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Pesquisa de factores de virulência em estirpes de Escherichia coli em resíduos de produção animal

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia

UMA ABORDAGEM YEAST TWO-HYBRID PARA O ESTUDO DA REPLICAÇÃO E PATOGÉNESE DO VÍRUS DA HEPATITE DELTA

O vírus da hepatite delta (HDV) é o agente etiológico de uma das formas mais graves de hepatite viral e é ainda endémico em diversas regiões do globo, nomeadamente em África, na Amazónia e no Extremo Oriente. O HDV co-infecta ou super-infecta hepatócitos infectados com o vírus da hepatite B (HBV) aumentando em cerca de 10 vezes o risco de cirrose e hepatite fulminante. A associação clínica entre os dois vírus deve-se ao facto do invólucro do HDV ser constituído pelos antigénios de superfície do HBV (HBsAgs) que são necessários para a propagação da infecção. O genoma do HDV é constituído por uma molécula de RNA de cadeia simples, circular, com cerca de 1.7 Kb, que possui cerca de 70% de emparelhamento interno. Foi identificada uma única grelha de leitura aberta (ORF) no RNA viral que codifica para o antigénio delta (HDAg). A ocorrência de um mecanismo de editing do RNA, resulta na expressão de duas formas do HDAg, a pequena (S-HDAg) e a grande (L-HDAg). Várias funções essenciais para a replicação do HDV têm sido atribuídas a ambas as formas do HDAg, sendo a S-HDAg essencial para a acumulação de RNA viral e a L-HDAg responsável pela interacção com os HBsAgs para formar partículas virais. No entanto, dada a simplicidade dos seus componentes, admite-se que a replicação viral depende das interacções estabelecidas entre os HDAgs e factores celulares do hospedeiro. Apesar do número considerável de factores celulares descritos como interactores dos HDAgs ou RNA virais, a importância de muitas destas interacções não foi elucidada e muitas etapas do ciclo de replicação do HDV permanecem pouco claras. Para além disso, dado o número limitado de factores do hospedeiro que estão envolvidos na sua replicação, é muito provável que um número elevado de interactores do HDV permaneça por identificar. Este trabalho teve como objectivo a identificação de proteínas de fígado humano capazes de interagir com os HDAgs, utilizando o sistema yeast Two-Hybrid (YTH). Identificaram-se trinta proteínas com capacidade de interagir com a S-HDAg no sistema YTH, sendo que estas proteínas se encontram envolvidas em diferentes processos celulares. Com base nas características funcionais, foram seleccionadas três destas proteínas e as suas interacções com a S-HDAg foram investigadas com maior detalhe. As três proteínas seleccionadas foram a ribonucleoproteína nuclear heterogénea C (hnRNPC), a embryonic lethal abnormal vision like1 (ELAVL1/HuR) e a proteína 2 de ligação a EBNA1 (EBP2). As duas primeiras são proteínas de ligação a RNA, previamente descritas como envolvidas em processos de replicações de outros vírus com genoma RNA, enquanto a EBP2, é uma proteína de localização preferencialmente nucleolar, tal como por vezes acontece com os HDAgs. As interacções foram analisadas recorrendo a vários ensaios bioquímicos. No caso da hnRNPC e da HuR, após validação no sistema YTH, a capacidade de interacção com a S-HDAg foi confirmada quer in vitro por blot overlay quer in vivo por co-imunoprecipitação em células de hepatoma humano. Nas mesmas células, observou-se uma co-localização considerável entre os HDAgs e os RNAs virais. Finalmente, de modo a investigar a contribuição das proteínas hnRNPC e HuR na replicação do HDV, procedeu-se ao silenciamento destas proteínas pela utilização de short hairpin RNAs (shRNAs) específicos para os mRNAs correspondentes Observou-se que o silenciamento de ambas as proteínas hnRNPC e HuR endógenas, individualmente resultou numa diminuição acentuada nos níveis de expressão dos HDAgs. No que respeita à EBP2, a interacção com a S-HDAg foi confirmada em condições in vitro com recurso a ensaios de blot overlay e de cromatografia de afinidade. A análise por imunofluorescência indirecta e microscopia confocal revelou co-localização elevada entre os HDAgs e a EBP2, principalmente nos nucléolos de células de hepatoma humano. Finalmente, foi ainda utilizado o sistema YTH para estudar os mecanismos de importação dos HDAgs. Assim, este sistema foi utilizado com o propósito de identificar proteínas celulares capazes de interagir com um domínio específico dos HDAgs, o sinal de localização nuclear (NLS). Na pesquisa YTH realizada obtiveram-se 161 clones positivos, sendo que um deles mostrou codificar para a carioferina α4 (KPNA4). A interacção da KPNA4 com a S-HDAg foi reproduzida em condições in vitro através de um ensaio de cromatografia de afinidade tendo sido utilizadas formas recombinantes das duas proteínas. Este trabalho permitiu identificar várias proteínas celulares que interagem com a S-HDAg. Obtiveram-se evidências sugestivas de que algumas das proteínas identificadas podem desempenhar funções importantes no ciclo de replicação do HDV e que abrem novas perspectivas para o estudo do ciclo de replicação do vírus.

Pesquisa de substâncias ilícitas em suplementos alimentares

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Desenvolvimento de membranas para aplicação em células de combustível a alta temperatura

Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica

Extensão Cardíaca de Carcinoma de Células Renais

Apresenta-se o caso de um homem de 62 anos de idade com um episódio de dispneia súbita que motivou estudo ecocardiográfico, o qual revelou uma massa na aurícula direita. A avaliação posterior demonstrou tratar-se de extensão de neoplasia do rim direito. A massa tumoral foi removida através duma abordagem multidisciplinar, com cirurgia torácica e abdominal. O estudo anatomopatológico mostrou tratar-se de um carcinoma de células renais.

Aborto recorrente das causas na mulher às consequências para o casal

RESUMO: O aborto recorrente (AR) é um evento extremamente traumático com grande impacto na vida dos casais. Apesar de avanços significativos verificados na investigação médica, cerca de 50% dos casos continua sem uma causa identificada. Alguns aspectos como a caracterização inadequada das doentes e das perdas gestacionais, assim como diferentes metodologias utilizadas no seu estudo, têm influenciado a prevalência de alguns dos factores causais e dificultado a compreensão do AR. Da mesma forma, pouco se sabe sobre as diferenças de género na vivência psicológica do aborto recorrente e das suas eventuais repercussões para o relacionamento do casal, centrando-se os poucos estudos existentes preferencialmente na mulher. Por esta razão, o objectivo desta tese foi a caracterização dos factores médicos associados ao AR e das consequências psicológicas desta entidade, contribuindo para promover estratégias clínicas baseadas na evidência específica. Na primeira parte desta tese (capítulos 1 e 2), após uma breve introdução geral e através de uma revisão da literatura, efectua-se uma reflexão sobre o tema, abordando a epidemiologia do aborto recorrente, os factores médicos e os aspectos psicológicos associados. Nos capítulos 3 e 4 descrevemos três estudos efectuados em mulheres portuguesas com aborto recorrente. O primeiro estudo teve por objectivo caracterizar os factores médicos e determinar o padrão da perda recorrente de gravidez, numa coorte de mulheres submetidas a um protocolo de diagnóstico definido. As participantes foram agrupadas de acordo com a paridade (AR primário ou secundário) e a idade gestacional das perdas (embrionárias ou fetais). As anomalias da cavidade uterina, a SAAF e as translocações equilibradas parentais foram os factores mais prevalentes. 15,6% das participantes eram obesas. Em 55,5% dos casos não foi identificado nenhum factor. A história obstétrica materna influenciou significativamente os resultados encontrados: os factores anatómicos e a SAAF foram mais prevalentes em nulíparas e as perdas inexplicadas foram mais frequentes em mulheres com AR secundário. Assim, os nossos dados reforçam os resultados de pesquisas anteriores sobre a importância da obesidade, da síndrome de anticorpos antifosfolípidos e das anomalias uterinas estruturais como factores associados ao AR e mostram que os a paridade é um moderador da importância desses factores. Capítulo 6 94 A ausência de resultados consensuais na literatura sobre a etiologia do AR condiciona a pesquisa sistemática de alguns factores, envolvendo exames dispendiosos, muitas vezes sem que exista evidência que suporte a sua associação com esta entidade. A trombofilia hereditária é uma das condições frequentemente investigadas nestas doentes. O nosso segundo estudo pretende contribuir para clarificar o papel de duas mutações (factor V Leiden e protrombina G20210A) na perda recorrente de gravidez e esclarecer a necessidade do seu rastreio nestas situações. Foi efectuada a pesquisa destes polimorfismos em 100 mulheres com AR inexplicado e num grupo de controlo de multíparas sem história de perdas de gravidez. Na nossa amostra não se verificou uma associação entre perdas embrionárias recorrentes e estas mutações. Nas mulheres com este tipo de perdas, a prevalência do FLV foi inclusive menor do que a verificada nos controlos. Pelo contrário, nas participantes com perdas fetais a prevalência destes polimorfismos foi muito superior à verificada nos controlos, sugerindo uma possível associação entre estas duas entidades. A pequena dimensão deste último subgrupo de mulheres, não nos permitiu contudo tirar conclusões. Uma investigação prospectiva multicêntrica é necessária antes de recomendar a pesquisa da trombofilia hereditária na investigação do AR. Procurámos incluir também nesta tese uma dimensão psicológica e contribuir assim para o conhecimento dos processos relacionais originados pelo AR. No terceiro estudo foram investigadas as diferenças de género na vivência do AR e o seu impacto no relacionamento e sexualidade do casal. Participaram neste estudo 30 casais sem filhos, com pelo menos 3 abortos espontâneos consecutivos. Cada membro do casal respondeu a um conjunto de questionários (Impact of Events Scale, Perinatal Grief Scale, Partnership Questionnaire e Intimate Relationship Scale). Os resultados mostram que as mulheres sofrem mais intensamente do que os homens com o AR, relacionando-se a intensidade do seu sofrimento com a qualidade do relacionamento conjugal. A sexualidade do casal é também afectada pelo stress e pelo sofrimento associados ao AR. Uma avaliação e acompanhamento deste tipo de problemas são imprescindíveis para ajudar estes casais a manterem a qualidade afectiva e sexual da sua relação. Finalmente, no capítulo 5 sumariámos as conclusões de toda a contribuição pessoal para a investigação sobre os factores associados e repercussões para o casal da perda recorrente de gravidez.-------------------ABSTRACT: Recurrent miscarriage (RM), a rare condition, has been described as a traumatic event for couples. Parental chromosomal anomalies, maternal thrombophilic disorders and structural uterine anomalies have been directly associated with RM. However, despite significant advances in medical research, the vast majority of cases remain unexplained. Aspects as the ethnic diversity of the population with different expression of genes, the inappropriate characterization of patients and of pregnancy losses, as well as different methodologies used in their study, have influenced the prevalence of etiological factors and have hampered the understanding of this problem. Similarly, little is known about gender differences in psychological experience of RM and its implications for the relationship of the couple. The first objective of this thesis is the characterization of the medical factors and of the psychological consequences related with RM, in the Portuguese population, helping to promote specific evidence-based clinical strategies. In the first part of this thesis, and after a brief general introduction (Chapter 1), a critical review of literature on the definition, the epidemiology and the dimensions involved, with a special emphasis on associated medical and psychological aspects of recurrent miscarriage, is presented (Chapter 2). In Chapters 3 and 4 we describe three studies carried out in Portuguese couples with RM. The first study aimed to investigate the etiological factors and the pattern of pregnancy loss in a cohort of women with RM. Subjects were divided in groups according to their parity (primary or secondary RM) and time of pregnancy loss (embryonic or fetal). Parental chromosome anomalies, uterine anomalies and antiphospholipid syndrome were the most prevalent medical factors. 15.6% of the women were obese. In the majority of cases (55.5%) no identifiable cause was detected. Parity influenced significantly our results. There was a higher prevalence of anatomic factors and antiphospholipid syndrome in primary RM. On the other hand, unexplained losses were more frequent in secondary RM. Except for the parental chromosomal abnormalities; the frequency of risk factors was similar among women with fetal or embryonic losses. Our data emphasizes the results of previous research on the importance of obesity, antiphospholipid syndrome and structural uterine abnormalities as known risk factors for RM, and shows that parity is an important moderator of the weight of those risk factors. Our second study aims to clarify the role of two mutations (factor V Leiden and prothrombin G20210A) and elucidate the need for their screening in Portuguese women with RM. FVL and PT G20210A analysis was carried out in 100 women with three or more consecutive miscarriages and a control group of 100 parous controls with no history of pregnancy losses. Secondary analysis was made regarding gestational age at miscarriage (embryonic and fetal loss). Overall the prevalence of FVL and PT G20210A was similar in RM women compared with controls. In the RM embryonic subgroup of women, FVL prevalence was inclusively lower than that of controls. Conversely in women with fetal losses both polymorphisms were much more frequent, although statistical significance was not reached due to the small size of this subgroup of patients. These data indicate that inherited maternal thrombophilia is not associated with RM prior to 10 weeks of gestation. Therefore, its screening is not indicated as an initial approach in Portuguese women with RM and a negative personal history of thromboembolic.96 Our second study aims to clarify the role of two mutations (factor V Leiden and prothrombin G20210A) and elucidate the need for their screening in Portuguese women with RM. FVL and PT G20210A analysis was carried out in 100 women with three or more consecutive miscarriages and a control group of 100 parous controls with no history of pregnancy losses. Secondary analysis was made regarding gestational age at miscarriage (embryonic and fetal loss). Overall the prevalence of FVL and PT G20210A was similar in RM women compared with controls. In the RM embryonic subgroup of women, FVL prevalence was inclusively lower than that of controls. Conversely in women with fetal losses both polymorphisms were much more frequent, although statistical significance was not reached due to the small size of this subgroup of patients. These data indicate that inherited maternal thrombophilia is not associated with RM prior to 10 weeks of gestation. Therefore, its screening is not indicated as an initial approach in Portuguese women with RM and a negative personal history of thromboembolic. In our third study, we investigate gender differences in RM experience and its impact on the couple's relationship and sexuality. Each member of 30 couples with RM answered a set of questionnaires, including the Impact of Events Scale (Horowitz et al., 1979), the Perinatal Grief Scale (Toedter et al., 1988), the Partnership Questionnaire (Hahlweg, 1979) and the Intimate Relationship Scale (Hetherington e Soeken, 1990). Results showed that men do grieve, but less intensely than women. Although the quality of the couple‟s relationship seemed not to be adversely affected by RM, both partners described sexual changes after those events. Grief was related to the quality of communication in the couple for women, and to the quality of sex life for men. An understanding of such issues is critical in helping these couples to maintain sexual and affective quality of their relationship. Finally, in Chapter 5, conclusions and clinical implications of all personal contribution to the investigation on associated factors and relational consequences of recurrent miscarriage are presented.

Células Endoteliais e Recuperação Visual

Na revisão bibliográfica encontramos perdas de céluas endoteliais que vão dos 4 aos 25%. Os vários estudos comparam EEC com e sem OVD, EEC e facoemulsificação, cataratas de diferente "dureza", entre outras variáveis. Também a idade, a ruptura do saco ou a perda de vítreo influenciavam estes resultados. As novas tecnologias para facoemulsificação como a peça de mão Ozil torsional que como o nome indica tem a capacidade de movimento torsional lateral (que desbasta a catarata além do movimento longitudinal da peça de mão convencional que emulsifica) torna os gestos cirúrgicos mais eficazes e seguros, reduzindo o traumatismo endotelial. Os AA fizeram um estudo prospectivo em que distribuíram 40 olhos de forma aleatória em dois grupos: 20 olhos foram operados por faco torsional e as restantes 20 cataratas foram operadas por faco convencional. Neste estudo comparativo entre faco torsional e convencional, o primeiro necessitou de menos ultrasons (0,048 versus 0,083), obteve uma acuidade visual média ligeiramente melhor (0,63 versus 0,54) e menor perda celular endotelial (3% versus 6,9%), no 1º dia de pós-operatório. Como se sabe, são múltiplos os factores que influenciam o resultado cirúrgico: o local e tamanho da incisão, a composição das soluções salinas, os dispositivos visco-elásticos, os produtos potencialmente tóxicos aplicados intra-operatoriamente, o tempo de cirurgia, a dureza da catarata, além das técnicas cirúrgicas e dos aparelhos utilizados.

A Experiência de Um Ano na Monitorização de Estenose Intracraniana nas Crianças com Anemia de Células Falciformes (Depranocitose) por Ecodoppler Transcraniano

O Laboratório de Neurossonologia do Hospital de S. José do CHLC, EPE propôs-se avaliar os registos velocimétricos obtidos na realização de Ecodoppler Transcraniano aos doentes em idade pediátrica portadores de Drepanocitose, durante o ano de 2010, verificando-se uma baixa incidência de estenose intracraniana.

Resolução de horários de exames com pesquisa local restringida

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Informática

Pesquisa de Fonte Embólica Cardíaca por Ecocardiografia Transesofágica: Revisão da Experiência de 12 Anos

INTRODUCTION: Peripheral embolism is frequently related to a cardiac source of embolism. Transesophageal echocardiography (TEE) is a useful tool for identifying such sources. OBJECTIVES: Our laboratory has gained wide experience in TEE, with a large number of exams performed to search for a cardiac source of embolism. We therefore thought it would be useful to present our experience in the last 12 years following the introduction of the technique. METHODS: This was a retrospective study of 1110 consecutive patients undergoing TEE to search for a cardiac source of embolism, after an embolic event and a transthoracic echocardiogram. RESULTS: The patients' mean age was 53 +/- 14 years, 52% male. There was peripheral embolism in 5% of cases and cerebral embolism in the remainder. The exam identified a potential embolic source in 35.6% of cases, the most frequent diagnoses being intracardiac shunt at the atrial level (9.5%), atrial septal aneurysm (ASA) (6.6%), intracardiac thrombi (6.4%) and atherosclerotic plaques in the thoracic aorta (9.6%). The presence of ASA was frequently associated with patent foramen ovale (27%), which was more frequent in younger patients. Overall, we identified a cardiac source of embolism more often in elderly patients, with a predominance of atherosclerotic plaques in the aorta. ETE was more frequently diagnostic in patients with peripheral embolism, but there were no differences in terms of etiology. CONCLUSIONS: TEE is very useful to search for cardiac sources of embolism, especially in younger patients, in whom causes potentially treatable surgically or percutaneously can be identified. In elderly patients, therapeutic strategy will probably not be changed by the findings (mostly thrombi and atherosclerotic plaques). The presence of ASA and embolic events makes it essential to perform a thorough search by TEE for intracardiac shunts, which are frequently associated.

Intervenção Percutânea Urgente no Enfarte Agudo do Miocárdio por Lesão do Tronco Comum

BACKGROUND: ST-elevation myocardial infarction (STEMI) with the culprit lesion in the left main artery is a rare cardiac emergency with a poor prognosis. OBJECTIVE: Review and prognosis evaluation of primary percutaneous coronary intervention (PCI) performed in the setting of STEMI with left main occlusion in a single high-volume center. METHODS: Of the 483 primary or rescue PCIs performed and followed in our hospital during a 24-month period (August 2004 to July 2006), we retrospectively evaluated those involving left main procedures and analyzed in-hospital mortality and major cardiac events (MACE) in a 12-month follow-up. We found nine patients, age 68 +/- 9 years, five male, seven with multivessel disease and two with isolated left main disease. Rescue PCI was performed in three patients and primary PCI in the others. RESULTS: Seven patients presented in cardiogenic shock and two were classified in Killip class II on admission. Inotropic drugs, intra-aortic balloon pump and abciximab were used in eight patients. Drug-eluting stents were used in six patients, bare-metal stents in two, and isolated balloon angioplasty in one. Five patients (55%) died in the hospital and the four discharged home (two of them aged 81 and 82 years) were still alive and free from MACE at 12-month follow-up. CONCLUSIONS: Clinical presentation of STEMI with the culprit lesion in the left main artery was very severe. During PCI, drug-eluting stents, intra-aortic balloon pump and abciximab were used in almost all patients. This entity had a high mortality rate even though primary PCI was performed. Those who survived had a good mid-term prognosis.

A Estenose Intracraniana na Doença das Células Falciformes

O Acidente Vascular Cerebral (AVC) pode ter como origem a perturbação da circulação causada por estenose intracraniana. A Doença das Células Falciformes (DCF) é uma doença hematológica grave, mais frequente na raça negra. Caracteriza-se por alterações da configuração eritrocitária, que surge sobretudo na microcirculação, condicionando redução do lúmen arterial e vasculopatia intracraniana, sendo avaliada por Doppler Transcraniano. Avaliação da prevalência de estenose intracraniana e risco de AVC nos doentes pediátricos com DCF, seguidos em consulta de Hematologia dos Hospitais Dona Estefânia e Fernando Fonseca, durante três anos. No período compreendido entre 1 de Janeiro de 2009 e 30 de Novembro de 2011 foram avaliadas 97 crianças e adolescentes (idade <18 anos). Para o diagnóstico de estenose foi usado um Ecógrafo com sonda de 2 MHz realizando o Exame Ultrassonográfico Trancraniano Codificado a Cores (ECODTC). Para análise dos parâmetros hemodinâmicos procedeu-se de acordo com o STOP (Stroke Prevention Trial in Sickle Anemia) que estratificou intervalos hemodinâmicos para Artéria Cerebral Média, a TAMM (Time-Average Mean of Maximum Velocity), classificando-se assim o risco de AVC em “Baixo ”(< 170cm/s), “Moderado”(170 e 200cm/s) e “Elevado”(>200cm/s). Foram efectuadas reavaliações em 12, 6 a 3 meses ou 1 mês de acordo com os dados encontrados. Os 97 doentes estudados (57 sexo masculino e 40 sexo feminino) tinham idades entre os 2 e os 18 anos (média de 10,07). Ao longo dos três anos documentaram-se 6 doentes com risco Elevado, 16 com risco Moderado e os restantes 75 com Baixo risco para AVC. A prevalência de estenose intracraniana é de 22,3% (risco Moderado e risco Elevado) e de 6,2% para doentes com risco Elevado de AVC. Dos 6 doentes que apresentaram risco Elevado para AVC, 4 iniciaram Regime Transfusional Regular (RTR), 1 foi medicado com hidroxiureia e 1 fez tratamento standard. No período estudado, apenas 1 doente teve AVC, após interromper temporariamente RTR. No grupo de doentes de risco Moderado nenhum sofreu AVC e no de Baixo risco 1 encontrava-se a fazer hidroxiureia e 2 doentes sofreram AVC mas antes de realizarem periodicamente ECODTC, encontrando-se sob RTR. A avaliação por ECODTC permitiu optimizar a terapêutica transfusional e o seguimento dos doentes, tendo como principal objectivo a redução da incidência de AVC e consequentes sequelas neurológicas. Agradecimento Às Unidades de Hematologia Pediátrica do Hospital Dona Estefânia e Fernando Fonseca, pelo envio dos doentes.