Die Expression und Regulation der CYP3A in menschlicher Haut

In Leber und Dünndarm bauen CYP3A-Enzyme eine Vielzahl von Fremdstoffen ab, die in den Körper gelangt sind. Zudem aber sind diese Enzyme auch in anderen Organen, wie der Haut exprimiert. Doch weder die genaue Zusammensetzung der CYP3A-Isozyme noch deren physiologische Rolle in der Haut sind bisher bekannt. Basierend auf begrenzten in vitro-Daten ist eine Rolle der CYP3A in der kutanen Vitamin D-Synthese denkbar. Auf der anderen Seite könnten die kutanen CYP3A auch lokal oder systemisch verabreichte Medikamente in der Haut verstoffwechseln und so zur Entstehung immunologischer und nicht-immunologischer unerwünschter Arzneimittelwirkungen beitragen, von denen sich bis zu 45 % in der Haut manifestieren.rnDie Arbeitshypothese dieses Projekts war, dass die CYP3A die kutane Synthese von Vitamin D regulieren. In dieser Funktion wurden sie zur Vermeidung von Vitamin D-Mangel-Erkrankungen wie Rachitis oder Osteomalazie in Europäern negativ selektiert. rnDie Expression und Regulation der CYP3A wurde in Hautbiopsien, einer Zelllinie epidermalen Ursprungs und primären Hautzellen wie auch in transgenen Mäusen untersucht. Die metabolische Aktivität der CYP3A gegenüber den kutanen Vitamin D-Vorstufen wurde mit Hilfe rekombinant exprimierter Enzyme untersucht. CYP3A5-mRNA war die häufigste der CYP3A in humanen Hautproben und überstieg die von CYP3A4 um das Dreifache, die von CYP3A7 um das 130-Fache. Damit entsprach diese 1,3 %, 0,01 % bzw. 0,01 % der jeweiligen hepatischen Genexpression. Die Expression von CYP3A43 war zu vernachlässigen. CYP3A5 zeigte eine bimodale Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. So zeigten Träger der Wildtyp-Allels *1 eine 3,3-fach höhere mRNA- und 1,8-fach höhere Proteinmenge als homozygote Träger des Nullallels *3. CYP3A4/7- und CYP3A5-Protein wurde v. a. in den Keratinozyten der Epidermis und den Talgdrüsen, also den Bereichen der kutanen Vitamin D-Synthese lokalisiert. Die CYP3A5-Expression wurde ferner in der Haut transgener Mäusen gezeigt, die das Reportergen Luziferase unter Kontrolle des humanen CYP3A5-Promoters exprimieren. Verglichen mit der Leber war die kutane Expression des Vitamin D-Rezeptors (VDR) 100-fach höher, die der Xenosensoren CAR und PXR vergleichbar bzw. zu vernachlässigen. Dementsprechend erhöhte die Behandlung mit 1,25-Dihydroxyvitamin D, dem aktiven Vitamin D-Hormon, und dessen Vorstufen außer 7-Dehydrocholesterol, jedoch nicht der PXR-Ligand Rifampicin, die Expression der CYP3A. Wie in Zwei-Hybrid-Experimenten gezeigt, wurden die Effekte des 1,25-Dihydroxyvitamin D und dessen Vorstufen alleinig durch VDR vermittelt. Die Effektstärke hingegen war abhängig von Zellspender, Zellpassage und Zelltypus. Alle drei CYP3A-Isozyme metabolisieren Vitamin D zu einem oder mehreren unbekannten Metaboliten, jedoch nicht zu 25-Hydroxyvitamin D, dem direkten Vorläufer des aktiven Vitamin D. rnZusammengefasst legen die Daten nahe, dass die kutanen CYP3A, allen voran CYP3A5, die Vitamin D-Homöostase durch VDR-vermittelte Induktion des Abbaus von Vitamin D-Vorstufen regulieren. Dies zusammen mit Sequenzdaten liefert starke Indizien für Vitamin D als treibende Kraft der Selektion des CYP3A-Lokus in Europäern. Der Einfluss der CYP3A-Expression auf selektiv wirksame, klinisch relevante Knochenveränderungen wie Rachitis oder Osteomalazie müssen folgen.rn

Rheumatoide Arthritis und Arteriosklerose : Bedeutung der zu Grunde liegenden chronisch entzündlichen Prozesse für die endotheliale Dysfunktion ; Wirkung der antiinflammatorischen Substanz Galiellalacton in murinen Arteriosklerosemodellen

Erhöhte arteriosklerotische und thrombotische Vorfälle sind ein Hauptgrund für die gesteigerten Zahlen kardiovaskulärer Todesfälle von Patienten mit chronisch entzündlichen Erkrankungen wie der rheumatoiden Arthritis (RA). Diese erhöhte Mortalität ist nicht auf die traditionellen Risikofaktoren, wie Alter, Geschlecht, Bluthochdruck oder Diabetes zurückzuführen. Man nimmt an, dass die systemische Entzündung einen nicht-traditionellen Risikofaktor für die erhöhten kardiovaskulären Todesfälle von RA-Patienten darstellt. Da die derzeitige Behandlung der RA zum Teil schwere Nebenwirkungen zur Folge haben kann, war es das Ziel dieser Doktorarbeit, die Zusammenhänge zwischen RA und Arteriosklerose (AS) näher zu untersuchen, sowie die neue antiinflammatorische Substanz Galiellalacton (Gal) für die Behandlung der AS zu charakterisieren.rnIn dem chronisch inflammatorischen Tiermodell der TTP-defizienten Mäuse, dessenrnPhänotyp dem einer humanen RA-Erkrankung ähnelt, konnte eine verschlechterternEndothelfunktion, die als ein erstes Symptom einer erworbenen AS gilt, nachgewiesen werden. Dies konnte auf eine erhöhte Stabilität der Nox2-mRNA zurückgeführt werden, die unabhängig von der erhöhten Expression des Entzündungsmarkers TNFα war. Diese gesteigerte Nox2-Menge führte wiederum zu einer erhöhten Bildung von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies und somit zu einer verringerten Menge an bioaktivem Stickstoffmonoxid, welches die endotheliale Dysfunktion (eDF) bedingte.rnAls ein traditioneller Risikofaktor für das Auftreten von kardiovaskulären Ereignissen gilt unter anderem eine Diabeteserkrankung. Durch die Ausbildung einer Nitrattoleranz bei der Therapie mit organischen Nitraten wie NTG, ISMN oder ISDN kommt es zu der Entwicklung einer eDF. PETN, ein weiteres organisches Nitrat zeigt diese Nebenwirkung nicht. PETN, vermittelt seinen antioxidativen Effekt über die Nrf2-abhängige Induktion der HO-1-Promotoraktivität.rnDie Behandlung von arteriosklerotischen Mäusen (ApoE-/-- und ApoE-/-TFPI+/--Mäuse) mit dem antiinflammatorischen Pilzsekundärmetaboliten Gal zeigte eine verringerte mRNA-Expression von arteriosklerotischen und inflammatorischen Mediatoren, sowie eine reduzierte Thrombenbildung durch eine verringerte Plättchenadhäsion.rnZusammenfassend konnte gezeigt werden, dass inflammationsabhängiger oxidativerrnStress ein Hauptgrund für die entzündungsgetriebene Artheriogenese ist und Galrneine neue Leitsubstanz für die Behandlung dieser Erkrankung ist.

Untersuchungen zur Esca-Erkrankung von Weinpflanzen : Pilz-Pflanze und antagonistische Interaktionen

Ziel dieser Arbeit war es, ein besseres Verständnis für die molekularen und biochemischen Grundlagen der Esca-Krankheit an Reben zu erarbeiten. Hierzu wurden sechs Teilprojekte durchgeführt. Die beiden Pilze Pm. chlamydospora und Pa. aleophilum wurden submers kultiviert um die gewonnenen Extrakte auf phytotoxische Substanzen zu untersuchten. Dabei wurden Metabolite isoliert, die zum ersten mal mit der Esca-Krankheit assoziiert werden konnten, wie Siderophoren und Kaempferol-3-O-Glukosid. Diese können das Verständnis der Pilz-Pflanze-Interaktion um neue Aspekte ergänzen. Die Glykosylierung von Kaempferol durch Pm wurde erstmals nachgewiesen und die hier dargelegten Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Pilz in der Lage ist, die von der Pflanze als Abwehrantwort produzierte Substanz, seinerseits zu nutzen. Dies bedeutet, dass Pm einen pflanzlichen Abwehrstoff durch Glykosylierung umwandelt und für die Wirtspflanze toxifiziert. Die durchgeführten Injektionstests in vivo in Weinpflanzen zeigten zudem, dass Esca-ähnliche Symptome durch K3G hervorgerufen werden können. Abseits dieser neuen Erkenntnisse konnten auch literaturbekannte Phytotoxine in den Extrakten identifiziert werden.rnIm zweiten Teilprojekt dieser Arbeit wurden Polyketidsynthase-Gene der beiden Pilze Pm und Pa inaktiviert. Zusätzlich wurde der veränderte Sekundärstoffwechsel bzw. die Reaktion der Insertionsmutanten auf abiotischen Stress und Infektionsfähigkeit von Vitis-Pflanzen untersucht. Damit ist es in dieser Arbeit erstmals gelungen selektiv Gene der Esca-assoziierten Pathogene zu inaktivieren. Es zeigte sich, dass die Mutanten sensitiver als die Wildtyp-Stämme bezüglich Salz-, Trocken- und oxidativen Stress reagieren. Die Infektionsfähigkeit bleibt jedoch unverändert.rnDie Analyse der Infektionsmechanismen sollte auch bei der Transformation der Pilze mit Fluoreszenzgenen im Fokus stehen. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es GFP-Mutanten der Pilze Pm, Pa und El zu generieren um das Wachstum nach Infektion von Weinpflanzen zu erfassen. Mit Hilfe der Fluoreszenzmutanten war es möglich ein neues Verfahren zur Suche nach potentiellen Antagonisten zu erstellen. Mit dem Vitis Shoot Assay konnten die Esca-assoziierten Pilze und Fungizide, endophytische Pilze, Trichoderma spp. und Bakterien-Stämme in einem Testverfahren auf Schnittwunden untersucht werden. Dabei konnten erste biologische Wundschutzmittel auf Basis ganzer Organismen identifiziert werden. Es zeigte sich, dass der durchgeführte Antagonistentest und das hier beschriebene innovative Vitis Shoot Assay nicht immer äquivalente Ergebnisse generierten und dass sich die beiden Verfahren ergänzen.rnDes Weiteren wurde eine Interaktionsstudie der vier Esca-assoziierten Pilze unter Stressbedingungen und verschiedenen Temperaturen durchgeführt um den Einfluss äußere biotischer und abiotischer Faktoren auf das Zusammenwirken dieser Erreger zu untersuchen. Die Pilze reagieren sehr unterschiedlich in den durchgeführten Stresstests und die Dominanz einzelner Erreger hängt stark von der Temperatur und den osmotischen Verhältnissen ab. Es konnte gezeigt werden, dass veränderte klimatische Bedingungen zur veränderten Zusammensetzung des Erregerspektrums führen kann.rnDie in dieser Arbeit generierten Ergebnisse geben neue Einblicke in die Esca Erkrankung von Weinreben und ermöglichen die weitere Forschung einiger weiterer Aspekte.