Utilisation of a novel ProteaseTag™ activity immunoassay for the specific measurement of neutrophil elastase in BAL from children with cystic fibrosis

Introduction: Neutrophil elastase (NE) is a serine protease implicated in the pathogenesis of several respiratory diseases including cystic fibrosis (CF). The presence of free NE in BAL is a predictor of subsequent bronchiectasis in children with CF (Sly et al, 2013, NEJM 368: 1963-1970). Furthermore, children with higher levels of sputum NE activity (NEa) tend to experience a more rapid decline in FEV1 over time even after adjusting for age, gender and baseline FEV1 (Sagel et al, 2012, AJRCCM 186: 857-865). Its detection and quantification in biological samples is however confounded by a lack of robust methodologies. Standard assays using chromogenic or fluorogenic substrates are not specific when added to complex samples containing multiple proteolytic and hydrolytic enzymes. ELISA systems measure total protein levels which can be a mixture of latent, active and protease-inhibitor complexes. We have therefore developed a novel assay (ProteaseTag™ Active NE Immunoassay), which couples an activity dependent NE-Tag with a specific antibody step, resulting in an assay which is both selective and specific for NEa. Aims: To clinically validate ProteaseTag™ Active NE for the detection of free NEa in BAL from children with CF. Methods: A total of 95 paediatric BAL samples [CF (n=76; 44M, 32F) non-CF (n=19; 12M, 7F)] collected through the Study of Host Immunity and Early Lung Disease in CF (SHIELD CF) were analysed for NEa using ProteaseTag™ Active NE (ProAxsis Ltd) and a fluorogenic substrate-based assay utilising Suc-AAPV-AMC (Sigma). IL-8 was measured by ELISA (R&D Systems). Results were analysed to show comparisons in free NEa between CF and non-CF samples alongside correlations with a range of clinical parameters. Results: NEa measured by ProteaseTag™ Active NE correlated significantly with age (r=0.3, p=0.01) and highly significantly with both IL-8 (r=0.4, p=<0.0001) and the absolute neutrophil count (ANC) (r=0.4, p=<0.0001). These correlations were not observed when NEa was measured by the substrate assay even though a significant correlation was found between the two assays (r=0.8, p<0.0001). A trend towards significance was found between NEa in the CF and non-CF groups when measured by ProteaseTag™ Active NE (p=0.07). Highly significant differences were found with the other inflammatory parameters between the 2 groups (IL-8: p=0.0002 and ANC: p=0.006). Conclusion: NEa as a primary efficacy endpoint in clinical trials or as a marker of inflammation within the clinic has been hampered by the lack of a robust and simple to use assay. ProteaseTag™ Active NE has been shown to be a specific and superior tool in the measurement of NEa in paediatric CF BAL samples (supporting data from previous studies using adult CF expectorated samples). The technology is currently being transferred to a lateral flow device for use at Point of Care. Acknowledgements: This work was supported by the National Children’s Research Centre, Dublin (SHIELD CF) and grants from the Medical Research Council and Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics.

Caseinolytic activity in gingival crevicular fluid from periodontitis patients

Introduction: Protease activity is essential for the progression of periodontal disease and several studies have shown that gingival crevicular fluid (GCF) proteases are associated with the attachment loss and bone destruction associated with periodontial disease. In addition to measuring protease levels using ELISA, it is also important to consider enzyme activity which can be measured using appropriate substrates. Aim: The aim of this work was to measure the proteolyitc activity in gingival crevicular fluid (GCF) from periodontitis patients using zymography and a fluorogenic protease substrate. Materials and Methods: Twenty four GCF samples were collected from patients with established periodontitis who had not received any periodontal treatment in the previous six months. A strip of perio-paper was inserted into the gingival crevice until light resistance was felt. After 30 seconds the perio-paper was removed and placed into 500 ul ice cold 0.01M sodium phosphate buffer, pH 7.2, containing 0.15M sodium chloride, vortex mixed for 30 seconds and stored at -80°C until required. GCF samples (10 ul) were electrophoresed on 4-16% Blue casein zymogram gels at 125V constant voltage for 90 min. Following electrophoresis the gel was washed in renaturation buffer for 30 min and then placed in developing buffer overnight. Areas of protease activity appeared as clear bands against a blue background. The total caseinolytic activity of each GCF sample was measured using a fluorescent assay with resorufin-labelled casein as the substrate. Results: The results showed that both casein zymography and fluorogenic assay methods were suitable for analysing caseinolytic activity in GCF samples from periodontitis patients. Caseinolytic activity was variable in the periodontitis samples studied and may reflect the episodic nature of the disease. Conclusion: Casein zymography and fluorogenic assay methods may be useful in future attempts to measure active episodes of periodontal disease.

Drug induced gingival overgrowth: A role for Protease Activated Receptors?

Background: Protease activated receptors (PAR) belong to a subfamily of G protein coupled receptors. They consist of seven transmembrane domains but are not classical receptors as their agonist is a circulating serine proteinase. This proteinase cleaves an N-terminal extracellular domain of the receptor to reveal a new N-terminal tethered ligand which binds intramolecularly, thus converting an extracellular proteolytic event into a transmembrane signal. Therefore, the cleavage and activation of PARs provide a mechanism whereby proteinases can directly influence the inflammatory response. Gingival hyperplasia or gingival enlargement is a side effect of some drugs such as cyclosporine, a potent immunosuppressant. To date, the potential role of PAR in the inflammation associated with the pathogenesis of gingival overgrowth has not been studied. Objectives: The present study was designed to determine whether proteinases derived from extracts of cyclosporine induced hyperplasia were capable of activating PAR in vitro. Methods: Cell lysates were derived from tissue obtained from gingival overgrowth of patients requiring surgical excision. Cell lines over-expressing PARs were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), containing 10% foetal calf serum (FCS) in 5% CO2. The cells were treated with gingival overgrowth lysates and agonist stimulated calcium release from the cells was recorded using the Fluo-4-Direct™ Calcium Assay Kit from Invitrogen, according to manufacturer's instructions. Results: Calcium release by activated PAR on tumour cells was detected in those treated with gingival hyperplasia lysates. Samples from healthy gingival fibroblasts did not elicit this response. Conclusions: The identification of mediators of the molecular events central to the inflammatory phenotype elicited by gingival hyperplasia is important. To this end, our experiments show that in vitro, enzymes derived from overgrown gingival tissue are capable of activating PAR and thereby provide evidence for the potential role of PAR in sustaining gingival hyperplasia.

Fatores de virulência em Aeromonas hydrophila causadora de septicémia em leitões

This work aims to contribute to determine the resistance profile to different antibiotics (ampicillin, gentamicin, penicillin G, oxytetracycline, lincomycin, neomycin, streptomycin, enrofloxacin, colistin sulfate, trimethoprim, sulfamide, tulathromycin, ceftiofur, amoxicillin/clavulanic acid), to assess genetic determinants associated to aminoglycoside antibiotics resistance, namely the presence of genes encoding acetyltransferases (AAC), phosphotransferases (APH) and nucletildiltranferases (ANT), determined by PCR studies, and to search for potentially pathogenic features as the production of extracellular lipases and proteases and the presence of genes encoding for putative virulence factors as aerolysin and related toxins, lipase proteins and type III secretion system component.

Carbapenemases of Serratia fonticola UTAD54

As carbapenemases, serínicas e metalo-β-lactamases (MBLs), formam um grupo cada vez mais importante de β-lactamases capazes de tornar as bactérias resistentes a antibióticos β-lactâmicos, incluindo carbapenemos utilizados como antibióticos de último recurso no tratamento de infecções causadas por bactérias multirresistentes. De modo a compreender melhor a relação estrutura-função deste grupo de enzimas, prosseguimos com a caracterização bioquímica e estrutural das carbapenemases SFC-1 e Sfh-I específicas de Serratia fonticola UTAD54, uma estirpe ambiental isolada previamente de águas de consumo não tratadas no Nordeste de Portugal. Ambas as β-lactamases foram sobre-expressas em Escherichia coli e purificadas por cromatografia líquida. A SFC-1 recombinante, uma carbapenemase serínica, hidrolisa eficientemente antibióticos β-lactâmicos de todas as classes e exibe, comparativamente a enzimas relacionadas (ex. KPC), uma maior eficiência contra a ceftazidima e uma menor susceptibilidade aos inibidores convencionais das β-lactamases. As estruturas do cristal da SFC-1 nativa e de complexos de mutantes, obtidos por mutagénese dirigida, com o meropenemo não hidrolisado e na forma de acetilenzima foram determinados por substituição molecular utilizando cristalografia de raios-X. A estrutura da SFC-1 contém todas as características conservadas do centro activo das carbapenemases de classe A. Nas estruturas dos mutantes o meropenemo aparece orientado no centro activo por Thr236 e Thr238, posicionando-o próximo da Ser130 para a transferência do protão. Nas enzimas de classe A inibidas por carbapenemos, a interacção com a Arg244 impõe uma orientação diferente do meropenemo ligado, prejudicando a transferência do protão. Estas constituem as primeiras estruturas de uma carbapenemase de classe A com um carbapenemo no centro activo e revelam que estas enzimas alteram a orientação do meropenemo ligado para promover a catálise, sem alteração significativa da estrutura geral. A Sfh-I, tal como as outras MBLs da subclasse B2, apresenta um perfil de substratos reduzido, que inclui maioritariamente os carbapenemos. A Sfh-I hidrolisa imipenemo e meropenemo com um kcat de 51 e 109 s-1 e um KM de 79 e 215 μM, respectivamente. A Sfh-I liga um equivalente de zinco, como demonstrado por espectrometria de massa. Contrariamente a enzimas da subclasse B2 previamente caracterizadas, a Sfh-I hidrolisa a cefepima, mostrando que a Sfh-I é uma MBL da subclasse B2 com propriedades únicas. Por espectroscopia de fluorescência mostrou-se que a Sfh-I é capaz de ligar até 3 equivalentes de zinco (Kd2 = 95 μM; Kd3 = 2.3 mM). A estrutura do cristal da Sfh-I, determinada por substituição molecular utilizando a CphA como modelo, é a primeira para uma MBL da subclasse B2 não ligada. Esta estrutura revela a disposição das moléculas de água no centro activo corroborando um mecanismo catalítico para as MBLs da subclasse B2 no qual a His118, em vez do Asp120 proposto anteriormente, activa a molécula de água nucleofílica.

Molecular reconstruction of a genetic code alteration

The genetic code establishes the rules that govern gene translation into proteins. It was established more than 3.5 billion years ago and it is one of the most conserved features of life. Despite this, several alterations to the standard genetic code have been discovered in both prokaryotes and eukaryotes, namely in the fungal CTG clade where a unique seryl transfer RNA (tRNACAG Ser) decodes leucine CUG codons as serine. This tRNACAG Ser appeared 272±25 million years ago through insertion of an adenosine in the middle position of the anticodon of a tRNACGA Ser gene, which changed its anticodon from 5´-CGA-3´ to 5´-CAG-3´. This most dramatic genetic event restructured the proteome of the CTG clade species, but it is not yet clear how and why such deleterious genetic event was selected and became fixed in those fungal genomes. In this study we have attempted to shed new light on the evolution of this fungal genetic code alteration by reconstructing its evolutionary pathway in vivo in the yeast Saccharomyces cerevisiae. For this, we have expressed wild type and mutant versions of the C. albicans tRNACGA Ser gene into S. cerevisiae and evaluated the impact of the mutant tRNACGA Ser on fitness, tRNA stability, translation efficiency and aminoacylation kinetics. Our data demonstrate that these mutants are expressed and misincorporate Ser at CUGs, but their expression is repressed through an unknown molecular mechanism. We further demonstrate, using in vivo forced evolution methodologies, that the tRNACAG Ser can be easily inactivated through natural mutations that prevent its recognition by the seryl-tRNA synthetase. The overall data show that repression of expression of the mistranslating tRNACAG Ser played a critical role on the evolution of CUG reassignment from Leu to Ser. In order to better understand the evolution of natural genetic code alterations, we have also engineered partial reassignment of various codons in yeast. The data confirmed that genetic code ambiguity affects fitness, induces protein aggregation, interferes with the cell cycle and results in nuclear and morphologic alterations, genome instability and gene expression deregulation. Interestingly, it also generates phenotypic variability and phenotypes that confer growth advantages in certain environmental conditions. This study provides strong evidence for direct and critical roles of the environment on the evolution of genetic code alterations.

Characterization of PPP1 interacting proteins in male reproduction

A fosforilação reversível de proteínas é um importante mecanismo de controlo em eucariotas. A fosfoproteína fosfatase 1 (PPP1) é uma fosfatase de serina/treonina envolvida em vários processos celulares. Existem três isoformas da subunidade catalítica (α/CA, δ/β/CB e γ/CC) com pequenas diferenças nos terminais amino e carboxílico. O gene PPP1CC sofre ainda splicing alternativo para produzir duas isoformas, a PPP1CC1 ubíqua e a PPP1CC2 enriquecida em testículo e específica de esperma. A localização e especificidade de substratos da PPP1 está dependente da formação de complexos oligoméricos com proteínas que interagem com a PPP1 (PIPs). O objetivo principal desta tese foi estudar novas PIPs, específicas de testículo e esperma, a fim de melhor caracterizar o papel desta fosfatase e dos respetivos complexos na reprodução em mamíferos. Com este fim, estudou-se a presença, localização e possíveis funções de uma PIP previamente conhecida, PPP1R2, e de duas novas PIPs, PPP1R2P3 e Tctex1d4. PPP1R2 e PPP1R2P3 estão presentes em esperma humano colocalizando com a PPP1CC2, na cabeça e na cauda. A hipótese é que as holoenzimas localizadas na cabeça terão um papel na reação acrossómica, enquanto que as holoenzimas presentes no axonema são relevantes para o controlo da motilidade flagelar. De seguida foram estudados os pseudogenes da PPP1R2, em termos de história evolutiva e de possíveis funções. Na espécie humana, a PPP1R2 tem 10 pseudogenes, 7 deles específicos de primatas. Estudos de bioinformática e dados de expressão mostram que os PPP1R2P1/P3/P9 são os pseudogenes com maior probabilidade de serem transcritos e traduzidos. Também identificámos o PPP1R2P9 em esperma humano e mostrámos que alguns pseudogenes poderão estar associados a estados fisiopatológicos. Isto indica que o processo de evolução poderá estar ligado á formação de novos genes ou ao controlo do mRNA da PPP1R2. A sobre-expressão da PPP1R2 ou PPP1R2P3 em testículo de ratinho também foi realizada, para caracterizar os mecanismos envolvidas na função dos complexos PPP1R2/PPP1R2P3-PPP1CC2 na espermatogénese e fisiologia dos espermatozoides. A dineína de cadeia leve, Tctex1d4, foi encontrada como interagindo com a PPP1C e como estando presente em testículo de ratinho e em esperma humano. Demonstrámos que a Tctex1d4 e a PPP1 colocalizam no centro organizador de microtúbulos e nos microtúbulos e que o motivo de ligação à PPP1 presente na Tctex1d4 parece ser importante para manter a PPP1 no centro organizador de microtúbulos e/ou para disromper ou atrasar o seu movimento ao longo dos microtúbulos emergentes. Estes resultados abrem novos caminhos para os possíveis papéis do complexo Tctex1d4-PPP1 na dinâmica dos microtúbulos, motilidade do esperma, reação acrossómica e na regulação da barreira hemato-testicular, provavelmente, através da via de sinalização do TGFß. A análise do motivo de ligação à PPP1 mostra que este é altamente conservado entre os mamíferos, com exceção das Pikas, sugerindo que esta perda aconteceu antes da radiação das Pikas, há 6-20 milhões de anos atrás. Através de um rastreio por mutações demonstrámos que a capacidade da Tctex1d4 se ligar à PPP1 é mantida nas Pikas, embora o motivo de ligação à PPP1 esteja disrompido. Este estudo abre portas para novas descobertas na área da reprodução mostrando o papel da PPP1CC2 na espermatogénese e fisiologia do esperma.

Cellular responses to genome mistranslation

Low level protein synthesis errors can have profound effects on normal cell physiology and disease development, namely neurodegeneration, cancer and aging. The biology of errors introduced into proteins during mRNA translation, herein referred as mistranslation, is not yet fully understood. In order to shed new light into this biological phenomenon, we have engineered constitutive codon misreading in S. cerevisiae, using a mutant tRNA that misreads leucine CUG codons as serine, representing a 240 fold increase in mRNA translational error relative to typical physiological error (0.0001%). Our studies show that mistranslation induces autophagic activity, increases accumulation of insoluble proteins, production of reactive oxygen species, and morphological disruption of the mitochondrial network. Mistranslation also up-regulates the expression of the longevity gene PNC1, which is a regulator of Sir2p deacetylase activity. We show here that both PNC1 and SIR2 are involved in the regulation of autophagy induced by mistranslation, but not by starvation-induced autophagy. Mistranslation leads to P-body but not stress-granule assembly, down-regulates the expression of ribosomal protein genes and increases slightly the selective degradation of ribosomes (ribophagy). The study also indicates that yeast cells are much more resistant to mistranslation than expected and highlights the importance of autophagy in the cellular response to mistranslation. Morpho-functional alterations of the mitochondrial network are the most visible phenotype of mistranslation. Since most of the basic cellular processes are conserved between yeast and humans, this study reinforces the importance of yeast as a model system to study mistranslation and suggests that oxidative stress and accumulation of misfolded proteins arising from aberrant protein synthesis are important causes of the cellular degeneration observed in human diseases associated to mRNA mistranslation.

Salivary proteomics and peptidomics of type 1 diabetes Mellitus

A Diabetes Mellitus (DM) compreende um conjunto de desordens metabólicas comuns caracterizadas por hiperglicemia, que afeta diferentes órgãos do organismo. Ao longo do tempo, ocorrem danos microvasculares no glomérulo renal, retina e nervos periféricos, bem como doença macrovascular nas artérias. A composição da saliva também é afetada pela DM, com consequências na homeostasia oral. No entanto, o proteoma e o peptidoma salivar têm sido pouco explorados na DM tipo 1 e nas suas complicações crónicas. Tendo em conta o crescente interesse na saliva como fluido diagnóstico, o objetivo principal deste trabalho foi avaliar os eventos proteolíticos subjacentes à DM tipo 1 e às suas complicações microvasculares, bem como, caracterizar as alterações induzidas pela DM tipo 1 no proteoma e peptidoma salivar. A DM tipo 1 e particularmente as complicações microvasculares associadas modulam o perfil proteolítico dos fluidos biológicos, com diferenças significativas de atividade observadas na urina e saliva, atribuídas principalmente ao complexo Metaloproteinase da Matriz (MMP)-9/lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos, aminopeptidase N, azurocidina e calicreína 1. O aumento da atividade proteolítica observado na saliva total dos diabéticos resultou no aumento da percentagem de péptidos, principalmente de um número acrescido de fragmentos de colagénio do tipo I, refletindo possivelmente um estado inflamatório crónico dos tecidos orais e periodontais. O peptidoma também corrobora uma maior suscetibilidade das proteínas salivares, especificamente, das proteínas ricas em prolina básicas (bPRP) 1, bPRP2 e proteínas ricas em prolina ácidas (aPRP) à proteólise, evidenciando a geração de fragmentos de proteínas associadas à ligação a bactérias. A análise do proteoma salivar baseada em iTRAQ mostrou uma sobre-expressão de L-plastina, fator do adenocarcinoma do pâncreas e das proteínas S100-A8 e S100-A9, enfatizando a importância do sistema imune inato na patogénese da DM tipo 1 e das complicações microvasculares associadas. A análise integrada de todas as proteínas expressas diferencialmente entre os pacientes diabéticos com ou sem complicações microvasculares e indivíduos saudáveis foi realizada com o STRING, onde se observam três conjuntos funcionalmente ligados, um compreende a interação entre o colagénio tipo I, colagénio tipo II e MMP-9, um segundo conjunto envolve a MMP-2 e o colagénio de tipo I e um terceiro conjunto composto por proteínas salivares e inflamatórias. Estes conjuntos estão associados com as vias Kegg de interação recetor-matriz extracelular, de adesão focal e migração transendotelial dos leucócitos. Por outro lado, a análise do proteoma e peptidoma salivar destacou potenciais biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico da DM tipo 1 e das suas complicações.

Studies of epithelial response to streptozotocin-induced hyperglycemia

A hiperglicemia é a principal característica da diabetes mellitus (DM), uma das causas de morte que mais cresce em Portugal, e cujas complicações a longo prazo são mais debilitantes e mais sobrecarregam os sistemas de saúde. No entanto, os mecanismos subjacentes à resposta fisiológica de alguns tecidos à hiperglicemia não estão completamente esclarecidos. Este estudo teve como objetivo avaliar de que forma o tempo de exposição à hiperglicemia afeta dois tecidos epiteliais, o endotélio e as glândulas salivares, que são frequentemente associados a complicações da DM, utilizando um modelo animal. Adicionalmente, procurou-se encontrar novos biomarcadores para avaliar a suscetibilidade a complicações orais em diabéticos, analisando as modificações pós-traducionais (PTMs) da família de proteínas mais representativa na saliva humana: proteínas ricas em prolina (PRPs). A disfunção vascular está na origem de várias complicações da diabetes. Neste sentido, observou-se uma progressiva disfunção endotelial com o aumento do tempo de exposição à hiperglicemia, que resulta do aumento de danos no endotélio e da diminuição da capacidade de mobilização de células progenitoras. Simultaneamente, o aumento observado na atividade da via de ativação do sistema de complemento mediada por lectinas (MBL), sugere um envolvimento do sistema de imunidade inata na patogénese da disfunção vascular. Outra complicação comum da DM é o desenvolvimento de doenças orais, nomeadamente as relacionadas com a redução da secreção salivar. Na análise às glândulas submandibulares, observou-se uma resposta inicial à hiperglicemia com fortes variações na expressão de proteínas, mas a longo prazo, estas variações foram atenuadas, sugerindo um mecanismo de adaptação à hiperglicemia crónica. Adicionalmente, as proteínas relacionadas com a secreção, como as anexinas, apresentaram-se sobre-expressas, enquanto as calicreinas e proteínas metabólicas estavam sub-expressas. Estas variações sugerem que, apesar de uma diminuição da capacidade de regeneração, as células tentam superar a perda de tecido por meio do aumento da secreção, embora sem êxito. O comprometimento funcional das glândulas salivares tem consequências na composição e funções da saliva. Analisando as PTMs das PRPs salivares humanas, observou-se um aumento da frequência de péptidos com ciclização de resíduos N-terminais de glutamina a piroglutamato, o que confere uma resistência à atividade proteolítica que, por sua vez, se encontra aumentada em diabéticos. Assim, a presença de péptidos com N-piroglutamato poderá ser um potencial biomarcador da suscetibilidade a complicações orais em diabéticos.

Phenotypic consequences of genome mistranslation in Candida albicans

Várias espécies do género Candida traduzem o codão CUG de leucine como serina. Em C. albicans este codão é traduzido pelo tRNACAG Ser de serina que é reconhecido por leucil- e seril-tRNA sintetases (LeuRS e SerRS), permitindo a incorporação de leucina ou serina em posições com CUG. Em condições padrão de crescimento os codões CUG é incorporam 3% de leucina e 97% de serina, no entanto estes valores são flexíveis uma vez que a incorporação de serina pode variar entre 0.6% e 5% em resposta a condições de stress. Estudos anteriores realizados in vivo em Escherichia coli sugeriram que a ambiguidade em codões CUG é regulada pela SerRS. De facto, o gene da SerRS de C. albicans tem um codão CUG na posição 197 (Ser197) cuja descodificação ambígua resulta na produção de duas isoformas de SerRS. A isoforma SerRS_Leu197 é mais ativa, apesar de menos estável, que a isoforma SerRS_Ser197, suportando a ideia da existência de um feedback loop negativo, envolvendo estas duas isoformas de SerRS, a enzima LeuRS e o tRNACAG Ser, que mantem os níveis de incorporação de leucina no codões CUG baixos. Nesta tese demonstramos que tal mecanismo não é operacional nas células de C. albicans. De facto, os níveis de incorporação de leucina em codões CUG flutuam drasticamente em resposta a alterações ambientais. Por exemplo, a incorporação de leucina pode chegar a níveis de 49.33% na presença de macrófagos e anfotericina B, mostrando a notória tolerância de C. albicans à ambiguidade. Para compreender a relevância biológica da ambiguidade do código genético em C. albicans construímos estirpes que incorporam serina em vários codões. Apesar da taxa crescimento ter sido negativamente afetada em condições padrão de crescimento, as estirpes construídas crescem favoravelmente em várias condições de stresse, sugerindo que a ambiguidade desempenha um papel importante na adaptação a novos nichos ecológicos. O transcriptoma das estirpes construídas de C. albicans e Saccharomyces. cerevisiae mostram que as leveduras respondem à ambiguidade dos codões de modo distinto. A ambiguidade induziu uma desregulação moderada da expressão génica de C. albicans, mas ativou uma resposta comum ao stresse em S. cerevisiae. O único processo celular que foi induzido na maioria das estirpes foi a oxidação redução. De salientar, que enriquecimento em elementos cis de fatores de transcrição que regulam a resposta à ambiguidade em ambas as leveduras foi distinta, sugerindo que ambas respondem ao stresse de modo diferente. Na globalidade, o nosso estudo aprofunda o conhecimento da elevada tolerância à ambiguidade de codões em C. albicans. Os resultados sugerem que este fungo usa a ambiguidade do codão CUG durante infeção, possivelmente para modular a sua interação com o hospedeiro e a resposta a drogas antifúngicas.

Mitochondrial plasticity in pathophysiological conditions

Both skeletal and cardiac muscles daily burn tremendous amounts of ATP to meet the energy requirements for contraction. So, it is not surprising that the maintenance of mitochondrial morphology, number, distribution and functionality in striated muscle are important for muscle homeostasis. In these tissues mitochondria present the added dimension of two populations, the intermyofibrillar (IMF) and the subsarcolemmal (SS) mitochondria, being IMF the most abundant one. In the present thesis, the molecular mechanisms harboured in mitochondria of striated muscles were studied using animal models, to better comprehend the role of mitochondrial plasticity in several pathophysiological conditions such as aging, diabetes mellitus and bladder cancer. The comparative analysis of IMF and SS populations isolated from heart evidenced a higher respiratory chain activity of mitochondria interspersed in the contractile apparatus. The higher susceptible of SS respiratory chain complexes subunits to carbonylation, but not to nitration, seems to justify the lower respiratory chain activity observed in this mitochondrial population. Our results showed that in heart from aged mice there is an accumulation of dysfunctional mitochondria. The age-related decrease of oxidative phosphorylation activity seems to be justified, at least partially, by the increased proneness of mitochondrial proteins as OXPHOS subunits and MnSOD to oxidative modifications. Moreover, a sedentary lifestyle seems to worsen the functional consequences of aging in heart by increasing mitochondrial proteins susceptibility to nitration. In skeletal muscle from rats with type 1 diabetes mellitus induced by streptozotocin administration, we verified the accumulation of dysfunctional mitochondria due, at least in part, to the impairment of PQC system. Indeed, the decreased activity of AAA proteases was accompanied by the accumulation of oxidatively modified mitochondrial proteins with impact in respiratory chain activity. The diminishing of mitochondria activity also underlies cancer-induced muscle wasting. Indeed, using a rat model of chemically induced urothelial carcinoma we verified that the loss of gastrocnemius mass was related to mitochondrial dysfunction due to, at least partially, the down-regulation of PQC system involving the mitochondrial proteases paraplegin and Lon. PQC impairment resulted in the accumulation of oxidatively modified mitochondrial proteins. In overall, regardless the pathophysiological stimuli that promote mitochondrial alterations, there are similarities in the pattern of disease-related mitochondrial plasticity. The diminished capacity for ATP production in striated muscle seems to be due to increased oxidative damage of mitochondrial proteins, namely subunits of respiratory chain complexes, metabolic proteins and MnSOD. Our data highlighted, for the first time, the impact of mitochondrial PQC system impairment in the accumulation of oxidized proteins, exacerbating the dysfunction of this organelle in striated muscle in several pathophysiological conditions.

Characterization of proteotoxic stress in zebrafish

A fidelidade da síntese proteica é fundamental para a estabilidade do proteoma e para a homeostasia celular. Em condições fisiológicas normais as células têm uma taxa de erro basal associada e esta muitas vezes aumenta com o envelhecimento e doença. Problemas na síntese das proteínas estão associados a várias doenças humanas e aos processos de envelhecimento. De facto, a incorporação de erros nas proteínas devido a tRNAs carregados pelas aminoacil-tRNA sintetases com o amino ácido errado causa doenças neurodegenerativas em humanos e ratos. Ainda não é claro como é que estas doenças se desenvolvem e se são uma consequência directa da disrupção do proteoma ou se são o resultado da toxicidade produzida pela acúmulação de proteínas mal traduzidas ao nível do ribossoma. Para elucidar como é que as células eucarióticas lidam com proteínas aberrantes e agregados proteicos (stress proteotóxico) desenvolvemos uma estratégia para destabilizar o proteoma. Para isso estabelecemos um sistema de erros de tradução em embriões de peixe zebra que assenta em tRNAs mutantes capazes de incorporar erradamente serina nas proteínas. As proteínas produzidas neste sistema despoletam as vias de resposta ao stress, nomeadamente a via da ubiquitina-proteassoma (UPP – “ubiquitin protesome pathway”) e a via do retículo endoplasmático (UPR – “unfolded protein response”). O stress proteotóxico gerado pelos erros de tradução altera a expressão génica e perfis de expressão de miRNAs, o desenvolvimento embrionário e viabilidade, aumenta a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), leva ainda à acumulação de agregados proteicos e à disfunção mitocondrial. As malformações embrionárias e fenótipos de viabilidade que observámos foram revertidos por antioxidantes, o que sugere que os ROS desempenham papéis importantes nos fenótipos degenerativos celulares induzidos pela produção de proteínas aberrantes e agregação proteica. Estabelecemos ainda uma linha de peixe zebra transgénica para o estudo do stress proteotóxico. Este trabalho mostra que a destabilização do proteoma em embriões de peixe zebra com tRNAs mutantes é uma boa metodologia para estudar a biologia do stress proteotóxico visto que permite a agregação controlada do proteoma, mimetizando os processos de agregação de proteínas que ocorrem naturalmente durante o envelhecimento e em doenças conformacionais humanas.

Molecular genomics of a genetic code alteration

The genetic code is not universal. Alterations to its standard form have been discovered in both prokaryotes and eukaryotes and demolished the dogma of an immutable code. For instance, several Candida species translate the standard leucine CUG codon as serine. In the case of the human pathogen Candida albicans, a serine tRNA (tRNACAGSer) incorporates in vivo 97% of serine and 3% of leucine in proteins at CUG sites. Such ambiguity is flexible and the level of leucine incorporation increases significantly in response to environmental stress. To elucidate the function of such ambiguity and clarify whether the identity of the CUG codon could be reverted from serine back to leucine, we have developed a forced evolution strategy to increase leucine incorporation at CUGs and a fluorescent reporter system to monitor such incorporation in vivo. Leucine misincorporation increased from 3% up to nearly 100%, reverting CUG identity from serine back to leucine. Growth assays showed that increasing leucine incorporation produced impressive arrays of phenotypes of high adaptive potential. In particular, strains with high levels of leucine misincorporation exhibited novel phenotypes and high level of tolerance to antifungals. Whole genome re-sequencing revealed that increasing levels of leucine incorporation were associated with accumulation of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and loss of heterozygozity (LOH) in the higher misincorporating strains. SNPs accumulated preferentially in genes involved in cell adhesion, filamentous growth and biofilm formation, indicating that C. albicans uses its natural CUG ambiguity to increase genetic diversity in pathogenesis and drug resistance related processes. The overall data provided evidence for unantecipated flexibility of the C. albicans genetic code and highlighted new roles of codon ambiguity on the evolution of genetic and phenotypic diversity.

Characterisation of ZG16p, a unique mammalian lectin from pancreatic zymogen granules

The mechanisms of secretory granule biogenesis and regulated secretion of digestive enzymes in pancreatic acinar cells are still not well understood. To shed light on these processes, which are of biological and clinical importance (e.g., pancreatitis), a better molecular understanding of the components of the granule membrane, their functions and interactions is required. The application of proteomics has largely contributed to the identification of novel zymogen granule (ZG) proteins but was not yet accompanied by a better characterization of their functions. In this study we aimed at a) isolation and identification of novel membrane-associated ZG proteins; b) characterization of the biochemical properties and function of the secretory lectin ZG16p, a membrane-associated protein; c) exploring the potential of ZG16p as a new tool to label the endolysosomal compartment. First, we have performed a suborganellar proteomics approach by combining protein analysis by 2D-PAGE and identification by mass spectrometry, which has led to the identification of novel peripheral ZGM proteins with proteoglycan-binding properties (e.g., chymase, PpiB). Then, we have unveiled new molecular properties and (multiple) functions of the secretory lectin ZG16p. ZG16p is a unique mammalian lectin with glycan and proteoglycan binding properties. Here, I revealed for the first time that ZG16p is highly protease resistant by developing an enterokinase-digestion assay. In addition I revealed that ZG16p binds to a high molecular weight complex at the ZGM (which is also protease resistant) and forms highly stable dimers. In light of these findings I suggest that ZG16p is a key component of a predicted submembranous granule matrix attached to the luminal side of the ZGM that fulfils important functions during sorting and packaging of zymogens. ZG16p, may act as a linker between the matrix and aggregated zymogens due to dimer formation. Furthermore, ZG16p protease resistance might be of higher importance after secretion since it is known that ZG16p binds to pathogenic fungi in the gut. I have further investigated the role of ZG16p binding motifs in its targeting to ZG in AR42J cells, a pancreatic model system. Point mutations of the glycan and the proteoglycan binding motifs did not inhibit the targeting of ZG16p to ZG in AR42J cells. I have also demonstrated that when ZG16p is present in the cytoplasm it interacts with and modulates the endo-lysosomal compartment. Since it is known that impaired autophagy due to lysosomal malfunction is involved in the course of pancreatitis, a potential role of ZG16p in pancreatitis is discussed.