance au glucose améliorée même en cas de choc glycémique. Nous avons, enfin, documenté la régulation possible de Hnf1α vis-à-vis du gène codant pour la ghréline. Des infections lentivirales, réalisées sur des cellules MIN6 avec un shARN dirigé contre le transcrit Hnf1α, montrent une augmentation des taux d’expression du transcrit ghréline. Nous avons également mis en évidence l’interaction physique entre Hnf1α et le promoteur ghréline en plusieurs sites par des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine. L’ensemble de ces résultats suggère que la perte de Hnf1α chez la souris joue un rôle dans la promotion de l’hyperglycémie par l’intermédiaire d’une dérégulation de la production de ghréline.

Nouveaux inducteurs covalents de la voie de signalisation Keap1/Nrf2/ARE

Le stress électrophile et oxydant est un souci grandissant pour la santé avec l'évolution de nos modes de vie. L'exposition aux ultraviolets, à la pollution, aux substances carcinogènes, à la fumée de cigarette et la pratique intensive d'activités sportives sont autant de causes de stress oxydant pour l'organisme. Ces dommages sont associés à plusieurs maladies et conditions pathologiques telles que cancers, diabètes, infections pulmonaires et maladies neurodégénératives. L'élément de réponse antioxydant (ARE) est un des composants principaux des défenses de la cellule contre ce phénomène. Ce promoteur agit sous le contrôle de Nrf2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2). Une stratégie populaire pour l'activation de ce mécanisme est l'utilisation d'inducteurs covalents. Ces molécules agissent par la formation de liens covalents avec les nombreux résidus cystéine de Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), une protéine chaperonne qui contrôle l'activité de Nrf2. Cette thèse présente la synthèse, les propriétés biologiques et l'étude des relations structure-activité d'une librairie d'électrophiles capables d'induire la transcription des gènes cibles de la voie de signalisation Keap1/Nrf2/ARE. Le premier volet fait état de la comparaison d'une variété d'électrophiles simples pour étudier les préférences de la cible. Le deuxième volet montre que la présence d'une seconde fonction capable de piéger un résidu cystéine fournit des analogues très puissants.

Caractérisation des mécanismes moléculaires liés à p53 régulant l’expression du gène P2RY6.

Le récepteur P2Y[indice inférieur 6] est un récepteur couplé à une protéine G responsable de l’activation de nombreuses voies de signalisation. Dans l’épithélium du côlon, il participe au maintien de l’équilibre hydrique, mais il a été montré que le récepteur P2Y[indice inférieur 6] participait à l’aggravation des symptômes inflammatoires dans la maladie de Crohn ou dans la colite ulcéreuse. Les maladies inflammatoires de l’intestin sont des facteurs pouvant mener au cancer colorectal. En effet, il existe deux types de cancers colorectaux : le cancer sporadique et le cancer associé à la colite qui se différencient notamment par la séquence d’apparition de mutations génétiques. Par exemple, le gène TP53 est muté de façon tardive dans le cancer colorectal sporadique et muté de façon précoce dans le cancer associé à l’inflammation. Puisque le récepteur P2Y[indice inférieur 6] est impliqué dans la création d’un environnement pro-inflammatoire, nous nous sommes intéressés au rôle de p53 sur l’expression du gène P2RY[indice inférieur 6] et avons formulé l’hypothèse suivante : la présence de TP53 mutant va réguler de façon différentielle l’expression du gène P2RY[indice inférieur 6] dans le cancer colorectal. L’objectif général des travaux est le suivant : caractériser les mécanismes moléculaires liés à TP53 régulant l’expression du gène P2RY[indice inférieur 6] dans le cancer colorectal. Les objectifs spécifiques pour ce projet de recherche sont donc : (1) déterminer et caractériser les régions promotrices du gène P2RY[indice inférieur 6] dans les cellules épithéliales intestinales cancéreuses et (2) étudier l’effet de la protéine p53 de type sauvage ou mutée sur l’expression du récepteur P2Y[indice inférieur 6]. Le gène P2RY[indice inférieur 6] code pour 8 variants d’ARN messagers. Les variants 1, 2, 3, 5, 6, 7 et 8 codent pour l’isoforme 1 du récepteur P2Y[indice inférieur 6], forme connue du récepteur. Le variant 9 code pour l’isoforme 2, non caractérisée. Nos travaux ont permis de mettre en évidence l’existence de quatre régions promotrices potentielles du gène P2RY[indice inférieur 6] et la présence du variant 9, codant pour l’isoforme 2 du récepteur P2Y[indice inférieur 6] dans la lignée cellulaire Caco-2. Nous avons également montré que les formes normale et mutée de p53 régulent de façon différentielle l’expression du récepteur P2Y[indice inférieur 6]. Enfin, le rôle de l’isoforme 2 reste à étudier, mais les tests effectués suggèrent qu’elle est activable par l’UDP.

Rôle de SOCS1 dans l’immunogénicité de la tumeur en particulier au niveau du carcinome hépatocellulaire

Résumé : Le carcinome hépatocellulaire (HCC) est la troisième cause commune de décès de cancer et affecte plus les hommes que les femmes. Le HCC résulte d’une dérégulation des voies de signalisation impliquées dans l’initiation de l’inflammation menant ainsi à des répercussions désastreuses. De part la complexité de ce type de cancer, les traitements qui existent à ce jour ne sont pas très prometteurs et ont un faible pourcentage de « rémission ». L’immunothérapie soulève beaucoup d’espoir quant à l’orientation vers un traitement efficace plausible. En effet, plusieurs suppresseurs de tumeur se retrouvent réprimés, parmi lesquels le SOCS1. C’est dans cette optique que nos recherches se sont orientées en mettant la lumière sur le SOCS1 «suppresseur de signalisation des cytokines 1 (SOCS1) » qui est réprimé au niveau du HCC et dont la restauration pourrait contribuer à un pronostic favorable à la rémission. La protéine SOCS1 a beaucoup attisé la curiosité des chercheurs de part son rôle suppresseur de tumeur. Pour comprendre les mécanismes d’action de SOCS1 et son implication dans la neutralisation de la tumeur, nous avons généré trois types stables de la lignée cellulaire du carcinome hépatocellulaire de souris Hepa1-6, une portant un vecteur vide, l’autre exprimant le type sauvage du gène SOCS1 (SOCS1-WT; Hepa-S) et une portant une mutation au niveau du domaine SH2 (SOCS1-R105K; Hepa-R). Le mutant ne peut plus inhiber la signalisation des cytokines. Lors de l'implantation sous-cutanée des cellules Hepa1-6 modifiées, chez des souris C57BL/6 et NOD.scid.gamma (NSG). Nous avons observé que les cellules Hepa1-6 exprimant le vecteur de contrôle (Hepa-V) formaient de grosses tumeurs tandis que les cellules Hepa-S formaient de petites tumeurs chez les deux types de souris. Les cellules Hepa-R quant à elles, formaient de grosses tumeurs seulement chez des souris immunodéficientes (NSG) mais montraient une croissance nettement retardée lorsqu’elles étaient greffées aux souris (C57BL/6) immunocompétentes. Partant de ce constat intrigant, nous avons postulé que SOCS1 favorise l'immunogénicité des cellules tumorales par son domaine SOCS Box. Par conséquent, les cellules Hepa-R offrent une occasion unique de démêler le potentiel pro-immunogène de SOCS1, et ceci dans le but d'élucider les fonctions immunogènes de SOCS1 dans le cancer du foie. Jusqu'à présent aucune précédente recherche ne s’est aventurée à chercher l’implication de SOCS1 dans l’augmentation de l’immunogénicité.

A multidisciplinary approach to the study of protein dynamics and signal transmission

Allostery is a phenomenon of fundamental importance in biology, allowing regulation of function and dynamic adaptability of enzymes and proteins. Despite the allosteric effect was first observed more than a century ago allostery remains a biophysical enigma, defined as the “second secret of life”. The challenge is mainly associated to the rather complex nature of the allosteric mechanisms, which manifests itself as the alteration of the biological function of a protein/enzyme (e.g. ligand/substrate binding at the active site) by binding of “other object” (“allos stereos” in Greek) at a site distant (> 1 nanometer) from the active site, namely the effector site. Thus, at the heart of allostery there is signal propagation from the effector to the active site through a dense protein matrix, with a fundamental challenge being represented by the elucidation of the physico-chemical interactions between amino acid residues allowing communicatio n between the two binding sites, i.e. the “allosteric pathways”. Here, we propose a multidisciplinary approach based on a combination of computational chemistry, involving molecular dynamics simulations of protein motions, (bio)physical analysis of allosteric systems, including multiple sequence alignments of known allosteric systems, and mathematical tools based on graph theory and machine learning that can greatly help understanding the complexity of dynamical interactions involved in the different allosteric systems. The project aims at developing robust and fast tools to identify unknown allosteric pathways. The characterization and predictions of such allosteric spots could elucidate and fully exploit the power of allosteric modulation in enzymes and DNA-protein complexes, with great potential applications in enzyme engineering and drug discovery.