Ⅰ 虎杖聚酮类化合物生物合成相关基因的克隆及功能分析 Ⅱ 高山红景天酪醇生物合成代谢途径机制分析

Ⅰ 虎杖聚酮类化合物生物合成相关基因的克隆及功能分析 虎杖 (Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc) 属于蓼科蓼属多年生草本植物，在中国和日本民间曾被广泛用于动脉粥样硬化、高血压、咳嗽、化脓性皮肤炎以及淋病的治疗，具有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰等功效。而在现代医学上最令人瞩目和具有发展前景的是其在抗肿瘤、心血管保护、抗氧化方面的作用，相关疗效主要来自于虎杖中结构迥异、种类丰富的聚酮化合物及其衍生物资源。这些聚酮类化合物主要包括蒽醌、大黄素、大黄素-甲醚、大黄酚、芪类以及类黄酮化合物等。其中，大部分聚酮类化合物生物合成途径机制尚不明确，但可以肯定的是植物类型III聚酮合酶type III polyketide synthases (PKSs) 在这些聚酮化合物的生物合成起始反应中行使着关键的作用。因此，除了我们所熟悉的类黄酮化合物、芪类化合物之外，进一步分离和分析虎杖中其它重要聚酮类化合物生物合成所涉及的类型III聚酮合酶基因的是非常值得期待的。 目前，已经有14个植物类型III PKS基因被克隆和功能分析。植物类型III PKS的共同特征包括基因结构、序列相似性、保守的活性中心、酶学性质以及共同的催化机制等。显花植物（裸子植物和被子植物）中，植物类型III PKS的基因结构绝对保守，除了一个早期报道的金鱼草（Antirrhinum majus）查尔酮合酶chalcone synthase (CHS) 含有第二个内含子外，迄今为止所有已知的植物类型III PKS基因均含有一个内含子且该内含子位置保守。有趣的是，在本研究中，两个含有3个内含子的类型III PKS基因从虎杖中被分离，且两个基因3个内含子的位置完全保守，这是三内含子类型III PKS基因首次得到分离。除了新奇的基因结构外，体外功能分析显示上述两个基因还具有特殊的酶学性质和功能。 本论文围绕上述2个三内含子基因开展了以下工作： 虎杖中一个由三内含子基因编码的新型类型III聚酮合酶 一个类型III PKS的cDNA及其相应的基因（PcPKS2）从药用植物虎杖中被克隆。序列分析结果表明，PcPKS2的开放阅读框被3个内含子分隔，这是一个出人意料的发现，因为截至到目前为止，除了金鱼草一个CHS基因外，所有已知的类型III PKS基因均在固定位置上含有一个内含子。除了特殊的基因结构外，PcPKS2显示了一些有趣的特性：(i) CHS“守卫”苯丙氨酸——Phe215和Phe265在PcPKS2中双双缺失，它们分别被亮氨酸和半胱氨酸取代;(ii) 体外功能分析结果表明，当酶促反应体系的pH值为6.5-8.5时，大肠杆菌中过表达的重组PcPKS2高效地合成丁烯酮非环化产物——4-香豆酰甘油酸内酯（4-coumaroyltriacetic acid lactone (CTAL)）为主产物，而丙烯酮非环化产物bis-noryangonin (BNY) 以及苯亚甲基丙酮为副产物;而当酶促反应体系的pH值为9.0时，PcPKS2高效地合成苯亚甲基丙酮为主产物，而CTAL、BNY为副产物。另外，除了上述3种产物外，在不同的pH条件下，还有痕量的柚皮素查尔酮能被检测到。此外，在4-香豆酰辅酶A（4-coumaroyl-CoA）的类似化合物中，除了4-香豆酰辅酶A外，只有feruloyl-CoA能够被PcPKS2接受作为起始底物。PcPKS2不接受脂肪酰辅酶A——异丁酰基辅酶A（isobutyryl-CoA）、异戊酰基辅酶A（isovaleryl-CoA）以及乙酰辅酶A（acetyl-CoA）作为起始底物。Southern blot杂交结果表明，在虎杖基因组中存在2-4个PcPKS2基因的拷贝。Northern blot杂交结果表明，在根茎和幼叶中，PcPKS2表达量很高，而在根中无表达。叶中的PcPKS2的表达受病原菌诱导，但不受伤诱导。 虎杖中一个编码双功能类型III聚酮合酶的三内含子基因的鉴定 显花植物中，所有已知的类型III PKS 基因均含有一个内含子且位置绝对保守。本研究中，综合运用PCR技术，从富含聚酮类化合物的植物虎杖中克隆得到一个类型III PKS 基因（PcPKS1）及其cDNA。序列分析结果表明，PcPKS1含有3个内含子。系统发育分析结果表明，PcPKS1与其它植物的CHSs归为一类。然而，体外功能分析结果表明，当酶促反应体系pH值为7.0时，大肠杆菌中过表达的重组PcPKS1高效地合成柚皮素查尔酮（naringenin）为单一产物;而当pH值为9.0时，苯亚甲基丙酮（p-hydroxybenzalacetone）几乎为重组PcPKS1的唯一产物。后续的研究表明，与典型的CHSs相比，PcPKS1具有另外一些不同的特点：在pH值为9.0时（PcPKS1的苯亚甲基丙酮合成活性最适pH值），在4-香豆酰辅酶A的类似化合物中，只有feruloyl-CoA能够被PcPKS1接受作为起始底物。与CHSs展现出的对脂肪酰辅酶A宽泛的底物特异性不同，在不同的pH条件下，PcPKS1不接受异丁酰基辅酶A（isobutyryl-CoA）、异戊酰基辅酶A（isovaleryl-CoA）以及乙酰辅酶A（acetyl-CoA）作为起始底物。以上数据指出重组PcPKS1是一个具有查尔酮合酶（CHS）和苯亚甲基丙酮合酶（BAS）活性的双功能酶。Southern blot杂交结果表明，在虎杖基因组中存在2-4个PcPKS1基因的拷贝。Northern blot杂交结果表明，PcPKS1可能在防御病原菌和草食动物方面起着重要作用。PcPKS1和PcPKS2共同从虎杖中被分离的事实极有可能暗示了苯丁烷类化合物（phenylbutanoid）及其衍生物存在于虎杖中。 Ⅱ 高山红景天酪醇生物合成代谢途径机制研究 高山红景天（Rhodiola sachalinensis A. Bor）是景天科（Crassulaceae）红景天属多年生草本植物，作为一种适应原性中草药在中国的应用史已经超过800年。最近红景天提取物作为一种重要的商业药用制剂资源，其应用遍及欧洲、亚洲和美国，其主要治疗范围包括抗变应性和消炎，提高心理机敏性等。目前已经非常明确，红景天甙（salidroside）和甙元酪醇（tyrosol）是红景天属植物的主要功效成分，主要分布于这类植物的根中并且具有抗缺氧、抗疲劳、延缓衰老、预防紫外线辐射伤害等功效。红景天甙为酪醇8-O-β-D葡萄糖甙，是酪醇在葡萄糖基转移酶UDP-glucosyltransferase (UGT) 的催化下糖基化后形成的，可以认为是酪醇在植物体内的贮存形式。酪醇作为一种重要的活性分子，同样存在于橄榄树和葡萄酒中。 虽然已经非常明确酪醇来自于莽草酸代谢途径，然而其具体的生物合成途径及其调控仍不明确。总结以往的报道，在酪醇的生物合成上主要存在两种观点：一是酪醇可能来自于苯丙烷代谢途径产生的4-香豆酸（4-coumaric acid）前体;二是来自于酪氨酸的酪胺（tyramine）可能是酪醇生物合成的直接前体。我们的工作兴趣主要围绕着鉴别高山红景天中的酪醇生物合成途径展开： 高山红景天内源苯丙氨酸解氨酶PALrs1的过表达对红景天甙积累的影响 红景天甙是来自于药用植物高山红景天的一种适应原性新型药物，其生物合成途径可能起始于苯丙氨酸或酪氨酸。由于高山红景天野生植物资源的匮乏和相对含量很低，阐明红景天甙的生物合成途径对于增加红景天甙的供给至关重要。在我们以前的工作中，运用cDNA末端快速扩增技术（RACE），一个编码苯丙氨酸解氨酶phenylalanine ammonia-lyase (PAL)的cDNA从高山红景天中被克隆，命名为PALrs1。在本研究中，PALrs1置于35S启动子+Ω增强子序列的控制下通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法转化回高山红景天。PCR 和 PCR–Southern blot分析结果表明，PALrs1已经整合到了转基因植物的基因组上。Northern blot杂交结果表明，PALrs1已经获得在转录水平上的高水平表达。与预期的结果相同，高效液相色谱High-performance liquid chromatography (HPLC)测定结果显示PALrs1的过表达引起4-香豆酸含量增长3.3倍。然而，与之相反的是，酪醇和红景天甙含量与对照相比反而分别下降4.7和7.7倍。此外，我们发现PALrs1的过表达造成酪氨酸含量下降2.6倍。这些数据暗示着PALrs1的过表达和4-香豆酸的积累并不能促进酪醇的生物合成。酪醇，作为一种苯乙烷类衍生物并非来自苯丙氨酸，而酪氨酸含量的下降则极有可能是酪醇生物合成和红景天甙积累大规模下降的直接原因。

Role of vitamin E in growth of an Indian major carp, Catla (Catla catla)

A feeding trial was conducted to study the role of vitamin E in growth of Catla catla fry. Newly hatched larvae of Catla were fed with synthetic diet, supplemented with graded levels of vitamin E α0, 50, 100, 150, 200, 250 mg/Kg of diet. The spawn were fed with five times of their body weight for 30 days. Observation was made on the basis of survival, growth, daily weight gain and food conversion ratio. The significant weight gain and highest survival could be achieved by the diet supplemented with 150 mg of vitamin E per kg of the diet. The weight gain per day in 0, 50, 100, 150, 200 and 250 mg vitamin F/kg supplemented diet were 4.0, 5.2, 6.5, 7.8, 6.8 and 6.3 mg, while survival was 50, 51.8, 52.4, 52.8, 52.2 and 52% respectively.

SUB-BAND CODING TECHNIQUES FOR ROBUST 4. 8 TO 8 kb/s SPEECH CODERS.

This paper describes a speech coding technique that has been developed in order to provide a method of digitising speech at bit rates in the range 4. 8 to 8 kb/s, that is insensitive to the effects of acoustic background noise and bit errors on the digital link. The main aim has been to develop a coding scheme which provides speech quality and robustness against noise and errors that is similar to a 16000 b/s continuously variable slope delta (CVSD) coder, but which operates at half its data rate or less. A desirable aim was to keep the complexity of the coding scheme within the scope of what could reasonably be handled by current signal processing chips or by a single custom integrated circuit. Applications areas include mobile radio and small Satcomms terminals.

一种将有机羧酸转化为有机醛的制备方法

本发明涉及有机物的合成，具体的说是一种将有机羧酸转化为有机醛的制备方法。具体为在同一反应器中经两步反应，先将羧酸中的羧基转化为氧硼烷基化合物，然后加入质量为反应底物羧酸质量的0.1％-1.0％的2， 2，6，6-四甲基哌啶氧化物和反应底物羧酸当量的1.0-1.2倍的碱，在0-40 ℃下用反应底物羧酸当量的1.0-1.2倍的三氯异氰脲酸的丙酮溶液氧化为醛。本发明采用的一锅反应由有机羧酸制备醛的方法，反应条件温和、反应迅速，使用无毒氧化剂，反应过程绿色，工艺简单、易操作、易处理，有利于实现产业化。

聚合物膜离子选择性电极的制备与性能研究

聚合物膜离子选择性电极具有选择性高、使用简便、价格低廉等优点，在环境监测中日益受到人们的关注。这类电极的响应特性主要取决于聚合物膜相中起分子识别作用的离子载体的选择性。本文设计合成了一系列对重金属离子具有高选择性的有机配体，并将其作为电中性离子载体应用于银、汞、锌、铬等离子选择性电极中，实现了对重金属离子的高选择性测定。此外，我们对海水中有机物质的紫外线消解进行了研究，优化了消解条件，采用离子选择性电极技术实现了对海水中重金属污染物的快速检测。具体内容如下： 1、以硫氮杂冠醚为离子载体的银离子选择性电极制备及性能研究。 合成了一系列硫氮杂冠醚配体，通过优化反应条件，提高了反应产率，简化了产物处理过程。将此类冠醚作为离子载体用于银离子选择性电极的制备，并讨论了冠醚环大小、冠醚环的韧性以及硫原子个数对电极选择性的影响。在此研究基础上，利用沉淀-溶解平衡法调节内充液主离子浓度，采用冠醚9，10，12，13，24，25-六氢-5H，15H，23H-二苯[b，q][1，7，10，13，19，4，16]五硫二氮二十三环-6，16 (7H，17H)-二酮环作为低检出限银离子选择性电极载体，通过优化电极的内充液和聚合物膜组份，测得最低检出限为2.2×10-10 M，电极电位响应斜率为54.5 mV/dec.，线性范围为1.0×10-9-1.0×10-5 M，电极使用寿命为一个月。采用标准加入法，成功实现了自来水中银离子浓度的测试，并以该电极作为指示电极，以硝酸银溶液为滴定剂，成功滴定了I-、Br-和Cl-离子的混合液。 2、以1，2，4-三唑衍生物为离子载体的汞离子选择性电极的制备及性能表征。 设计合成了一种基于1，2，4-三唑的希夫碱结构化合物，3，5-二(二硫代甲酸苄酯肼基-2-亚甲胺基苯氧甲基)-1-(四氢-2H-吡喃)-1H-1，2，4-三唑，并成功用作中性载体实现对汞离子的测定。在最佳膜组分条件下，以该化合物作为载体的汞离子选择性电极的检出限为2.6×10-7 M Hg2+，电极电位响应斜率为29.3±0.3 mV/dec.，线性范围为1.0×10-6-3.0×10-4 M。该电极使用寿命为2个月，在pH 2.6-5.2范围内测试不受酸度影响。以该电极为指示电极，以EDTA为滴定剂，可准确滴定溶液中汞离子的浓度。 3、以希夫碱结构化合物为离子载体的锌离子选择性电极的制备及性能研究。 本文设计了一种含吡啶杂环的希夫碱结构化合物(E)-N'-(吡啶-2-亚甲胺基)-2-((E)-吡啶-2-亚甲胺基)苯甲酰肼，并成功用作离子载体实现对锌离子的测定。在最佳膜组分条件下，以该化合物为载体的锌离子选择性电极的检出限为7.4×10-7M Zn2+，电极电位响应斜率为25.9 mV/dec.，线性范围为1.0×10-6-1.0×10-3 M。该电极使用寿命为3个月，在pH 3.4-5.8范围内测试不受酸度影响。以该电极为指示电极，以EDTA为滴定剂，可准确滴定溶液中锌离子的浓度。 4、紫外光在线消解技术用于离子选择性电极测试海水中重金属离子的研究。 海水中重金属离子大多以络合物形式存在，而离子选择性电极只对游离态金属离子响应，因此要实现离子选择性电极测试海水中的重金属，首先必须使金属离子从络合物中游离出来。紫外光消解方法相对于其它海水预处理手段是一种清洁的样品预处理方法。我们以模拟海水为考察对象，考察了盐度、酸度、有机物浓度对消解效率的影响，并在优化消解条件的基础上对实际海水进行消解，利用离子选择性电极成功实现了海水中铜离子浓度的测试，测试值与ICP-MS数值一致。 5、合成希夫碱结构罗丹明B衍生物作为载体和分子探针用于Cr3+离子的检测。 设计合成了希夫碱结构罗丹明B衍生物2-亚甲胺基-8-乙酯基喹啉-罗丹明。荧光法显示，在化合物对铬离子(III)有较好的选择性，进而我们将该化合物作为分子探针进行了详细的研究。结果表明，分子探针与铬离子配位比为1:1，铬离子响应的线性范围是8.0×10-7-8.0×10-5 M，检测下限为1.9×10-7 M。电化学测试结果显示，基于该化合物为载体的离子选择性电极对铬离子(III)的选择性较差。

Status of the beach seine fishery in the Hambantota District during 1995-97

Beach seine fishery is one of the oldest fishing methods practiced in Sri Lanka. In the recent past several modifications were observed in the structure of the net and the material used in the construction of nets. beach seine nets made of nylon material were also reported at 4 operating sites out of 17-beach seine landing centers in the Hambantota District. However, traditional beach seine nets made of coir and kuralon were the common nets used in the area. Fishing season extends from September to April of the following year. However, beach seining at Mawella was carried out throughout the year. The estimated average annual effort for the entire study area was about 4250 operations. The mean annual catch rate at Mawella, Kalametiya and Welipatanwila were estimated as 81.8, 290.7, and 167.3 kg/operation respectively. The mean annual catch rate for the entire study area was estimated as 157.3 kg/operation. The beach seines recorded an estimated annual production of 662mt in the Hambantota district. Stoleophorous sp. has made the major contribution to the beach seine catches and it was about 31.7% of the total beach seine production. Leiognathus sp. Carangids and Trichuras sp. have produced 11.5%, 9.5% and 8.5% respectively while Amblygaster sirm and other Sardinella sp. have produced 5.5% and 4.9% respectively. A sirm was found during the months of November, February, March and July. The size range of A. sirm caught by beach seine during February –March period was in the range of 5-12cm (total length). Contribution by Rastrelliger sp. and Sphyreana sp. were 2.9% and 2.6% by each category. Average income of a beach seine operation at Mawella, Kalametiya and Welipatanwila were Rs. 3330/=, 10250/= and 6222/= per operation respectively.

应用染色体涂染法建立人和黑叶猴(Semnopithecus francoisi)的染色体同源性

应用荧光原位杂交技术中的染色体涂染法(Chromosomepainting)，以生物素标记的除Y染色体外的人全部整条染色体DNA特异性探针与黑叶猴的中期分裂相杂交，建立了人与黑叶猴之间的染色体同源性。除人的1、2、6、16和19号染色体特异探针分别与黑叶猴的2条非同源的染色体杂交外，其余人染色体特异探针均与黑叶猴的1条染色体杂交，其中有两对人染色体特异探针(14和15，21和22)分别杂交同一条黑叶猴染色体。在雌性黑叶猴的单倍染色体中，共检测到30个与人染色体具同源性的染色体和染色体片段。结果表明:黑叶猴的多数染色体与人染色体有高度同源性，仅有少数染色体发生了重排。将研究的结果与已报道的人染色体特异探针与其他灵长类的中期染色体杂交的结果进行比较，可以看出亚洲叶猴之间的相互关系较与非洲叶猴的更为密切。

云南矮马资源及种质研究总结

矮马在国内重新发现后，我们对云南矮马历经７年的调查研究，取得如下主要结果：（１）据史料记述，考古物证，血液蛋白多态测定，云南极可能是矮马渊源地；（２）对全省１２个地（州）实地调查及５个地（州）的了解，证明云南全省均有矮马，其数量占全国矮马总数的８５％～９０％，表明云南为矮马的中心产区。矮马的分布密度与生态环境、社会经济、文化、交通状况密切相关，与海拔、气温关系不大；（３）对正常的成年矮马和普通马，屠测６９项指标，其差异达显著和极显著水平的占５２．２７％；（４）对头骨形态和１０５项尺度观测，两种马间差异达显著和极显著水准的占７２．３８％，表明二者为独立的品种。通过臼齿大小及齿面雏褶形态鉴别，两者间存在明显差异，并确认两种马均为古老品种；（５）测定矮马、普通马的血液生理生化指标２８项４６个指标，有７个指标存在显著和极显著差异。（６）两种马的染色体数均为２ｎ＝６４，Ｃ带结构异染色质存在明显差异，反映出两种马间遗传进化上的差异；（７）对矮马、普通马的６种血液蛋白和同功酶测定，测到９个多态位点，结果在ＴＦ上两者有明显差异。对矮马、普通马样本，测定４４个遗传座位，１０个多态遗传座位中ＰＧＭ及ＴＦ在两品种间差异显著.

Mapping chromosomal homologies between humans and two langurs (Semnopithecus francoisi and S-Phayrei) by chromosome painting

Chromosomal homologies were established between human and two Chinese langurs (Semnopithecus francoisi, 2n=44, and S. phayrei, 2n=44) by chromosome painting with chromosome-specific DNA probes of all human chromosomes except the Y. Both langur species showed identical hybridization patterns in addition to similar G-banding patterns. In total, 23 human chromosome-specific probes detected 30 homologous chromosome segments in a haploid langur genome. Except for human chromosomes 1, 2, 6, 16 and 19 probes, which each gave signals on two non-homologous langur chromosomes respectively, all other probes each hybridized to a single chromosome. The results indicate a high degree of conservation of chromosomal synteny between human and these two Chinese langurs. The human chromosome 2 probe painted the entire euchromatic regions of langur chromosomes 14 and 19. Human chromosome 1 probe hybridized to three regions on langur autosomes, one region on langur chromosome 4 and two regions on langur chromosome 5. Human 19 probe hybridized on the same pattern to one region on chromosome 4 and to two regions on langur chromosome 5, where it alternated with the human chromosome 1 probe. Human 6 and 16 probes both hybridized to one region on each of the two langur autosomes 15 and 18. Only two langur chromosomes (12 and 21) were each labelled by probes specific for two whole human chromosomes (14 and 15 and 21 and 22 respectively). Comparison of the hybridization patterns of human painting probes on these two langurs with the data on other Old World primates suggests that reciprocal and Robertsonian translocations as will as inversions could have occurred since the divergance of human and the langurs from a common ancestor. This comparison also indicates that Asian colobines are karyotypically more closely related to each other that to African colobines.

云南马关保种无角山羊血液蛋白多态性研究

采用水平板淀粉胶电泳技术分析了云南马关保种无角山羊的血液蛋白多态性。对36个个体45个基因座位的分析得出:Esd、Pep-B、Lap、Akp、Ces-1、Ces-2共6个座位出现多态性,且Esd~(A)、Pep-B~(A)、Lap~(A)、Akp~(B)、Ces-1~(A)、Ces-2~(A)的基因频率较高。多态座位百分率P=0.133,平均杂合度H=0.04863。

Influence of stocking density on the culture potential of freshwater catfish Pangasius pangasius in pond

Influence of stocking density on the production of freshwater catfish Pangasius pangasius with formulated feed in ponds was studied. The fish fry were collected from the Meghna river near Chandpur which is a natural breeding ground of this fish. Three stocking densities chosen during this experiment were 5000, 8000 and 11000 fry/ha with an initial weight of 42.57 ±2.51 g. The formulated feed was prepared in the laboratory which contained 45% fish meal, 30% mustard oil cake, 15% wheat bran and 10% rice bran to supply 40.48% protein in feed. The growth of P. pangasius in terms of net weight gain was 409.49, 266.49 and 236.37 g at the 5000/ha, 8000/ha and 11000/ha stocking densities respectively, which was statistically significant (p<0.05). High food conversion ratio (FCR) was also observed during this research study which ranged between 7.06 to 7.72. A production of 2.6 tons/ha at the stocking density of 11000/ha; 2.13 tons/ha at the stocking density of 8000/ha and 2.04 tons/ha at the stocking density of 5000/ha was obtained, while the growth of individual fish at the end of experiment was in opposite order. The result of this experiment indicates that stocking density has significant influence on the culture potential of freshwater catfish P.pangasius.

A new anti-HIV lupane acid from Gleditsia sinensis Lam.

A new lupane acid, 2 beta-carboxyl, 3 beta-hydroxyl-norlupA (1)-20 (29)-en-28-oic acid (1), together with five known lupane acid derivatives (2-6), were isolated from the stings of Gleditsia sinensis Lam.. Their structures were elucidated on the basis of