Nerve growth factor overexpression and autocrine loop in breast cancer cells

We show here that nerve growth factor (NGF), the canonical neurotrophic factor, is synthesized and released by breast cancer cells. High levels of NGF transcript and protein were detected in breast cancer cells by reverse transcription-PCR, Western blotting, ELISA assay and immunohistochemistry. Conversely, NGF production could not be detected in normal breast epithelial cells at either the transcriptional or protein level. Confocal analysis indicated the presence of NGF within classical secretion vesicles. Breast cancer cell-produced NGF was biologically active, as demonstrated by its ability to induce the neuronal differentiation of embryonic neural precursor cells. Importantly, the constitutive growth of breast cancer cells was strongly inhibited by either NGF-neutralizing antibodies or K-252a, a pharmacological inhibitor of NGF receptor TrkA, indicating the existence of an NGF autocrine loop. Together, our data demonstrate the physiological relevance of NGF in breast cancer and its potential interest as a marker and therapeutic target.

Gene flow in great bustard populations across the Strait of Gibraltar as elucidated from excremental PCR and mtDNA sequencing

Recent advances in molecular biology have made it possible to use the trace amounts of DNA in faeces to non-invasively sample endangered species for genetic studies. Here we use faeces as a source of DNA and mtDNA sequence data to elucidate the relationship among Spanish and Moroccan populations of great bustards. 834 bp of combined control region and cytochrome-b mtDNA fragments revealed four variable sites that defined seven closely related haplotypes in 54 individuals. Morocco was fixed for a single mtDNA haplotype that occurs at moderate frequency (28%) in Spain. We could not differentiate among the sampled Spanish populations of Caceres and Andalucia but these combined populations were differentiated from the Moroccan population. Estimates of gene flow (Nm = 0.82) are consistent with extensive observations on the southern Iberian peninsular indicating that few individuals fly across the Strait of Gibraltar. We demonstrate that both this sea barrier and mountain barriers in Spain limit dispersal among adjacent great bustard populations to a similar extent. The Moroccan population is of high ornithological significance as it holds the only population of great bustards in Africa. This population is critically small and genetic and observational data indicate that it is unlikely to be recolonised via immigration from Spain should it be extirpated. In light of the evidence presented here it deserves the maximum level of protection.

Structural characterization of respiratory syncytial virus fusion inhibitor escape mutants: homology model of the F protein and a syncytium formation assay

Respiratory syncytial virus (RSV) is a ubiquitous human pathogen and the leading cause of lower respiratory tract infections in infants. Infection of cells and subsequent formation of syncytia occur through membrane fusion mediated by the RSV fusion protein (RSV-F). A novel in vitro assay of recombinant RSV-F function has been devised and used to characterize a number of escape mutants for three known inhibitors of RSV-F that have been isolated. Homology modeling of the RSV-F structure has been carried out on the basis of a chimera derived from the crystal structures of the RSV-F core and a fragment from the orthologous fusion protein from Newcastle disease virus (NDV). The structure correlates well with the appearance of RSV-F in electron micrographs, and the residues identified as contributing to specific binding sites for several monoclonal antibodies are arranged in appropriate solvent-accessible clusters. The positions of the characterized resistance mutants in the model structure identify two promising regions for the design of fusion inhibitors. (C) 2003 Elsevier Science (USA). All rights reserved.

Caracterização molecular, formação de biofilme e susceptibilidade a antimicrobianos de isolados de E. coli de aderência difusa Afa/Dr e não Afa/Dr

A Escherichia coli de aderência difusa (DAEC), um patotipo diarreiogênico de E. coli, corresponde a um grupo heterogêneo sem marcador de virulência comum a todos os isolados e de papel controverso na diarreia infantil. O objetivo deste estudo foi caracterizar genotipica e fenotipicamente amostras de DAEC, portadoras e não portadoras de adesinas Afa/Dr, isoladas de crianças com e sem diarreia. Em 70 amostras de DAEC, PCR foi realizado para pesquisa de genes descritos em DAEC, EAEC ou UPEC, que codificam: (i) oito adesinas fimbriais e afimbriais (fimH, papC, sfa, aggA, aafA, agg3A, aidA/aah, afaC); (ii) cinco toxinas (pet, astA, set1A, sat, hlyA); (iii) três proteínas captadoras/receptora de ferro (irp2, iucA, chuA/shuA); (iv) invasina (daaD) e; antígeno 43 (agn43). Ensaio de formação de biofilme foi realizado a partir da bactéria cultivada em caldo Luria-Bertani e inoculada em placas de poliestireno com DMEM suplementado com 0,4% glicose. A leitura da densidade ótica (DO490) foi realizada após coloração com safranina. Soroaglutinação para 23 antígenos O (Probac do Brasil) foi realizada em 50% das DAEC. Método de difusão de disco foi realizado para testar a suscetibilidade a 13 antimicrobianos. A presença de pelo menos um gene que codifica adesinas, toxinas, proteínas captadoras/receptora de ferro, invasina ou antígeno 43 foram encontrados em 58,6%, 51,4%, 80%, 48,6% e 57,1%, respectivamente, com os genes fimH, irp2, agn43, iucA, chuA/shuA, presentes em mais de 50% das amostras. Gene afaC+ (PCR) e/ou sonda afaBC+ (hibridização de colônias) classificou 50% das DAEC como Afa/Dr, sendo pet, sat, irp2, iucA, chuA/shuA e agn43 significantes nessas amostras (p<0,05). Do total das DAEC, 44,3% foram formadoras de biofilme, igualmente distribuídas entre as Afa/Dr e não Afa/Dr, e nenhum gene foi associado com esse fenótipo. Sorologia de 35 amostras evidenciou os seguintes sorogrupos: 1 O29, 2 O125, 2 O127 e 7 O86. Todas as O86 foram de DAEC Afa/Dr. Maiores frequências de resistência antimicrobiana foram encontradas para ampicilina (55,7%), sulfametoxazol/trimetoprim (35,7%) e tetraciclina (28,6%) e o perfil resistente/intermediário para amoxicilina/ácido clavulânico, ampicilina, sulfametoxazol/trimetoprim foi significante nas DAEC Afa/Dr, assim como a multi-droga resistência (p<0,05). Em conclusão, observou-se: (i) alta frequência de fimH e pet e presença de agn43, até então não descrito em DAEC, em frequências similares àquelas encontradas em EAEC, UPEC e EAEC/UPEC, respectivamente; (ii) que as amostras de DAEC Afa/Dr e não Afa/Dr constituíram grupos com perfis genéticos diferenciados entre si; (iii) poucos sorogrupos foram encontrados entre as DAEC; (iv) frequências de resistência menores quando comparado com as poucas descrições em DAEC, sugerindo uma menor pressão seletiva da população do presente estudo e; (v) amostras de DAEC Afa/Dr podem representar um importante reservatório de genes de resistência a antimicrobianos, além de diversos fatores de virulência.

Efeito da jabuticaba (Myrciaria caulifora), do fruto da palmeira juçara (Euterpe edulis Martius) e do jambolão (Syzugium cumini) sobre o perfil lipídico, a glicemia e a endotoxemia em camundongos submetidos à dieta de cafeteria

O excesso de gordura corporal induz a um quadro inflamatório associado à endotoxemia metabólica e aumento da resistência à insulina, bem como altera o perfil lipídico que resulta em prejuízos a função hepática e renal. Estudos sugerem que a ingestão de alimentos antioxidantes, como os polifenóis, proporcionam efeitos benéficos sobre os metabolismos glicídico e lipídico. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da casca de jabuticaba (Myrciaria cauliflora), da polpa do açaí juçara (Euterpe edulis Martius) e do jambolão (Syzygium cumini) sobre o perfil lipídico, a glicemia e a endotoxemia em camundongos Swiss submetidos à dieta de cafeteria. Inicialmente, os frutos foram liofilizados e submetidos à avaliação da composição centesimal. O ensaio biológico contou com 50 camundongos machos adultos da raça Swiss distribuídos em 5 grupos (n=10/grupo), a saber: grupo tratado com dieta comercial padrão (controle negativo), grupo tratado com dieta de cafeteria (controle positivo) e grupos teste que receberam por 14 semanas a dieta de cafeteria suplementada com 2% de casca de jabuticaba, ou polpa do jambolão ou polpa do açaí juçara liofilizados. Na 13ª e 14ª semana foram determinadas a tolerância à insulina e à glicose dos animais. Ao final do período experimental, avaliaram-se o ganho de peso, os parâmetros bioquímicos sanguíneos, histopatológicos e endotoxemia. Os parâmetros bioquímicos avaliados foram: colesterol total (CT) e as frações HDL-c, LDL-c, triacilgliceróis (TAG), bem como proteína C reativa (PCR), aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT). Na histopatologia foram avaliados os efeitos da dieta hipercalórica sobre a área dos adipócitos, esteatose hepática e função renal a partir do número e área dos glomérulos. A endotoxemia foi avaliada pela concentração de lipopolissacarídeos (LPS) no soro dos animais. Aplicou-se o teste t para comparação dos resultados entre os grupos controle e ANOVA, complementada com teste de Tukey (α=5%), para comparação dos grupos suplementados com os frutos e o controle positivo. A suplementação com 2% de jambolão à dieta de cafeteria resultou em redução significativa (p<0,05) do conteúdo de CT, LDL-c, TAG, da razão CT/HDL, bem como diminuição da área dos adipócitos dos animais tratados com os frutos. A suplementação com açaí juçara também foi capaz de reduzir o conteúdo de CT, TAG e a área dos adipócitos, além de elevar a tolerância à glicose. Por outro lado, a jabuticaba não foi eficaz na melhoria dos parâmetros relacionados ao metabolismo lipídico, ao metabolismo da glicose e dos aspectos histopatológicos. A suplementação com 2% dos frutos liofilizados não promoveu efeitos positivos na redução do ganho de peso, resistência à insulina e endotoxemia provocada pela ingestão da dieta de cafeteria. Além disso, os frutos também não foram eficientes na preservação da histologia renal e infiltração lipídica no fígado. Conclui-se que a inclusão do jambolão e do açaí juçara na dieta pode apresentar efeitos positivos sobre danos causados por dietas hiperlipídicas, especialmente no que se refere à dislipidemia, à tolerância à glicose e à hipertrofia dos adipócitos.

Prevalência elevada do Alloiococcus otitidis na otite média com efusão através da PCR simultânea

A etiologia da otite média com efusão (OME) não é completamente conhecida, mas agentes infecciosos podem contribuir para sua patogênese. O conhecimento sobre a epidemiologia bacteriana da OME em áreas geográficas distintas é essencial para a implementação de tratamentos racionais, quando indicados. OBJETIVO: Determinar a prevalência do Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis e Alloiococcus otitidis nas efusões da orelha média de crianças com otite média recorrente (OMR) e otite média com efusão crônica (OMEC) que foram submetidas à miringotomia e comparar os resultados obtidos por cultura e PCR. FORMA DE ESTUDO: Estudo clínico com coorte transversal. MATERIAL E MÉTODO: 128 efusões obtidas por timpanocentese de 75 crianças entre 11 meses e 10 anos de idade foram analisadas por cultura e PCR simultânea. RESULTADOS: Cultivaram-se bactérias em 25,1% das amostras e os patógenos principais foram encontrados em 19,6%. O A.otitidis não foi isolado em cultura. A PCR identificou bactérias em 85,9%, com os seguintes resultados individuais: A.otitidis, 52,3%; H.influenzae, 39,1%; S.pneumoniae, 12,5% e M.catarrhalis, 10,2%. A PCR foi significativamente mais sensível que a cultura (P<0,01). O S.pneumoniae foi mais encontrado em OMR do que em OMEC (P=0,038). CONCLUSÕES: A prevalência das bactérias na OME em um grupo de crianças brasileiras é semelhante àquelas relatadas em outros países, sendo o H.influenzae o mais encontrado dentre os patógenos principais da orelha média. O S.pneumoniae foi mais freqüente em OMR do que em OMEC. A PCR é mais sensível na detecção de bactérias na efusão da orelha média, comparada com cultura, e é essencial para a identificação do A.otitidis. O elevado percentual de detecção do A.otitidis sugere mais investigações sobre sua atuação no início e no prolongamento de doenças da orelha média.

Efeito da mitomicina C em polipose nasossinusal eosinofílica, in vivo: dosagem de IL5 e GM-CSF, RT-PCR

A polipose nasossinusal eosinofílica (PNS) é manifestação de uma doença inflamatória crônica na mucosa do nariz e nos seios paranasais caracterizada por infiltração de granulócitos eosinófilos. O fator responsável pela eosinofilia e manutenção dessas células com a perpetuação do processo inflamatório e formação polipóide é objeto constante de estudos. As citocinas como IL5 (interleucina 5) e GM-CSF (fator estimulador de colônia granulócito macrófago) aumentam a sobrevida dos eosinófilos e prolongam a sua presença no tecido polipóide, diminuindo o índice de apoptose eosinofílica. OBJETIVO: Avaliar o efeito da mitomicina C - MMC - por meio de aplicação tópica em pacientes portadores de PNS eosinofílica quanto à presença de IL5 e GM-CSF. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Quinze pacientes portadores de PNS eosinofílica foram submetidos à aplicação tópica de MMC na concentração de 0,5mg/ml, 1ml, durante cinco minutos, na cavidade nasal direita, e submetidos à biópsia para RT-PCR 24hs após. O grupo-controle foi a cavidade nasal esquerda. O perfil de citocinas foi analisado para IL5 e GM-CSF. RESULTADOS: A comparação dos resultados de GM-CSF pré e pós-uso de MMC quando usamos o teste t pareado apresenta p=0,041. A comparação para IL5 resulta em p < 0,001. CONCLUSÃO: O uso de MMC em pacientes com PNS mostra redução com significância estatística par GM-CSF e importante significância para IL5.

Análise de citocinas pela RT-PCR em pacientes com rinite alérgica

Rinite alérgica é uma doença que decorre de um processo inflamatório da mucosa nasal conseqüente à reação de hipersensibilidade a alérgenos inalatórios e, eventualmente, alimentares. É mediada por IgE, envolvendo diferentes células, mediadores e citocinas. OBJETIVO: Avaliar as transcrições para as seguintes citocinas: IL-4, IL-5, IL-8 e IFN-gama, particularmente importantes no processo alérgico nasal, principalmente IL-4 e IL-5. Neste estudo, optou-se por avaliar os pacientes atópicos fora das crises alérgicas, com a finalidade de se conhecer as expressões das citocinas neste período. MATERIAL E MÉTODO: Realizou-se um estudo transversal e prospectivo, selecionando-se 30 pacientes, sendo 13 pacientes portadores de rinite alérgica paucissintomáticos e 17 pacientes não-atópicos. Os grupos foram selecionados através da história, do exame clínico otorrinolaringológico e do teste alérgico cutâneo - Prick Test. O perfil das citocinas foi pesquisado nos fragmentos de mucosa nasal, através da RT-PCR semiquantitativa, escolhida por apresentar boa reprodutibilidade e especificidade, utilizando-se como referência o gene da Beta-actina. RESULTADOS: Os valores de IL-5, IL-8, IFN-gama mantiveram-se homogêneos em relação ao grupo controle. A IL-4 apresentou diferença com significância estatística. CONCLUSÃO: Os pacientes alérgicos paucissintomáticos apresentaram normalização da expressão das citocinas na mucosa nasal à exceção de IL-4.

Detecção de HPV na mucosa oral e genital pela técnica PCR em mulheres com diagnóstico histopatológico positivo para HPV genital

A infecção do papilomavírus humano (HPV) é uma das mais freqüentes doenças sexualmente transmissíveis em todo o mundo. A relação entre o HPV genital e oral permanece incerta, assim como o seu papel na carcinogênese oral. O objetivo deste estudo foi verificar a presença do DNA do HPV na mucosa oral e genital de mulheres com infecção genital por HPV, pela técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR). FORMA DE ESTUDO: Coorte transversal. MATERIAL E MÉTODO: Trata-se de um estudo piloto, prospectivo, com 30 mulheres, idade de 14 a 51 anos, portadoras de infecção genital por HPV confirmada pelo exame de histopatológico. Todas as pacientes foram submetidas a exame e coleta por raspagem da cavidade oral e genital para pesquisa do DNA do HPV pela técnica PCR. RESULTADOS: Nenhuma das amostras da cavidade oral foi positiva para HPV, enquanto no genital, o HPV foi detectado em 17 (57%) das 30 pacientes, principalmente o HPV 6b e 16. CONCLUSÃO: Os resultados mostraram maior porcentagem do HPV genital em relação à cavidade oral, e sugerem que o HPV genital não parece ser fator predisponente para a infecção oral no mesmo paciente.

Effects of physical exercise training in DNA damage and repair - could the difference be in hOGG1 Ser326Cys polymorphism?

Acute physical exercise is associated with increased oxygen consumption, which could result in an increased formation of reactive oxygen species (ROS). ROS can react with several organic structures, namely DNA, causing strand breaks and a variety of modified bases in DNA. Physical exercise training seems to decrease the incidence of oxidative stress-associated diseases, and is considered as a key component of a healthy lifestyle. This is a result of exercise-induced adaptation, which has been associated with the possible increase in antioxidant activity and in oxidative damage repair enzymes, leading to an improved physiological function and enhanced resistance to oxidative stress (Radak et al. 2008). Human 8-oxoguanine DNA glycosylase 1 (hOGG1) is involved in the base excision repair (BER) pathway and encodes an enzyme responsible for removing the most common product of oxidative damage in DNA, 8-hydroxyguanine (8-OH-G). The genetic polymorphism of hOGG1 at codon 326 results in a serine (Ser) to cysteine (Cys) amino acid substitution (Ser326Cys). It has been suggested that the carriers of at least one hOGG1Cys variant allele exhibit lower 8-OH-G excision activity than the wild-type (Wilson et al. 2011). The aim of this study was to investigate the possible influence of hOGG1 Ser326Cys polymorphism on DNA damage and repair activity in response to 16 weeks of combined physical exercise training, in thirty healthy Caucasian men. Comet assay was carried out using peripheral blood lymphocytes and enabled the evaluation of DNA damage, both strand breaks and FPG-sensitive sites, and DNA repair activity. Genotypes were determined by PCR-RFLP analysis. The subjects with Ser/Ser genotype were considered as wild-type group (n=20), Ser/Cys and Cys/Cys genotype were analyzed together as mutant group (n=10). Regarding differences between pre and post-training in the wild-type group, the results showed a significant decrease in DNA strand breaks (DNA SBs) (p=0.002) and also in FPG-sensitive sites (p=0.017). No significant differences were observed in weight (p=0.389) and in lipid peroxidation (MDA) (p=0.102). A significant increase in total antioxidant capacity (evaluated by ABTS) was observed (p=0.010). Regarding mutant group, the results showed a significant decrease in DNA SBs (p=0.008) and in weight (p=0.028). No significant differences were observed in FPG-sensitive sites (p=0.916), in ABTS (p=0.074) and in MDA (p=0.086). No significant changes in DNA repair activity were observed in both genotype groups. This preliminary study suggests the possibility of different responses in DNA damage to physical exercise training, considering the hOGG1 Ser326Cys polymorphism.

Accessing Planktothrix species diversity and associated toxins using quantitative real-time PCR in natural waters

Tese de Doutoramento em Biologia apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, 2015.

Development of a biosensor for urea assay based on amidase inhibition, using an ion-selective electrode

A biosensor for urea has been developed based on the observation that urea is a powerful active-site inhibitor of amidase, which catalyzes the hydrolysis of amides such as acetamide to produce ammonia and the corresponding organic acid. Cell-free extract from Pseudomonas aeruginosa was the source of amidase (acylamide hydrolase, EC 3.5.1.4) which was immobilized on a polyethersulfone membrane in the presence of glutaraldehyde; anion-selective electrode for ammonium ions was used for biosensor development. Analysis of variance was used for optimization of the biosensorresponse and showed that 30 mu L of cell-free extract containing 7.47 mg protein mL(-1), 2 mu L of glutaraldehyde (5%, v/v) and 10 mu L of gelatin (15%, w/v) exhibited the highest response. Optimization of other parameters showed that pH 7.2 and 30 min incubation time were optimum for incubation ofmembranes in urea. The biosensor exhibited a linear response in the range of 4.0-10.0 mu M urea, a detection limit of 2.0 mu M for urea, a response timeof 20 s, a sensitivity of 58.245 % per mu M urea and a storage stability of over 4 months. It was successfully used for quantification of urea in samples such as wine and milk; recovery experiments were carried out which revealed an average substrate recovery of 94.9%. The urea analogs hydroxyurea, methylurea and thiourea inhibited amidase activity by about 90%, 10% and 0%, respectively, compared with urea inhibition.