Effect of 6-months of physical exercise on the nitrate/nitrite levels in hypertensive postmenopausal women

Abstract Background Evidences have showed that the incidence of arterial hypertension is greater in postmenopausal women as compared to premenopausal. Physical inactivity has been implicated as a major contributor to weight gain and abdominal obesity in postmenopausal women and the incidence of cardiovascular disease increases dramatically after menopause. Additionally, more women than men die each year of coronary heart disease and are twice as likely as men to die within the first year after a heart attack. A healthy lifestyle has been strongly associated with the regular physical activity and evidences have shown that physically active subjects have more longevity with reduction of morbidity and mortality. Nitric oxide (NO) produced by endothelial cells has been implicated in this beneficial effect with improvement of vascular relaxing and reduction in blood pressure in both laboratory animals and human. Although the effect of exercise training in the human cardiovascular system has been largely studied, the majority of these studies were predominantly conducted in men or young volunteers. Therefore, the aim of this work was to investigate the effects of 6 months of dynamic exercise training (ET) on blood pressure and plasma nitrate/nitrite concentration (NOx-) in hypertensive postmenopausal women. Methods Eleven volunteers were submitted to the ET consisting in 3 days a week, each session of 60 minutes during 6 months at moderate intensity (50% of heart rate reserve). Anthropometric parameters, blood pressure, NOx- concentration were measured at initial time and after ET. Results A significant reduction in both systolic and diastolic blood pressure values was seen after ET which was accompanied by markedly increase of NOx- levels (basal: 10 ± 0.9; ET: 16 ± 2 μM). Total cholesterol was significantly reduced (basal: 220 ± 38 and ET: 178 ± 22 mg/dl), whereas triglycerides levels were not modified after ET (basal: 141 ± 89 and ET: 147 ± 8 mg/dl). Conclusion Our study shows that changing in lifestyle promotes reduction of arterial pressure which was accompanied by increase in nitrite/nitrate concentration. Therefore, 6-months of exercise training are an important approach in management arterial hypertension and play a protective effect in postmenopausal women.

A serological follow-up of toxocariasis patients after chemotherapy based on the detection of IgG, IgA, and IgE antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay.

A serological follow-up study was carried out on 27 children (1–12 years old) with visceral and/or ocular toxocariasis, after treatment with thiabendazole. A total of 159 serum samples were collected in a period ranging from 22–116 months. Enzyme-linked immunosorbent assays (IgG, IgA, and IgE ELISA) were standardized, using excretory–secretory antigens obtained from the second-stage larvae of a Toxocara canis culture. The sensitivity found for the IgG, IgA, and IgE ELISA, as determined in visceral toxocariasis patients, was 100%, 47.8%, and 78.3%, respectively. Approximately 84% of the patients presented single or multiple parasitosis, as diagnosed by stool examination, yet such variables did not appear to affect the anti-Toxocara immune response. Titers of specific IgE antibody showed a significant decrease during the first year after treatment, followed by a decrease in the IgA titers in the second year, and in the IgG titers from the fourth year onwards. Sera from all patients presented high avidity IgG antibodies, indicating that they were in the chronic phase of the disease. Moreover, 1 year after treatment, the level of leukocytes, eosinophils, and anti-A isohemagglutinin in patients decreased significantly. The present data suggest that IgE antibodies plus eosinophil counts are helpful parameters for patient followup after chemotherapy.

Estimating subsoil resistance to nitrate leaching from easily measurable pedological properties

Leaching of nitrate (NO3-) can increase the groundwater concentration of this anion and reduce the agronomical effectiveness of nitrogen fertilizers. The main soil property inversely related to NO3- leaching is the anion exchange capacity (AEC), whose determination is however too time-consuming for being carried out in soil testing laboratories. For this reason, this study evaluated if more easily measurable soil properties could be used to estimate the resistance of subsoils to NO3- leaching. Samples from the subsurface layer (20-40 cm) of 24 representative soils of São Paulo State were characterized for particle-size distribution and for chemical and electrochemical properties. The subsoil content of adsorbed NO3- was calculated from the difference between the NO3- contents extracted with 1 mol L-1 KCl and with water; furthermore, NO3- leaching was studied in miscible displacement experiments. The results of both adsorption and leaching experiments were consistent with the well-known role exerted by AEC on the nitrate behavior in weathered soils. Multiple regression analysis indicated that in subsoils with (i) low values of remaining phosphorus (Prem), (ii) low soil pH values measured in water (pH H2O), and (iii) high pH values measured in 1 moL L-1 KCl (pH KCl), the amounts of surface positive charges tend to be greater. For this reason, NO3- leaching tends to be slower in these subsoils, even under saturated flow condition.

Antioxidant activity by DPPH assay of potential solutions to be applied on bleached teeth

The aim of this study was to assess, using the DPPH assay, the antioxidant activity of several substances that could be proposed to immediately revert the problems caused by bleaching procedures. The percentage of antioxidant activity (AA%) of 10% ascorbic acid solution (AAcidS), 10% ascorbic acid gel (AAcidG), 10% sodium ascorbate solution (SodAsS), 10% sodium ascorbate gel (SodAsG), 10% sodium bicarbonate (Bicarb), Neutralize® (NE), Desensibilize® (DES), catalase C-40 at 10 mg/mL (CAT), 10% alcohol solution of alpha-tocopherol (VitE), Listerine® (LIS), 0.12% chlorhexidine (CHX), Croton Lechleri (CL), 10 % aqueous solution of Uncaria Tomentosa (UT), artificial saliva (ArtS) and 0.05% sodium fluoride (NaF) was assessed in triplicate by 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl-hydrate (DPPH) free radical assay. All substances exhibited antioxidant activity, except for CL. AAcidS, AAcidG and VitE exhibited the highest AA% (p<0.05). On the contrary, CHX, NE, LIS and NaF showed the lowest AA% (p<0.05). In conclusion, AAcidS, AAcidG, SodAsS, SodAsG and VitE presented the highest antioxidant activity among substances tested in this study. The DPPH assay provides an easy and rapid way to evaluate potential antioxidants.

Screening bacterial metabolites for inhibitory effects against Batrachochytrium dendrobatidis using a spectrophotometric assay

Certain bacteria present on frog skin can prevent infection by the pathogenic fungus Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), conferring disease resistance. Previous studies have used agar-based in vitro challenge assays to screen bacteria for Bd-inhibitory activity and to identify candidates for bacterial supplementation trials. However, agar-based assays can be difficult to set up and to replicate reliably. To overcome these difficulties, we developed a semi-quantitative spectrophotometric challenge assay technique. Cell-free supernatants were prepared from filtered bacterial cultures and added to 96-well plates in replicated wells containing Bd zoospores suspended in tryptone-gelatin hydrolysate-lactose (TGhL) broth medium. Plates were then read daily on a spectrophotometer until positive controls reached maximum growth in order to determine growth curves for Bd. We tested the technique by screening skin bacteria from the Australian green-eyed tree frog Litoria serrata. Of bacteria tested, 31% showed some degree of Bd inhibition, while some may have promoted Bd growth, a previously unknown effect. Our cell-free supernatant challenge assay technique is an effective in vitro method for screening bacterial isolates for strong Bd-inhibitory activity. It contributes to the expanding field of bioaugmentation research, which could play a significant role in mitigating the effects of chytridiomycosis on amphibians around the world.

The use of a rapid assay to detect the neuraminidase production in oral Porphyromonas spp. isolated from dogs and humans

Neuraminidase was produced by 32.1% and 28.5% of Porphyromonas from dogs with and without periodontitis, respectively; and by 31.8% of bacteria from humans. The presence of neuraminidase in Porphyromonas spp. suggests that this enzyme can be involved with the pathogenesis of the periodontal disease, and the use of this assay to detect the neuraminidase production in oral Porphyromonas species is suggested.

A quantitative TaqMan PCR assay for the detection of Ureaplasma diversum

Ureaplasma diversum in veterinary studies is an undesirable microbe, which may cause infection in bulls and may result in seminal vesiculitis, balanopostitis, and alterations in spermatozoids, whereas in cows, it may cause placentitis, fetal alveolitis, abortion, and birth of weak calves. U. diversum is released through organic secretions, especially semen, preputial and vaginal mucus, conjunctival secretion, and milk. The aim of the present study was to develop a TaqMan probe, highly sensitive and specific quantitative PCR (qPCR) assay for the detection and quantification of U. diversum from genital swabs of bovines. Primers and probes specific to U. diversum 16S rRNA gene were designed. The specificity, detection limit, intra- and inter-assay variability of qPCR to detect this ureaplasma was compared with the results of the conventional PCR assay (cPCR). Swabs of vaginal mucus from 169 cows were tested. The qPCR assay detected as few as 10 copies of U. diversum and was 100-fold more sensitive than the cPCR. No cross-reactivity with other Mollicutes or eubacteria was observed. U. diversum was detected in 79 swabs (46.42%) by qPCR, while using cPCR it was detected in 42 (25%) samples. The difference in cPCR and qPCR ureaplasma detection between healthy and sick animals was not statistically significant. But the U. diversum load in samples from animals with genital disorders was higher than in healthy animals. The qPCR assay developed herein is highly sensitive and specific for the detection and quantification of U. diversum in vaginal bovine samples.

Comparison of flow cytometry and indirect immunofluorescence assay in the diagnosis and cure criterion after therapy of American tegumentary leishmaniasis by anti-live Leishmania (Viannia) braziliensis immunoglobulin G

The aim of this study was to compare the techniques of indirect immunofluorescence assay (IFA) and flow cytometry to clinical and laboratorial evaluation of patients before and after clinical cure and to evaluate the applicability of flow cytometry in post-therapeutic monitoring of patients with American tegumentary leishmaniasis (ATL). Sera from 14 patients before treatment (BT), 13 patients 1 year after treatment (AT), 10 patients 2 and 5 years AT were evaluated. The results from flow cytometry were expressed as levels of IgG reactivity, based on the percentage of positive fluorescent parasites (PPFP). The 1:256 sample dilution allowed us to differentiate individuals BT and AT. Comparative analysis of IFA and flow cytometry by ROC (receiver operating characteristic curve) showed, respectively, AUC (area under curve) = 0.8 (95% CI = 0.64–0.89) and AUC = 0.90 (95% CI = 0.75–0.95), demonstrating that the flow cytometry had equivalent accuracy. Our data demonstrated that 20% was the best cut-off point identified by the ROC curve for the flow cytometry assay. This test showed a sensitivity of 86% and specificity of 77% while the IFA had a sensitivity of 78% and specificity of 85%. The after-treatment screening, through comparative analysis of the technique performance indexes, 1, 2 and 5 years AT, showed an equal performance of the flow cytometry compared with the IFA. However, flow cytometry shows to be a better diagnostic alternative when applied to the study of ATL in the cure criterion. The information obtained in this work opens perspectives to monitor cure after treatment of ATL.

Inhibitors of Trypanosoma brucei trypanothione reductase: comparative molecular field analysis modeling and structural basis for selective inhibition

Background: Sleeping sickness is a major cause of death in Africa. Since no secure treatment is available, the development of novel therapeutic agents is urgent. In this context, the enzyme trypanothione reductase (TR) is a prominent molecular target that has been investigated in drug design for sleeping sickness. Results: In this study, comparative molecular field analysis models were generated for a series of Trypanosoma brucei TR inhibitors. Statistically significant results were obtained and the models were applied to predict the activity of external test sets, with good correlation between predicted and experimental results. We have also investigated the structural requirements for the selective inhibition of the parasite's enzyme over the human glutathione reductase. Conclusion: The quantitative structure-activity relationship models provided valuable information regarding the essential molecular requirements for the inhibitory activity upon the target protein, providing important insights into the design of more potent and selective TR inhibitors.

Importance and implication of respiration Quotient (RQ): a bacterial experimental assay with pseudomonia náutica and Vibrio natrigiensis

Máster en Oceanografía

Reinigung und Coexpression von Enzymen der Raubasin-Biosynthese

Die vorgestellten Arbeiten bezüglich der Biosynthese von pflanzlichen Indolalkaloiden können in einen molekularbiologischen und einen proteinche-mischen Teil aufgegliedert werden. Im molekularbiologischen Abschnitt stand die Entwicklung eines Vektorsystems im Vordergrund, das die gleichzeitige Expression mehrerer Enzyme in bakteriellen Kulturen erlaubte. Hierfür konnte zunächst die cDNA der Strictosidin-Synthase aus Rauvolfia serpentina in den Expressionsvektor pQE-70 einkloniert und das Protein aktiv exprimiert werden. Bevor es zum Einbau des Strictosidin-β-D-Glucosidase-Gens –ebenfalls aus Rauvolfia serpentina– kam, musste dessen Aktivität mit einer vorgeschalteten Ribosomenbindestelle sichergestellt werden. Diese zusätzliche Binderegion wurde an das 5’-Ende der cDNA angefügt, um die ungestörte Expression des Enzyms im späteren Coexpressions-System zu gewährleisten. Im Hinblick auf weiterführende Arbeiten in Bezug auf die komplette in vitro-Synthese bereits bekannter Alkaloide, wie z.B. das antiarrhythmisch wirkende Ajmalin oder das antihypertensiv wirkende Heteroyohimbin-Alkaloid Raubasin, wurde die ursprüngliche multiple-clonig-site des verwendeten Expressionsvektors pQE-70 um 27 zusätzliche Restriktionsschnittstellen (verteilt auf 253 bp) erweitert. Nach erfolgreicher Ligation der Strictosidin-β-D-Glucosidase-cDNA mit vorgeschalteter Ribosomenbindestelle an das 3’-Ende des Strictosidin-Synthase-Gens gelang die heterologe Coexpression beider Enzyme in einer homogenen Suspensionskultur des E. coli-Expressionsstamms M15. Dafür wurde das Vektorkonstrukt pQE-70bh-STR-RBS-SG entwickelt. Das Endprodukt der anschließenden enzymatischen Umsetzung von Tryptamin und Secologanin wurde über das Zwischenrodukt Strictosidin gebildet und konnte als Cathenamin identifiziert werden. Im proteinchemischen Teil der Dissertation wurde die Reinigung einer Cathenamin-Reduktase aus Zellsuspensionskulturen von Catharanthus roseus RC mit dem Ziel der partiellen Bestimmung der Aminosäuresequenz bearbeitet. Das gesuchte Enzym wandelte in einer NADPH-abhängigen Reaktion das Edukt Cathenamin in Raubasin um. Des weiteren wurde untersucht, wie viele Enzyme insgesamt an der Umwandlung von Cathenamin zu Raubasin und den eng verwandten Produkten Tetrahydroalstonin und 19-Epi-Raubasin beteiligt waren. Unter Anwendung eines hierfür entwickelten säulenchromatographischen Protokolls gelang die Reinigung einer Raubasin-bildenden Reduktase, deren Teilsequenz jedoch noch nicht bestimmt werden konnte. Die Anzahl der beteiligten Enzyme bei der Ausbildung von Raubasin, Tetrahydroalstonin und 19-Epi-Raubasin konnte auf mindestens zwei beziffert werden.

Endogene DNA-Schädigung als Ursache genetischer Instabilität

Zusammenfassung Diese Arbeit beschreibt Untersuchungen über die zellulären Mechanismen, die zur Bildung dieser DNA-Schäden führen, sowie über die biologischen Auswirkungen dieser Schäden. Die Untersuchungen zu Uracil in der DNA wurden in ung-knockout-MEFs und Mäusen durchgeführt, die es erlauben, die Konsequenzen eines Ausfalls der wichtigsten Reparaturglykosylase für Uracil zu beleuchten. Die Ergebnisse zeigen eine deutliche Akkumulation von Uracil in den ung-/--Mausfibroblasten im Vergleich zum Wildtyp. In frisch isolierten Leber- und Milzzellen der Mäuse konnte dieser genotypspezifische Unterschied, wenn auch weniger ausgeprägt, ebenso beobachtet werden, nicht jedoch in reifen Spermien. Dieser gewebespezifische Unterschied und die quantitativ stärker ausgeprägte Akkumulation in ung-/--Mausfibroblasten im Vergleich zu den Mäusegeweben gab Anlass zur Vermutung, dass die Proliferation der Zellen für den Haupteintrag an Uracil in die DNA verantwortlich ist. Erstmals konnte in Versuche mit konfluenten (nicht mehr proliferierenden) ung-/--Mausfibroblasten gezeigt werden, dass nicht die spontane hydrolytische Desaminierung von Cytosin, sondern der Fehleinbau von dUMP während der DNA-Replikation die Hauptquelle für Uracil in der DNA von Säugerzellen darstellt. Da der Uracilmetabolismus ein wichtiges Target in der Chemotherapie ist, lag es nahe, das zur Verfügung stehende ung-knockout-Modell der MEFs zur Untersuchung mit Fluorpyrimidinen, die als Zytostatika verwendet werden, einzusetzen. Da bisher die Ursachen der beobachteten Apoptose der Tumorzellen und aller anderen metabolisch hochaktiven Zellen eines behandelten Organismus noch nicht vollständig verstanden ist, wurden diese Zellen mit verschiedenen Fluorpyrimidinen behandelt, die als Thymidylatsynthasehemmer die de novo Synthese von Thymidin unterbinden. Es konnte gezeigt werden, dass ung-/- Mausfibroblasten, im Gegensatz zu ung+/+ Mausfibroblasten, verstärkt Uracil in der DNA akkumulieren. Obwohl die ung+/+ Mausfibroblasten keine erhöhten Uracil-Spiegel in der DNA aufwiesen, zeigten sie bei Inkubation mit einem der beiden Thymidylatsynthasehemmern, 5-Fluoruracil (5-FU), die gleiche Sensitivität in einem nachfolgenden Proliferationsversuch wie die ung-/- Mausfibroblasten. Dies lässt darauf schließen, dass weder Reparatur noch Einbau von Uracil in die DNA für die beobachtete Toxizität dieser Zytostatika notwendig sind. Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit war die Untersuchung des DNA-schädigenden Potenzials endogener ROS, die aus dem Fremdstoffmetabolismus stammen. Dazu wurden V79-Zellen verwendet, die mit dem humanen Enzym Cytochrom 2E1 (CYP2E1) transfiziert wurden (V79 CYP2E1) sowie Zellen, die ebenfalls durch Transfektion das humane Enzym Cytochromreduktase (auch Oxidoreduktase genannt) überexprimieren (V79 hOR). Beide Enzyme sind zusammen an der Hydroxylierung von Fremdstoffen beteiligt, bei der die Reduktion von molekularem Sauerstoff durch Übertragung von zwei Elektronen notwendig ist. Wird anstatt zweier Elektronen in Folge nur eines auf den Sauerstoff übertragen, so führt dieser von der Substratoxygenierung enkoppelte Vorgang zur Bildung von Superoxid. Daher galt es zu klären, ob das so erzeugte Superoxid und daraus gebildete ROS in der Lage sind, die DNA zu schädigen. Es konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von CYP2E1 nicht zu einem erhöhten basalen Gleichgewichtsspiegel oxidativer DNA-Schäden führt und die Metabolisierung von Ethanol durch dieses Enzym ebenfalls keine DNA-Modifikationen verursacht. Die Überexpression der Cytochromreduktase hingegen führte gegenüber dem Wildtyp zu einem erhöhten basalen Gleichgewichtsspiegel oxidativer Basenmodifikationen nach Depletion von Glutathion, einem wichtigen zellulären Antioxidans. Im Mikrokerntest, der gentoxische Ereignisse wie Chromosomenbrüche in Zellen aufzeigt, zeigte sich schon ohne Glutathion-Depletion eine doppelt so hohe Mikrokernrate im Vergleich zum Wildtyp. In weiteren Versuchen wurden die V79-hOR-Zellen mit dem chinoiden Redoxcycler Durochinon inkubiert, um zu untersuchen, ob das vermutlich durch die Reduktase vermittelte Redoxcycling über Generierung von ROS in der Lage ist, einen oxidativen DNA-Schaden und Toxizität zu verursachen. Hier zeigte sich, dass die Überexpression der Reduktase Voraussetzung für Toxizität und den beobachteten DNA-Schaden ist. Die Wildtyp-Zellen zeigten weder einen DNA-Schaden noch Zytotoxizität, auch eine zusätzliche Glutathion-Depletion änderte nichts an dem Befund. Die V79-hOR-Zellen hingegen reagierten auf die Inkubation mit Durochinon mit einer konzentrationsabhängigen Zunahme der Einzelstrangbrüche und oxidativen Basenmodifikationen, wobei sich der DNA-Schaden durch vorherige Glutathion-Depletion verdoppeln ließ.

Klonierung, heterologe Expression, Kristallisation und Struktur der Perakin-Reduktase aus Rauvolfia serpentina

Die Perakin-Reduktase (PR) ist ein hochspezifisches Enzym aus dem Alkaloidstoffwechsel in Rauvolfia serpentina, dessen enzymatischer und molekularer Reaktionsmechanismus noch immer unbekannt ist. Um die dreidimensionale Struktur der PR aufzuklären, wurde in der vorliegenden Arbeit das für die PR codierende Gen erstmals identifiziert, exprimiert und das Genprodukt zur Kristallisation gebracht. Die PR ist ein 337 Aminosäure langes monomeres Protein mit einem Molekulargewicht von 37,2 kDa. Die Reinigung erfolgte über Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie und lieferte 10 mg homogenes Protein pro Liter Bakterienkultur. Nach Expression in E. coli wurde im Enzym-Assay die NADPH2-abhängige Reduktion von Perakin zu Raucaffrinolin bestätigt und das Endprodukt massenspektrometrisch identifiziert. Durch Sequenzalignments mit anderen Proteinen wurde geschlossen, dass die PR zu der Superfamilie der Aldo/Keto-Reduktasen (AKR) gehört. Nach heterologer Expression in E. coli konnte die homogene, über reduktive Methylierung modifizierte PR mit Hilfe der Methode der Dampfdiffusion im hängenden Tropfen kristallisiert werden. In Gegenwart von 27% PEG 4000 und 100 mM Natriumcitrat (pH 5,6) bildeten sich nach 4 Tagen bei 20°C die ersten Kristalle. Die Struktur der PR konnte mit einer Auflösung von 2,0 Å durch molekularen Ersatz vollständig gelöst werden. Das Strukturmodell besitzt eine für AKRs charakteristische (α/β)8 TIM-barrel Faltung, konservierte Aminosäuren, die an der Bindung von NADPH2 beteiligt sind sowie eine katalytische Tetrade, die den Wasserstofftransfer von NADPH2 zum Kohlenstoff des Substrates vermittelt.