Caractérisation de l’ADNc et de l’ADN génomique codant l’intégrine plaquettaire αIIb‐β3 chez un cheval atteint de Thrombasthénie de Glanzmann

La thrombasthénie de Glanzmann (TG) est une maladie caractérisée par un défaut d’agrégation plaquettaire. C’est une maladie génétique autosomale récessive causée par une anomalie du récepteur plaquettaire pour le fibrinogène. Ce récepteur est une intégrine localisée à la surface plasmatique qui est formée par un complexe composé des sous‐unités αIIb et β3. Nous avons identifié un cheval démontrant les caractéristiques clinicopathologiques de la TG. Des études par cytométrie de flux ont révélé une déficience au niveau de la portion αIIb du récepteur. Ces résultats suggèrent une ou plusieurs mutations au niveau du gène codant pour cette portion αIIb du récepteur. L’objectif de notre étude était de caractériser l’ADNc et l’ADN génomique codant pour les gènes ITGA2B et ITGB3 codant respectivement pour les deux sous‐unités αIIb et β3 chez un cheval atteint de la TG. L’ADNc a été synthétisé par RT‐PCR en utilisant l’ARN total récolté à partir des plaquettes. L’ADN génomique a été extrait à partir des globules blancs. Des amorces spécifiques ont été utilisées pour l’amplification par PCR d’ITGA2B et d’ITGB3. Les séquences d’ADNc et d’ADN génomique de notre patient ont été caractérisées par séquençage et comparées par l’analyse BLAST (GenBank). Une substitution d’une guanine par une cytosine a été mise en évidence au niveau de l’exon 2 d’ITGA2B amenant à la substitution d’une arginine (Arg72) par une proline (Pro72). Ce changement d’acide aminé pourrait résulter en une conformation structurelle anormale qui amènerait à une sous‐unité αIIb inactive. L’analyse de l’ADN génomique a démontré que ce cheval était homozygote pour cette mutation. Le séquençage de l’ADN génomique des parents et de la grand‐mère du patient a démontré que ces individus étaient hétérozygotes pour cette mutation. Le séquençage d’ITGB3 n’a démontré aucune anomalie.

Caractérisation moléculaire du rôle de facteurs accessoires ArgR et PepA au niveau de la recombinaison spécifique sur le site cer

Mon projet de recherche avait pour but de caractériser le rôle de deux protéines, ArgR et PepA, qui agissent en tant que facteurs accessoires de la recombinaison au niveau de deux sites cer du plasmide ColE1 présent dans la bactérie Escherichia coli. Ces deux protéines, couplées aux deux recombinases à tyrosine XerC et XerD, permettent la catalyse de la recombinaison site spécifique au niveau de la séquence cer, convertissant les multimères instables de ColE1 en monomères stables. Cette étude a principalement porté sur la région C-terminale de la protéine ArgR. Cette région de la protéine ArgR possède une séquence en acides-aminés et une structure similaire à celle de la protéine AhrC de Bacillus subtilis. De plus, AhrC, le répresseur de l’arginine de cette bactérie, est capable de complémenter des Escherichia coli mutantes déficientes en ArgR. Les régions C-terminales de ces protéines, montrent une forte similarité. De précédents travaux dans notre laboratoire ont démontré que des mutants d’ArgR comprenant des mutations dans cette région, en particulier les mutants ArgR149, une version tronquée d’ArgR de 149 acides-aminés, et ArgR5aa, une version comprenant une insertion de cinq acides-aminés dans la partie C-terminale, perdaient la capacité de permettre la recombinaison au niveau de deux sites cer présents dans le plasmide pCS210. Malgré cette incapacité à promouvoir la réaction de recombinaison en cer, ces deux mutants étaient toujours capables de se lier spécifiquement à l’ADN et de réprimer une fusion argA :: lacZ. Dans ce travail, les versions mutantes et sauvages d’ArgR furent surexprimées en tant que protéines de fusion 6-histidine. Des analyses crosslinking ont montré que la version sauvage et ArgR5aa pouvaient former des hexamères in-vitro de manière efficace, alors qu’ArgR149 formait des multimères de plus faible poids moléculaire. Des formes tronquées d’ArgR qui comportaient 150 acides-aminés ou plus, étaient encore capables de permettre la recombinaison en cer. Les mutants par substitution ArgRL149A et ArgRL151A ont tous montré que les substitutions d’un seul acide-aminé au sein de cette région avaient peu d’effets sur la recombinaison en cer. Les expériences de crosslinking protéine-à-protéine ont montré que le type sauvage et les formes mutantes d’ArgR étaient capables d’interagir avec la protéine accessoire PepA, également impliquée dans la recombinaison en cer. Les expériences de recombinaison in-vitro utilisant la forme sauvage et les formes mutantes d’ArgR combinées avec les protéines PepA, XerC et XerD purifiées, ont montré que le mutant ArgR149 ne soutenait pas la recombinaison, mais que le mutant ArgR5aa permettait la formation d’une jonction d’Holliday. Des expériences de topologie ont montré que PepA était capable de protéger l’ADN de la topoisomérase 1, et d’empêcher ArgRWt de se lier à l’ADN. Les deux mutants ArgR149 et ArgR5aa protègent aussi l’ADN avec plus de surenroulements. Quand on ajoute PepA, les profils de migration montrent un problème de liaison des deux mutants avec PepA. D’autres expériences impliquant le triplet LEL (leucine-acide glutamique-leucine) et les acides-aminés alentour devraient être réalisés dans le but de connaitre l’existence d’un site de liaison potentiel pour PepA.

Amélioration de l'exactitude de l'inférence phylogénomique

L’explosion du nombre de séquences permet à la phylogénomique, c’est-à-dire l’étude des liens de parenté entre espèces à partir de grands alignements multi-gènes, de prendre son essor. C’est incontestablement un moyen de pallier aux erreurs stochastiques des phylogénies simple gène, mais de nombreux problèmes demeurent malgré les progrès réalisés dans la modélisation du processus évolutif. Dans cette thèse, nous nous attachons à caractériser certains aspects du mauvais ajustement du modèle aux données, et à étudier leur impact sur l’exactitude de l’inférence. Contrairement à l’hétérotachie, la variation au cours du temps du processus de substitution en acides aminés a reçu peu d’attention jusqu’alors. Non seulement nous montrons que cette hétérogénéité est largement répandue chez les animaux, mais aussi que son existence peut nuire à la qualité de l’inférence phylogénomique. Ainsi en l’absence d’un modèle adéquat, la suppression des colonnes hétérogènes, mal gérées par le modèle, peut faire disparaître un artéfact de reconstruction. Dans un cadre phylogénomique, les techniques de séquençage utilisées impliquent souvent que tous les gènes ne sont pas présents pour toutes les espèces. La controverse sur l’impact de la quantité de cellules vides a récemment été réactualisée, mais la majorité des études sur les données manquantes sont faites sur de petits jeux de séquences simulées. Nous nous sommes donc intéressés à quantifier cet impact dans le cas d’un large alignement de données réelles. Pour un taux raisonnable de données manquantes, il appert que l’incomplétude de l’alignement affecte moins l’exactitude de l’inférence que le choix du modèle. Au contraire, l’ajout d’une séquence incomplète mais qui casse une longue branche peut restaurer, au moins partiellement, une phylogénie erronée. Comme les violations de modèle constituent toujours la limitation majeure dans l’exactitude de l’inférence phylogénétique, l’amélioration de l’échantillonnage des espèces et des gènes reste une alternative utile en l’absence d’un modèle adéquat. Nous avons donc développé un logiciel de sélection de séquences qui construit des jeux de données reproductibles, en se basant sur la quantité de données présentes, la vitesse d’évolution et les biais de composition. Lors de cette étude nous avons montré que l’expertise humaine apporte pour l’instant encore un savoir incontournable. Les différentes analyses réalisées pour cette thèse concluent à l’importance primordiale du modèle évolutif.

Enantiopure 3-substituted piperidines via an aziridinium ion ring expansion

Ce mémoire décrit le développement d’une nouvelle méthodologie d’expansion de cycle irréversible à partir de N-alkyl-3,4-déhydroprolinols pour former des N-alkyl tétrahydropyridines 3-substituées en passant par un intermédiaire aziridinium bicyclique. Cette méthode permet l’introduction d’un vaste éventail de substituants à la position 3 et tolère bien la présence de groupements aux positions 2 et 6, donnant accès à des pipéridines mono-, di- ou trisubstituées avec un excellent diastéréocontrôle. De plus, il est démontré que l’information stéréogénique du 3,4-déhydroprolinol de départ est totalement transférée vers le produit tétrahydropyridine. Additionnellement, une méthodologie fut dévelopée pour la préparation des produits de départ 3,4-déhydroprolinols en forme énantiopure, avec ou sans substituants aux positions 2 et 5, avec un très bon stéréocontrôle. Le premier chapitre présente un résumé de la littérature sur le sujet, incluant un bref survol des méthodes existantes pour la synthèse de pipéridines 3-substituées, ainsi qu’une vue d’ensemble de la chimie des aziridiniums. L’hypothèse originale ainsi que le raisonnement pour l’entreprise de ce projet y sont également inclus. Le second chapitre traite de la synthèse des N-alkyl-3,4-déhydroprolinols utilisés comme produits de départ pour l’expansion de cycle vers les tétrahydropyridines 3-substituées, incluant deux routes synthétiques différentes pour leur formation. Le premier chemin synthétique utilise la L-trans-4-hydroxyproline comme produit de départ, tandis que le deuxième est basé sur une modification de la réaction de Petasis-Mannich suivie par une métathèse de fermeture de cycle, facilitant l’accès aux précurseurs pour l’expansion de cycle. Le troisième chapitre présente une preuve de concept de la viabilité du projet ainsi que l’optimisation des conditions réactionnelles pour l’expansion de cycle. De plus, il y est démontré que l’information stéréogénique des produits de départs est transférée vers les produits. iv Au quatrième chapitre, l’étendue des composés pouvant être synthétisés par cette méthodologie est présentée, ainsi qu’une hypothèse mécanistique expliquant les stéréochimies relatives observées. Une synthèse énantiosélective efficace et divergente de tétrahydropyridines 2,3-disubstituées est également documentée, où les deux substituants furent introduits à partir d’un intermédiaire commun en 3 étapes.

Conséquences fonctionnelles de mutations affectant le récepteur de la vasopressine de type 2 et implications thérapeutiques

Le récepteur de la vasopressine de type 2 (V2R) joue un rôle crucial dans l’homéostasie hydrique. Exprimé principalement au niveau du rein, son activation par l’hormone antidiurétique arginine-vasopressine (AVP) favorise la réabsorption d’eau, participant ainsi à diminuer la diurèse. Plus de 200 mutations dans le gène du V2R ont été associées au diabète néphrogénique insipide congénital (DINc), une maladie causée par une perte de fonction du récepteur. À l’opposé, trois mutations découvertes récemment induisent un gain de fonction du V2R, et sont la cause du syndrome néphrogénique de l’anti-diurèse inappropriée (NSIAD). Les travaux de cette thèse visent à mieux comprendre les bases moléculaires responsables de la perte ou du gain de fonction des récepteurs mutants associés à ces deux maladies. Dans plus de 50% des cas, les mutations faux-sens affectent négativement l’adoption d’une conformation native par le V2R, provoquant la reconnaissance et la rétention intracellulaire des mutants par le système de contrôle de qualité du réticulum endoplasmique. Nos résultats ont démontré que l’interaction entre les récepteurs mutants et le chaperon moléculaire calnexine est dépendante de N-glycosylation et que sa durée varie en fonction de la mutation. De plus, l’importance de cette modification co-traductionnelle et des interactions lectines-sucres dans le processus de maturation d’un mutant donné s’est avérée une caractéristique intrinsèque, puisque l’absence de N-glycosylation n’a pas affecté le mutant Y128S (phénotype léger) tandis que la maturation du mutant W164S (phénotype sévère) a été totalement abolie. Nos résultats suggèrent aussi que l’action des chaperons pharmacologiques (CP), molécules favorisant la maturation des mutants du V2R, peut survenir à différentes étapes au cours du processus de maturation, selon le mutant réchappé. Ces différences entre muta nts suggèrent des processus biosynthétiques ‘personnalisés’ dictés par la nature de la mutation impliquée et pourraient expliquer la différence de sévérité des manifestations cliniques chez les patients porteurs de ces mutations. Bien qu’une récupération de fonction ait été obtenue pour les mutants Y128S et W164S par un traitement au CP, il n’en est pas de même pour toutes les mutations occasionnant un défaut conformationnel. C’est ce que nous avons démontré pour le mutant V88M, affligé de deux défauts, soit une faible efficacité de maturation combinée à une basse affinité pour l’AVP. Dans ce cas, et malgré une augmentation du nombre de récepteurs mutants la surface cellulaire, la diminution de l’affinité apparente du récepteur mutant pour l’AVP a été exacerbée par la présence résiduelle de CP à son site de liaison, rendant impossible l’activation du récepteur aux concentrations physiologiques d’AVP. Les mutants R137C et R137L ont une activité constitutive élevée et mènent au NSIAD tandis que la substitution de cette même arginine par une histidine (R137H) mène au DINc. Ces trois mutants se sont avéré partager plusieurs caractéristiques, dont une efficacité de maturation réduite et une désensibilisation spontanée élevée. La seule différence iden tifiée entre ces mutants est leur niveau d’activité constitutive. Le CP utilisé dans nos études possède aussi la propriété d’agoniste inverse, mais n’a pourtant pas diminué l’activité constitutive des mutants R137C/L, suggérant une conformation active ‘figée’. Seul l’effet chaperon a été observé, entraînant la hausse de récepteurs à la surface cellulaire, qui se traduit par une augmentation de la production de second messager. Nous avons par contre suggéré l’utilisation d’AVP puisqu’il favorise l’endocytose des récepteurs R137/L sans promouvoir leur activation, diminuant ainsi le nombre de récepteurs actifs à la surface cellulaire. Nous avons identifié la première mutation occasionnant un gain de fonction du V2R qui n’implique pas l’arginine 137. Le mutant F229V a une activité constitutive élevée et, contrairement aux R137C et R137L, il n’est pas sujet à une désensibilisation spontanée accrue. L’observation que des agonistes inverses sont aptes à inhiber l’activité constitutive de ce nouveau mutant est une découverte importante puisque l’insuccès obtenu avec les mutations précédentes suggérait que ces molécules n’étaient pas utiles pour le traitement du NSIAD. Considérés globalement, ces travaux illustrent le caractère particulier des formes mutantes du V2R et l’importance de bien cerner les conséquences fonctionnelles des mutations afin d’apporter aux patients atteints de DINc ou NSIAD une thérapie personnalisée, et de développer de nouveaux agents thérapeutiques adaptés aux besoins.

Identification du gène Anoctamine 5 responsable d'une nouvelle forme récessive de dystrophie musculaire des ceintures

Les dystrophies musculaires des ceintures (ou limb-girdle muscular dystrophy, LGMD) sont un groupe hétérogène de dystrophies musculaires chez l’adulte et sont définies par une atrophie et une faiblesse progressive qui surviennent dans les muscles proximaux. Chez une cohorte canadienne-française, nous avons précédemment décrit une nouvelle forme récessive, désignée LGMD2L et marquée par une atrophie asymétrique du quadriceps, que nous avions cartographiée au chromosome 11p12-p13 grâce à des analyses de liaison. L’objectif de ce projet de thèse était de raffiner l’intervalle candidat, puis d’identifier et de caractériser le gène muté responsable de la LGMD2L. Grâce à une cartographie par homozygotie de polymorphismes de nucléotide simple (SNPs) réalisée sur une grande famille consanguine, nous avons redéfini l’intervalle candidat à une région du chromosome 11p14.3-p15.1. Par séquençage de l’ADN génomique et complémentaire au gène Anoctamine 5 (ANO5) inclus dans cet intervalle, nous avons identifié trois mutations, chez autant de familles: une substitution créant un site d’épissage aberrant, une insertion d’un nucléotide et une mutation faux-sens. Les deux premières mutations étaient associées à une hausse de la dégradation de l’ARN messager médiée par une troncation prématurée. Nous avons également identifié des mutations ANO5 chez une seconde dystrophie musculaire de type distal cartographiant au même locus que la LGMD2L, nommée MMD3, et dont la manifestation initiale était une faiblesse des mollets, mais qui pouvait progresser vers une atrophie des quadriceps. Une réparation membranaire défective avait été observée chez les fibroblastes de deux patients MMD3, suggérant un rôle pour ANO5 dans ce mécanisme. La localisation et la fonction d’ANO5 dans le muscle sont inconnues, mais cette protéine fait partie d’une famille conservée de protéines à huit domaines transmembranaires, les Anoctamines, dont certains membres sont des transporteurs chloriques activés par le calcium. Les résultats de nos études d’immunofluorescence suggèrent qu’ANO5 se localise peu au sarcolemme, mais plutôt à une structure intracellulaire qui suit la ligne Z des myofibrilles. De façon étonnante, cette localisation était préservée chez un patient LGMD2L porteur homozygote de la mutation d’épissage, en dépit du fait que cette dernière était considérée comme une mutation nulle. Néanmoins, nous avons identifié un épissage alternatif de l’exon 15 qui se produisait sur une proportion des transcrits porteurs de la mutation d’épissage, ce qui rétablirait le cadre de lecture, soulignant la complexité de la régulation de l’épissage d’ANO5 et laissant croire que la LGMD2L pourrait être causée par une perte de fonction partielle, et non complète, d’ANO5. Des études subséquentes par des groupes européens ont montré que les anoctaminopathies 5 sont une cause fréquente de dystrophies musculaires des ceintures chez l’adulte. Notre découverte de mutations au gène Anoctamine 5 a mis en évidence une nouvelle classe de protéines importantes pour la biologie du muscle et a ouvert la voie à de nouvelles pistes pour étudier les mécanismes par lesquels un défaut de réparation membranaire progresse en une dystrophie musculaire.

Decarboxylative Generation of Carbenes for the Synthesis of N-Heterocyclic Carbene Copper(I) Complexes - Applications in the Oxidative Coupling of 2-Naphthols

Le présent mémoire décrit la synthèse et l’utilité de complexes Cu-NHC. En premier lieu, la synthèse de complexes de cuivre porteurs de ligand(s) de type carbène-N-hétérocyclique (NHC) via une génération décarboxylative de carbènes sera présentée. En effet, de précédents rapports font état de l’utilisation de carboxylates d’imidazol(in)ium en tant que précurseurs carbéniques sous conditions thermolytiques. Ainsi, la présente étude montre l’utilisation de ces espèces zwitterioniques pour la synthèse de complexes de cuivre(I) mono- et bis-NHC comportant divers substituants et contre-ions. Une seconde partie du projet se concentrera sur l’évaluation de complexes Cu-NHC en tant que catalyseurs pour la synthèse de 2,2’-binaphtols via une réaction de couplage oxydatif de naphtols. L’objectif de ce projet de recherche est d’étudier les effets de variations structurales de différents complexes Cu-NHC afin de construire un processus catalytique plus efficace. Les effets de la structure du catalyseur sur la réaction de couplage ont été évalués en variant son contre-ion, le nombre de ligands NHC se coordonnant au cuivre, ainsi que la nature des substituants du ligand.

Monohalogénocyclopropanations stéréosélectives à l'aide de carbénoïdes de zinc, couplages croisés de cyclopropylsilanols, cyclisations d'iodures d'alkyle catalysées par le nickel

Les cyclopropanes sont des unités qui sont très importantes en raison de leur présence dans de nombreux produits naturels, dans certaines molécules synthétiques ayant une activité biologique, ainsi que dans plusieurs intermédiaires synthétiques. Les travaux décrits dans cet ouvrage portent sur l’halogénocyclopropanation stéréosélective d’alcools allyliques en présence d’un ligand chiral stœchiométrique de type dioxaborolane et de carbénoïdes de zinc substitués dérivés de composés organozinciques et d’haloformes. Nous avons ainsi développé des conditions pour l’iodo-, la chloro- et la fluorocyclopropanation stéréosélective. Une étude mécanistique portant sur la nature des carbénoïdes alpha-chlorés et alpha-bromés a révélé qu’il y a un échange des halogènes portés par ces carbénoïdes. Lors de la chlorocyclopropanation, le carbénoïde le plus réactif (alpha-chloré) réagit de façon prédominante en vertu du principe de Curtin-Hammet. Les iodocyclopropanes énantioenrichis ont pu être fonctionnalisés via une réaction d’échange lithium-iode suivie du traitement avec des électrophiles, ou via une réaction de transmétallation au zinc suivie d’un couplage de Negishi. Ainsi, toute une gamme de cyclopropanes 1,2,3-substitués énantioenrichis a pu être synthétisée. Dans l’optique de développer de nouvelles méthodologies de fonctionnalisation des cyclopropanes, nous nous sommes par la suite tournés vers le couplage croisé de type Hiyama-Denmark des cyclopropylsilanols. Dans cette voie synthétique, le groupement silanol a deux fonctions : il sert de groupement proximal basique lors de la cyclopropanation de Simmons-Smith et il subit la transmétallation au cours du couplage croisé. Dans l’étape du couplage croisé, la nature des ligands liés à l’atome de silicium s’est avérée cruciale au bon déroulement de la réaction. Ainsi, l’échange de ligands avec le diéthyl éthérate de trifluoroborane générant le cyclopropyltrifluorosilane in situ est requis pour obtenir de bons rendements. Le dernier volet de cet ouvrage porte sur la cyclisation d’iodures d’alkyle par substitution aromatique par voie homolytique catalysée par le nickel. Une série de composés de type tétrahydronaphtalène et thiochromane ont été préparés selon cette méthode. Une étude mécanistique a confirmé la nature radicalaire de cette réaction et suggère fortement l’action catalytique du nickel. De plus, des études de spectrométrie RMN DOSY ont montré une association entre le complexe de nickel et le substrat ainsi que la base employés dans cette réaction.

Conception et synthèse d’aminoglycosides semi-synthétiques

Plusieurs aminoglycosides font partie d’une famille d’antibiotiques à large spectre d’action. Les aminoglycosides ayant une activité antibiotique viennent interférer dans la synthèse protéique effectuée par les bactéries. Les protéines mal codées entraineront la mort cellulaire. Au fil des années, de nombreux cas de résistance ont émergé après une utilisation soutenue des aminoglycosides. De nombreux aminoglycosides semi-synthétiques ont été synthétisés avec comme objectif de restaurer leur activité antimicrobienne. Parmi les modifications ayant connu du succès, notons la didésoxygénation d’un diol et l’introduction de la chaine latérale HABA. Des études précédentes ont montré l’efficacité de ces modifications sur les aminoglycosides. Les présents travaux portent sur l’installation de la chaine latérale HABA et la didésoxygénation d’un diol sur la paromomycine et la néomycine. La didésoxygénation sélective des diols a été effectuée en utilisant la méthodologie développée par Garegg et Samuelsson, une variation de la réaction de Tipson-Cohen. Cette méthode a permis l’obtention du motif didésoxygéné sur les cycles A et D dans des rendements jamais égalés pour ce motif synthétique. La chaîne latérale a été introduite en tirant profit de la réactivité et de la sélectivité d’un carbamate cyclique. Ces méthodes combinées ont permis la synthèse efficace de nombreux analogues semi-synthétiques nouveaux. La 3',4'-didéhydro-N-1-HABA-néomycine et la 3',4',3''',4'''-tétradésoxy-N-1-HABA-néomycine montrent une activité impressionnante contre des souches de bactéries résistantes aux aminoglycosides. Des tests de toxicité effectués en collaboration avec Achaogen Inc. ont démontré que ces composés sont relativement toxiques sur les cellules rénales de type H2K, ce qui réduit de façon importante leur index thérapeutique. Afin d’abaisser la toxicité des composés, la relation entre toxicité et basicité a été explorée. Des substitutions de l’amine en 6''' ont été effectuées afin d’abaisser la basicité de l’amine. Les résultats de toxicité et d’activité antimicrobienne démontrent une corrélation importante entre la basicité des amines et la toxicité/activité des aminoglycosides antibiotiques. L’effet d’une modulation du pKa a aussi été exploré en installant des chaines fluorées sur l’amine en 6''' de la paromomycine et de la néomycine. Une séquence synthtétique pour isoler l’amine en 6''' de la néomycine a aussi été développée.

C’est ici que le verbe habiter s’est déchiré ; suivi de Sudbury : l’habitabilité de la poésie chez Patrice Desbiens

Composé de fragments narratifs et poétiques, C’est ici que le verbe habiter s’est déchiré retrace le parcours d’un jeune homme de retour dans sa ville natale, Québec. En déambulant à travers les rues, mais également à travers sa propre mémoire, le narrateur trouvera sur son chemin le point de rupture entre passé et présent. C’est ici que le verbe habiter s’est déchiré élabore une réflexion sur ces lieux et ces époques qui, même révolus, semblent ne jamais vouloir nous quitter, le tout dans une écriture où le silence est parfois aussi éloquent que la parole. Comme son nom l’indique, Sudbury : l’habitabilité de la poésie chez Patrice Desbiens est un essai traitant de la poésie comme espace d’habitation dans Sudbury de Patrice Desbiens, une œuvre mettant en scène le quotidien d’une petite ville du nord de l’Ontario. Face à ce lieu froid et désert où rien ne semble vouloir subsister, dans cette ville qu’il décrit à la fois comme factice, violente et inhabitable, Desbiens semble croire que seule l’écriture est authentique et porteuse d’une vérité. Dès lors, en signant son recueil Sudbury, le nom de cette ville qu’il habite, le poète ne se pose-t-il pas comme le véritable auteur des lieux? Ne donne-t-il pas un sens à ce qui, auparavant, en était dépourvu? N’y a-t-il pas, au final, substitution de l’espace urbain oppressant par celui, plus hospitalier, de la poésie?

Développement de peptidomimétiques antagonistes du récepteur de l’interleukine-1β

Dans ce mémoire, je présente mes études sur la synthèse, la caractérisation et l’évaluation biologique de différentes séries d’analogues du D-heptapeptide appelé 101.10, un modulateur négatif allostérique du récepteur de l’interleukine-1β (IL-1β). Sachant que les peptides ont généralement de faibles propriétés pharmacologiques, le but de ce projet portait sur l’examen des structures nécessaires à la bioactivité, la conformation tridimensionnelle de ces derniers afin d’améliorer la droguabilité du peptide parent. Les stratégies d’optimisation du 101.10 utilisées furent : la coupure N- et C-terminale; la substitution par la proline, α-amino-γ-lactame (Agl), β-amino-γ-lactame (Bgl) et α-amino-β-hydroxy-γ-lactame (Hgl); et la rigidification du squelette à l’aide d’un bicycle, l’indolozidin-2-one (I2aa). Afin de clarifier certaines relations de structure-activité, quelques modifications furent apportées au peptide, incluant l’échange de la thréonine pour la valine, la permutation de la stéréochimie de certains résidus clés ainsi que le remplacement de certaines chaînes latérales par un méthyle. Pour pallier aux difficultés de reproductibilité des résultats avec des échantillons provenant de différentes sources, des études sur l’identité du contre-anion et la pureté du peptide furent conduites. Afin d’évaluer l’effet des modifications sur la conformation aqueuse et l’activité biologique du peptide, des analyses de dichroïsme circulaire et des tests in vitro mesurant l’inhibition de certains effets de l’IL-1β furent effectués. Ces essais cellulaires comportaient l’inhibition de la prolifération de cellules immunes et de l’activation des voies de signalisation inflammatoires du facteur nucléaire κB (NF-κB) et de la protéine kinase activée par mitogène (MAPK), toutes deux stimulées par l’IL-1β. La compilation de ces données a permis de déceler certaines tendances entre la structure, la conformation et l’activité anti-IL-1β des peptidomimétiques.

Fabrication, caractérisation et étude électrochimique de microcapsules conductrices à base de dérivés carbazole aminés pour la conception de biopiles enzymatiques

L’objectif général de cette thèse est de développer une plateforme d’immobilisation d’enzymes efficace pour application en biopile. Grâce à la microencapsulation ainsi qu’au choix judicieux des matériaux polymériques pour la fabrication de la plateforme d’immobilisation, l’efficacité du transfert électronique entre l’enzyme encapsulée et l’électrode serait amélioré. Du même coup, les biopiles employant cette plateforme d’immobilisation d’enzymes pourrait voir leur puissance délivrée être grandement augmentée et atteindre les niveaux nécessaires à l’alimentation d’implants artificiels pouvant remplacer des organes telque le pancréas, les reins, le sphincter urinaire et le coeur. Dans un premier temps, le p-phénylènediamine a été employé comme substrat pour la caractérisation de la laccase encapsulée dans des microcapsules de poly(éthylèneimine). La diffusion de ce substrat à travers les microcapsules a été étudiée sous diverses conditions par l’entremise de son oxidation électrochimique et enzymatique afin d’en évaluer sa réversibilité et sa stabilité. La voltampérométrie cyclique, l’électrode à disque tournante (rotating disk electrode - RDE) et l’électrode à O2 ont été les techniques employées pour cette étude. Par la suite, la famille des poly(aminocarbazoles) et leurs dérivés a été identifée pour remplacer le poly(éthylèneimine) dans la conception de microcapsules. Ces polymères possèdent sur leurs unités de répétition (mono- ou diamino) des amines primaires qui seraient disponibles lors de la polymérisation interfaciale avec un agent réticulant tel qu’un chlorure de diacide. De plus, le 1,8-diaminocarbazole (unité de répétition) possède, une fois polymérisé, les propriétés électrochimiques recherchées pour un transfert d’électrons efficace entre l’enzyme et l’électrode. Il a toutefois été nécessaire de développer une route de synthèse afin d’obtenir le 1,8-diaminocarbazole puisque le protocole de synthèse disponible dans la littérature a été jugé non viable pour être utilisé à grande échelle. De plus, aucun protocole de synthèse pour obtenir du poly(1,8-diaminocarbazole) directement n’a été trouvé. Ainsi, deux isomères de structure (1,6 et 1,8-diaminocarbazole) ont pu être synthétisés en deux étapes. La première étape consistait en une substitution électrophile du 3,6-dibromocarbazole en positions 1,8 et/ou 1,6 par des groupements nitro. Par la suite, une réaction de déhalogénation réductive à été réalisée en utilisant le Et3N et 10% Pd/C comme catalyseur dans le méthanol sous atmosphère d’hydrogène. De plus, lors de la première étape de synthèse, le composé 3,6-dibromo-1-nitro-carbazole a été obtenu; un monomère clé pour la synthèse du copolymère conducteur employé. Finalement, la fabrication de microcapsules conductrices a été réalisée en incorporant le copolymère poly[(9H-octylcarbazol-3,6-diyl)-alt-co-(2-amino-9H-carbazol-3,6-diyl)] au PEI. Ce copolymère a pu être synthétisé en grande quantité pour en permettre son utilisation lors de la fabrication de microcapsules. Son comportement électrochimique s’apparentait à celui du poly(1,8-diaminocarbazole). Ces microcapsules, avec laccase encapsulée, sont suffisamment perméables au PPD pour permettre une activité enzymatique détectable par électrode à O2. Par la suite, la modification de la surface d’une électrode de platine a pu être réalisée en utilisant ces microcapsules pour l’obtention d’une bioélectrode. Ainsi, la validité de cette plateforme d’immobilisation d’enzymes développée, au cours de cette thèse, a été démontrée par le biais de l’augmentation de l’efficacité du transfert électronique entre l’enzyme encapsulée et l’électrode.

Nouvelle approche pour modifier le tropisme des vecteurs adénoviraux à l’aide de ligands bispécifiques

L’adénovirus a été étudié dans l’optique de développer de nouveaux traitements pour différentes maladies. Les vecteurs adénoviraux (AdV) sont des outils intéressants du fait qu’ils peuvent être produits en grandes quantités (1X1012 particules par millilitre) et de par leur capacité à infecter des cellules quiescentes ou en division rapide. Les AdVs ont subi bon nombre de modifications pour leur permettre de traiter des cellules tumorales ou pour transporter des séquences génétiques exogènes essentielles pour le traitement de maladies monogéniques. Toutefois, les faibles niveaux d’expression du récepteur primaire de l’adénovirus, le CAR (récepteur à l’adénovirus et au virus coxsackie), réduit grandement l’efficacité de transduction dans plusieurs tumeurs. De plus, certains tissus normaux comme les muscles n’expriment que très peu de CAR, rendant l’utilisation des AdVs moins significative. Pour pallier à cette limitation, plusieurs modifications ont été générées sur les capsides virales. L’objectif de ces modifications était d’augmenter l’affinité des AdVs pour des récepteurs cellulaires spécifiques surexprimés dans les tumeurs et qui seraient exempts dans les tissus sains avoisinant. On peut mentionner dans les approches étudiées: l’utilisation de ligands bispécifiques, l’incorporation de peptides dans différentes régions de la fibre ou la substitution par une fibre de sérotypes différents. Notre hypothèse était que les domaines d’interaction complémentaire (K-Coil et ECoil) permettraient aux ligands de s’associer aux particules virales et d’altérer le tropisme de l’AdV. Pour ce faire, nous avons inclus un domaine d’interaction synthétique, le K-Coil,dans différentes régions de la fibre virale en plus de générer des mutations spécifiques pour abolir le tropisme naturel. Pour permettre la liaison avec les récepteurs d’intérêt dont l’EGF-R, l’IGF-IR et le CEA6, nous avons fusionné le domaine d’interaction complémentaire, le E-Coil, soit dans les ligands des récepteurs ciblés dont l’EGF et l’IGF-I, soit sur un anticorps à un seul domaine reconnaissant la protéine membranaire CEA6, l’AFAI. Suite à la construction des différents ligands de même que des différentes fibres virales modifiées, nous avons determiné tout d’abord que les différents ligands de même que les virus modifiés pouvaient être produits et que les différentes composantes pouvaient interagir ensemble. Les productions virales ont été optimisées par l’utilisation d’un nouveau protocole utilisant l’iodixanol. Ensuite, nous avons démontré que l’association des ligands avec le virus arborant une fibre modifiée pouvait entraîner une augmentation de transduction de 2 à 21 fois dans différentes lignées cellulaires. À cause de la difficulté des adénovirus à infecter les fibres musculaires occasionnée par l’absence du CAR, nous avons cherché à savoir si le changement de tropisme pourrait accroître l’infectivité des AdVs. Nous avons démontré que l’association avec le ligand bispécifique IGF-E5 permettait d’accroître la transduction autant dans les myoblastes que dans les myotubes de souris. Nous avons finalement réussi à démontrer que notre système pouvait induire une augmentation de 1,6 fois de la transduction suite à l’infection des muscles de souriceaux MDX. Ces résultats nous amènent à la conclusion que le système est fonctionnel et qu’il pourrait être évalué dans des AdVs encodant pour différents gènes thérapeutiques.

Étude de la protéine sigma 1 de réovirus par génétique inverse.

Réovirus, connu sous le nom REOLYSIN®, est présentement à l'étude à titre d'agent oncolytique. Or, la spécificité du virus pour les cellules cancéreuses pourrait être optimisée par une modification au niveau de la protéine d'attachement σ1. La présente étude vise à démontrer qu'une telle amélioration est possible par l'utilisation de la méthode nouvellement décrite de génétique inverse. Par cette technique, il est possible d'ajouter un polypeptide d'une longueur de quarante acides aminés à l'extrémité C-terminale de σ1. Il est aussi possible d'engendrer des virus mutés en leur site d'activité mucinolytique. Les virus nouvellement créés démontrent une efficacité de réplication diminuée, mais demeurent infectieux. Contrairement aux méthodes traditionnellement utilisées avec réovirus, la méthode de génétique inverse permet de conserver les mutations engendrées, par substitution ou addition, au cours des cycles de réplication. Une telle étude démontre qu'il serait possible de modifier le tropisme de réovirus.

Clustering algorithms and shape factor methods to discriminate among small GTPase phenotypes using DIC image analysis.

Naïvement perçu, le processus d’évolution est une succession d’événements de duplication et de mutations graduelles dans le génome qui mènent à des changements dans les fonctions et les interactions du protéome. La famille des hydrolases de guanosine triphosphate (GTPases) similaire à Ras constitue un bon modèle de travail afin de comprendre ce phénomène fondamental, car cette famille de protéines contient un nombre limité d’éléments qui diffèrent en fonctionnalité et en interactions. Globalement, nous désirons comprendre comment les mutations singulières au niveau des GTPases affectent la morphologie des cellules ainsi que leur degré d’impact sur les populations asynchrones. Mon travail de maîtrise vise à classifier de manière significative différents phénotypes de la levure Saccaromyces cerevisiae via l’analyse de plusieurs critères morphologiques de souches exprimant des GTPases mutées et natives. Notre approche à base de microscopie et d’analyses bioinformatique des images DIC (microscopie d’interférence différentielle de contraste) permet de distinguer les phénotypes propres aux cellules natives et aux mutants. L’emploi de cette méthode a permis une détection automatisée et une caractérisation des phénotypes mutants associés à la sur-expression de GTPases constitutivement actives. Les mutants de GTPases constitutivement actifs Cdc42 Q61L, Rho5 Q91H, Ras1 Q68L et Rsr1 G12V ont été analysés avec succès. En effet, l’implémentation de différents algorithmes de partitionnement, permet d’analyser des données qui combinent les mesures morphologiques de population native et mutantes. Nos résultats démontrent que l’algorithme Fuzzy C-Means performe un partitionnement efficace des cellules natives ou mutantes, où les différents types de cellules sont classifiés en fonction de plusieurs facteurs de formes cellulaires obtenus à partir des images DIC. Cette analyse démontre que les mutations Cdc42 Q61L, Rho5 Q91H, Ras1 Q68L et Rsr1 G12V induisent respectivement des phénotypes amorphe, allongé, rond et large qui sont représentés par des vecteurs de facteurs de forme distincts. Ces distinctions sont observées avec différentes proportions (morphologie mutante / morphologie native) dans les populations de mutants. Le développement de nouvelles méthodes automatisées d’analyse morphologique des cellules natives et mutantes s’avère extrêmement utile pour l’étude de la famille des GTPases ainsi que des résidus spécifiques qui dictent leurs fonctions et réseau d’interaction. Nous pouvons maintenant envisager de produire des mutants de GTPases qui inversent leur fonction en ciblant des résidus divergents. La substitution fonctionnelle est ensuite détectée au niveau morphologique grâce à notre nouvelle stratégie quantitative. Ce type d’analyse peut également être transposé à d’autres familles de protéines et contribuer de manière significative au domaine de la biologie évolutive.