Diversidade genética e resistência natural ao Maraviroc em estirpes do vírus da imunodeficiência humana Tipo 1 (HIV-1) em circulação em utilizadores de drogas por via endovenosa na Grande Lisboa

RESUMO: O maraviroc (MVC) é o único anti-retroviral antagonista do co-receptor CCR5 licenciado e interage com as ansas transmembranares de CCR5, induzindo uma alteração da sua conformação e impedindo a interacção com gp120. O MVC é activo apenas contra estirpes R5 de HIV-1, sendo utilizado em terapia de recurso. Neste trabalho, foi estudada a diversidade genética da região C2V3C3 do gene env de estirpes de HIV-1 de oxicodependentes por via endovenosa da Grande Lisboa, pesquisando-se também a presença de polimorfismos genéticos naturais. Foram utilizadas 52 amostras de plasma e para 35 destas foi amplificado por RT-nested PCR um produto de 565 pb. A análise filogenética revelou a seguinte distribuição de genótipos: 23 B (incluindo, provavelmente, 2 CRF14_BG), 8 A, 3 G e 1 F1. Após tradução, e por comparação com a sequência consenso B, verificou-se uma elevada frequência de polimorfismos genéticos, sendo encontradas algumas “assinaturas de aminoácidos” relativas aos subtipos não-B. Realizou-se ainda uma pesquisa de locais de N-glicosilação e a previsão da utilização de co-receptores (abordagem genotípica), com recurso às regras 11/25 e da carga líquida da ansa V3 e aos programas PSSM e geno2pheno[coreceptor]. Observou-se uma conservação genérica do número de locais de N-glicosilação e foram identificadas 5 sequências com tropismo X4 ou duplo. Por fim, com base na literatura, realizou-se uma pesquisa de polimorfismos genéticos associados a resistência ao MVC presentes na ansa V3. Foi observado um número elevado destas mutações. A presença dos padrões 11S+26V e 20F+25D+26V, num total de 3 sequências, é relevante, visto estes estarem inequivocamente associados à resistência in vivo ao MVC. Apesar de não estar ainda definido um perfil de resistência para o MVC, a presença das mutações encontradas, em indivíduos sem contacto prévio com o fármaco, trará implicações relevantes na sua gestão clínica, considerando a introdução do MVC na terapia de recurso.---------- ABSTRACT: Maraviroc (MVC) is the only CCR5 inhibitor licensed today. This drug interacts with the transmembrane helices of CCR5 co-receptor, inducing a conformation change of its extracellular loops and preventing the interaction with gp120. MVC is only active against R5 strains of HIV-1 and is currently used in salvage therapy. The genetic diversity of the env C2V3C3 region of HIV-1 strains from injecting drug users in the Greater Lisbon was studied, along with the presence of natural genetic polymorphisms. 52 plasma samples were used and the amplification by RT-nested PCR of a 565 bp-product was possible in 35 of them. The phylogenetic analysis revealed 23 sequences classified as subtype B (probably including 2 CRF14_BG), 8 A, 3 G and 1 F1. After translation, the presence of natural genetic polymorphisms was studied by comparison to a subtype B consensus. A high frequency of genetic polymorphisms was observed and significant “amino acid signatures” were found in association with non-B subtypes. A full characterization of the N-glycosylation sites was also performed and a coreceptor prediction (genotypic approach) was accomplished using the 11/25 and the V3 net charge rules and the programs PSSM and geno2pheno[coreceptor]. The number of N-glycosylation sites was generically preserved. Five sequences were defined as X4 or dual-tropic. Based on published data, a search for genetic polymorphisms, present in V3loop, associated to MVC resistance was finally undertaken. Several of such mutations were observed, being particularly interesting the presence of the patterns 11S+26V and 20F+25D+26V, in a total of 3 sequences, since these patterns have unequivocally been associated with MVC resistance in vivo. Although a resistance profile for MVC is not yet defined, the presence of these mutations in MVC-naïve populations may have significant impact in their clinical management in the future, especially considering the introduction of this drug in salvage therapy.

Diversidade genética e resistência aos anti-retrovirais inibidores enzimáticos de vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) de uma população de toxicodependentes por via endovenosa da Grande Lisboa

Neste estudo procedeu-se à caracterização da diversidade genética das regiões codificantes da protease (PR), transcritase reversa (RT) e integrase (IN) do gene pol do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1), bem como à pesquisa de polimorfismos genéticos associados à diminuição da susceptibilidade aos anti-retrovirais inibidores enzimáticos, circulante numa população de 51 indivíduos utilizadores de drogas por via endovenosa (IDUs) da Grande Lisboa. Em termos globais, a análise filogenética realizada com base em 38 sequências nucleotídicas concatenadas revelou que 12 (31,6%), 13 (34,2%) e 13 (34,2%) das sequências analisadas eram dos subtipos B, G/CRF14_BG e de formas genéticas não-B/não-G (1 F1, 4 CRF02_AG e 8 formas recombinantes únicas), respectivamente. Relativamente à pesquisa de mutações associadas a resistência (perfil genotípico), foram encontradas 15, presentes em 50,0% (22/44) dos indivíduos, com uma distribuição de 1-3/indivíduo (4, todas acessórias, na PR; 6 na RT; 5 na IN, uma principal e 4 acessórias). Todavia, apenas 26,7% (4/15) dessas mutações conferiam uma expressão fenotípica de resistência a uma das classes de inibidores (da RT ou IN), em 9,1% (4/44) dos indivíduos. Foi ainda observada uma elevada frequência de outros polimorfismos genéticos, mais frequentes em subtipos não-B, alguns dos quais considerados assinaturas de subtipo. A homologia genética total ou parcial com os subtipos B e G, reconhecida neste estudo, reflectirá a sua predominância na população de IDUs. Este resultado sugere também que a epidemia de HIV-1 em Portugal poderá estar a evoluir para um padrão epidemiológico singular, no qual os subtipos B, G e suas formas recombinantes predominam. A proporção observada de indivíduos portadores de vírus com mutações associadas a resistência, mesmo em indivíduos naive relativamente à terapêutica, indica que a sua transmissão se encontra em curso entre a população de IDUs, tendo, certamente, um impacto relevante ao nível da abordagem terapêutica e monitorização da infecção.

Caracterização genética da Glucano Sintetase de Pneumocystis jirovecii

Pneumocystis jirovecii é um micro-organismo fúngico que pode causar pneumonia em doentes imunocomprometidos. O ciclo de vida de Pneumocystis inclui uma forma biológica trófica e outra quística na qual estão presentes, em sua composição, hidratos de carbono chamados β-Glucanos. Estes componentes são liberados na corrente sanguínea após lise do micro-organismo pela resposta imunitária ou fármacos, sendo assim, considerado um marcador sorológico que atua como auxiliar no diagnóstico da PPc. Porém, este marcador não é específico para o gênero Pneumocystis, podendo ser um teste positivo em outras infecções fúngicas como a candidíase. Caracterizar a sequência genética da Glucano Sintetase permite uma nova abordagem em relação aos testes sorológicos e a possíveis novos alvos terapêuticos. Um teste sorológico para o β-Glucano específico para P. jirovecii podendo ser um marcador muito mais útil e confiável do que os utilizados atualmente. Neste trabalho foi feita a caracterização genética do fragmento correspondente à Glucano Sintetase de P. jirovecii com base na sequência de β-Glucano de P. carinii e na sequência completa de P. jirovecii através de metodologias de PCRs. Com o resultado do sequenciamento do fragmento de β-Glucano de P. jirovecii puderam ser observadas possíveis bases candidatas a polimorfismos de base única (SNP). Determinar os polimorfismos em uma sequência resulta em conhecimento da diversidade genética do micro-organismo para além de reconhecer marcadores moleculares que podem determinar sua origem geográfica, resistência a fármacos e fatores de virulência. Duas bases foram identificadas na sequência como possíveis SNPs. Estudos em projetos futuros com técnicas como o RFLP podem caracterizar e determinar as consequências e importância destes polimorfismos no fragmento da Glucano Sintetase de P. jirovecii. Estabelecer esta importância pode levar à compreensão do modelo de infecção e defesa deste micro-organismo para que possamos perceber melhor sua atuação

Lymnaea truncatula em Portugal: contribuição para o estudo da bioecologia e da variação genética

Lymnaea truncatula é um gastrópode de água doce com importância em medicina por ser hospedeiro intermediário do tremátode parasita Fasciola hepatica. É o único hospedeiro intermediário desta espécie encontrado até agora em Portugal. A fasciolose é responsável por perdas de produtividade em gado. Nos humanos, é uma parasitose emergente com relevo em saúde pública em várias regiões do globo. Portugal é o segundo país europeu com maior prevalência. L. truncatula é de difícil controlo por ser anfíbia e ter boa capacidade de sobrevivência e adaptação. A eficácia dos programas de controlo e monitorização depende da correcta identificação das espécies de hospedeiros intermediários, dado que nem todas as espécies apresentam a mesma sensibilidade à infecção por F. hepatica. A morfologia da concha e a anatomia dos órgãos são insuficientes na identificação das espécies, sendo necessário usar técnicas de biologia molecular. Os objectivos deste estudo foram: estudar a distribuição, a variação da densidade populacional ao longo do ano, a diversidade genética, os habitats e a influência de parâmetros físicos, químicos e biológicos, na densidade populacional de L. truncatula em cinco distritos portugueses (Coimbra, Évora, Leiria, Lisboa e Funchal). Realizaram-se inquéritos malacológicos bimestrais durante 2 anos, entre Janeiro de 2006 e Dezembro de 2007 em Portugal continental e dois (Julho e Novembro de 2009) na ilha da Madeira. No continente, encontrou-se L. truncatula em: ribeiros temporários, com pouca vegetação, substrato de argila e matéria em decomposição e com água límpida, incolor e inodora, e com concentração de cálcio e de sulfatos até 50 mg/l e 267mg/l, respectivamente. A presença de outras espécies de moluscos, como Planorbarius metidjensis, Lymnaea peregra e da subclasse Prosobronchiata, assim como concentrações elevadas de nitratos, estão associados a uma menor densidade populacional. Na ilha da Madeira, os habitats foram predominantemente: escorrimentos de encosta, permanentes, com fraca exposição solar, pouca vegetação, substrato de rocha, argila e matéria em decomposição e com água límpida, incolor e inodora, acima dos 14,4ºC. A densidade populacional diminui com o aumento dos valores de nitratos e aumenta com a concentração de cálcio na água. As fezes de animais presentes junto às colecções de água não apresentaram ovos de F. hepatica. Foi encontrado um exemplar de F. hepatica no fígado de um gamo da Tapada Nacional de Mafra (distrito de Lisboa)Estudou-se a diversidade genética de L. truncatula através de RAPD-PCR e sequenciação do gene ribossomal 18S e da região ITS-2 (este também por PCR-RFLP). Identificou-se pela primeira vez em Portugal continental e na ilha da Madeira uma espécie, geneticamente diferente mas morfologicamente muito semelhante a L. truncatula – Lymnaea schirazensis. Na ilha da Madeira, foi detectado um haplotipo distinto do presente no continente. O marcador de RAPD - OPA2 e PCR-RFLP com HpaII, são bons marcadores para distinção entre L. truncatula e L. schirazensis. Adicionalmente, detectou-se pela primeira vez na ilha da Madeira L. (Pseudosuccinea) columella, conhecido hospedeiro intermediário de F. hepatica. Este estudo permitiu melhorar o conhecimento sobre hospedeiros intermediários de F. hepatica em Portugal, o que poderá melhorar o controlo e monitorização da fasciolose.

Avaliação da diversidade genética de fungos micorrízicos arbusculares em três estádios de estabilização de dunas

A diversidade genética de fungos micorrízicos arbusculares, recuperados de três estádios de estabilização de dunas, foi avaliada por técnicas moleculares e comparada com resultados obtidos anteriormente por técnicas baseadas na caracterização morfológica dos esporos. O uso da técnica de PCR-RFLP do rDNA, extraído de esporos, permitiu definir impressões características de espécies presentes nas dunas, evidenciar a presença de diferentes comunidades em cada estádio e identificar a anteduna como aquela com comunidades com maior polimorfismo. Esse estádio também apresentou maior diversidade, quando, no estudo das comunidades, foram utilizadas técnicas baseadas em aspectos morfológicos. A combinação de ambas as estratégias, molecular e baseada em aspectos morfológicos, forneceu importantes informações sobre a diversidade destes fungos, visando ao estudo do seu papel no ecossistema.

Diversidade genética e eficiência simbiótica de rizóbios noduladores de acácia-negra de solos do Rio Grande do Sul

A acácia-negra é a terceira espécie florestal mais cultivada no Brasil. Além de sua importância econômica, é utilizada na recuperação de áreas degradadas, nas quais o solo geralmente apresenta pH baixo e altos teores de Al. O presente trabalho objetivou avaliar a diversidade genética de rizóbios naturais de solos do Rio Grande do Sul e selecionar isolados eficientes na fixação de N2 em condições de pH baixo. Um total de 50 isolados de Bradyrhizobium sp. foi obtido, os quais, juntamente com as estirpes recomendadas BR 3067 e BR 3068, foram caracterizados com o marcador BOX A 1-R. O padrão de bandas dos isolados foi utilizado na construção de um dendrograma, a partir do qual se calculou o índice de diversidade de Shannon. Dez isolados foram testados quanto à tolerância a pH baixo e à presença de Al, selecionando-se oito para o teste de eficiência simbiótica em casa de vegetação. Observou-se diversidade genética elevada entre os isolados, com a formação de 10 grupos, a partir do ponto de corte de 70 % de similaridade e com o índice de diversidade de 4,30. A presença de Al não afetou os isolados avaliados, que tiveram seu crescimento reduzido em pH 4,5. Quanto à eficiência simbiótica, os isolados T6-16 e V-7 foram os mais eficientes, assemelhando-se à estirpe recomendada BR 3068.

Diversidade genética, tolerância aos fatores de acidez e eficiência simbiótica de rizóbios para cornichão de solos do Rio Grande do Sul

O cornichão é uma leguminosa forrageira perene hiberno-primaveril de grande importância para o Rio Grande do Sul, destacando-se pela capacidade de se manter em solos relativamente ácidos e pouco férteis. Com este trabalho, objetivou-se a seleção de rizóbios para cornichão tolerantes à acidez e ao Al tóxico e eficientes na fixação biológica de N em solos de baixa fertilidade. Foram avaliados 52 isolados de rizóbios de Lotus spp. obtidos de solos de cinco localidades do Rio Grande do Sul. Os rizóbios foram avaliados quanto à diversidade genética, à tolerância a pH 4,2 e ao Al tóxico. Entre os rizóbios tolerantes a fatores de acidez, sete foram avaliados quanto à eficiência simbiótica com plantas, em casa de vegetação, em vasos com solo não estéril. Observou-se alta diversidade genética entre os rizóbios estudados, dos quais 16 foram tolerantes a pH 4,2 e a 50 µM de Al em meio de cultura, produzindo populações da ordem de 10(7) até 10(8) UFC mL-1. Os sete rizóbios testados em casa de vegetação superaram as estirpes atualmente recomendadas para a produção de inoculantes, o que demonstra a existência, em solos do Rio Grande do Sul, de rizóbios tolerantes à acidez do solo e eficientes como fixadores de N em plantas de cornichão.

Caracterização e diversidade genética do capim-elefante e seus híbridos com milheto mediante padrões isoenzimáticos

Foram avaliadas isoenzimaticamente sete cultivares de capim-elefante (Pennisetum purpureum) e seus híbridos com milheto (P. americanum), selecionados pela Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA), visando à identificação de acessos. Foram estudados, em gel de poliacrilamida, os sistemas peroxidase (POX), esterase (EST), glutamato oxalacetato transaminase (GOT), leucina aminopeptidase (LAP), álcool-desidrogenase (ADH) e fosfatase ácida (ACP), em folhas jovens, aos 28 dias após o corte de uniformização. Não foi observada atividade isoenzimática da ADH e observou-se baixa resolução do sistema LAP, os quais não são indicados para caracterização dos germoplasmas. Os padrões de ACP, GOT, POX e EST permitiram conhecer os fenótipos dos 14 acessos estudados. Foram revelados 9, 3, 13 e 19 diferentes padrões de bandas, respectivamente, sendo possível a identificação da coleção de forma rápida e segura utilizando apenas os padrões de esterase.

Coeficiente de determinação genotípica e de diversidade genética em topocruzamentos de soja tipo alimento com tipo grão

As estimativas do coeficiente de herdabilidade são importantes para a escolha de uma estratégia eficaz de seleção. Quando os tratamentos são considerados fixos, a herdabilidade é denominada coeficiente de determinação genotípica. Os objetivos do presente trabalho foram estimar, através de topocruzamentos obtidos entre soja tipo alimento e soja tipo grão, o coeficiente de determinação genotípica e avaliar a diversidade genética de modo a se distinguir diferenças de contribuição dos parentais de soja tipo alimento com sementes grandes e com sementes pequenas usados nos topocruzamentos, assim como avaliar a interação de cada grupo com o ambiente. Os resultados de determinação genotípica obtidos nas médias de topocruzamentos foram: 90,51% com relação ao número de dias para maturidade (NDM); 93,92% com relação à altura da planta na maturidade (APM); 79,52% com relação ao acamamento (AC); 91,37% ao valor agronômico (VA); 95,55% ao peso de cem sementes (PCS); 57,57% à produtividade de grãos (PG), e 91,18% à largura visual das vagens (LVV), enquadrando-se aos valores encontrados na literatura. Em relação às estimativas de diversidade genética, que representam a disponibilidade de diferenças genéticas para seleção, os caracteres NDM, APM e AC apresentaram valores maiores nos topocruzamentos envolvendo parentais exóticos de sementes pequenas e para VA, PCS, PG e LVV nos topocruzamentos envolvendo parentais exóticos de sementes grandes.

Caracterização da diversidade genética em feijão por meio de marcadores RAPD

Marcadores RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) foram usados para avaliar a diversidade genética entre 19 cultivares de feijão (Phaseolus vulgaris L.). Dos cento e oito locos de RAPD obtidos de 15 primers decâmeros, 70 foram polimórficos. Para estimar a distância genética foi usado o coeficiente de similaridade de Jaccard e as análises de agrupamento foram feitas pelos métodos UPGMA e Tocher. As análises de agrupamento confirmaram a ampla diversidade genética existente entre germoplasmas tropicais de feijão, separando as cultivares em dois grupos principais, correspondendo aos centros de domesticação Andino (genótipos de sementes médias e grandes) e Mesoamericano (genótipos de sementes pequenas). No grupo Andino, a diversidade genética relativa foi maior do que no Mesoamericano.

Diversidade genética entre híbridos de tangerina 'Cravo' e laranja 'Pêra'

Marcadores moleculares RAPD foram utilizados para avaliar a diversidade genética em uma população de 94 híbridos de tangerina 'Cravo' (Citrus reticulata Blanco) com laranja 'Pêra' (C. sinensis (L.) Osbeck), obtidos por polinização controlada. Nas reações de amplificação foram usados 102 "primers" decâmeros de seqüência arbitrária, que amplificaram 640 fragmentos, sendo 77,2% monomórficos entre os parentais. Utilizou-se o coeficiente de Jaccard para estimar a similaridade genética entre os híbridos, o método UPGMA para gerar o fenograma (NTSYS 1,7) e o software BOOD para determinar a consistência de cada agrupamento. Verificou-se que a laranja 'Pêra' apresenta maior heterozigosidade que a tangerina 'Cravo', sendo, respectivamente, 180 e 126 os números observados de loci em heterozigose. Houve alta similaridade genética entre os parentais, caracterizada pelo baixo polimorfismo de marcadores RAPD. Não houve a formação de agrupamentos estatisticamente significativos dos híbridos entre si e com os parentais, demonstrando que a constituição genética dos híbridos foi originada pela segregação independente das marcas RAPD, sendo quebrado o efeito de ligação em função do tamanho amostral em estudo. Híbridos com maior similaridade genética em relação à tangerina 'Cravo' e laranja 'Pêra' podem ser facilmente selecionados a partir de marcadores RAPD.

Diversidade genética em cultivares locais e comerciais de feijão baseada em marcadores RAPD

O objetivo deste trabalho foi caracterizar a diversidade genética dentro e entre cultivares locais e comerciais de feijão, por meio de marcadores RAPD, e avaliar a capacidade destes em agrupar genótipos de feijão de acordo com o centro de domesticação e coloração de semente. Foram avaliadas 35 cultivares, 13 comerciais e 22 locais, de diversas regiões do Rio Grande do Sul. As distâncias genéticas foram obtidas pelo complemento do coeficiente de similaridade de Sorensen-Dice e a representação simplificada destas distâncias realizada mediante um dendrograma. Marcadores RAPD foram eficientes ao agrupar cultivares de acordo com o centro de domesticação, mas não foram capazes de separar as cultivares de acordo com a coloração da semente. Cultivares locais e comerciais, mesoamericanas, foram agrupadas separadamente. Cultivares comerciais, em cultivo no Rio Grande do Sul apresentam alto grau de similaridade.

Diversidade genética da soja entre períodos e entre programas de melhoramento no Brasil

O objetivo deste trabalho foi detectar os efeitos do melhoramento sobre a diversidade do germoplasma da soja cultivada nas três ultimas décadas, por meio da comparação de seis programas de melhoramento e períodos de lançamento de cultivares, utilizando locos microssatélites. Em relação aos programas de melhoramento, todos os locos apresentaram diferenças significativas em suas distribuições alélicas. Alguns locos eram compostos de alelos exclusivos em alguns programas de melhoramento, enquanto outros foram compostos sempre dos mesmos alelos em maior freqüência para todos os programas. A AMOVA indicou maior porção da variância devido a cultivares dentro de programas e somente 5,3% (p<0,05) devido à diferença entre programas. Quando comparados os programas de melhoramento entre si, cinco entre as 15 comparações apresentaram diferenças significativas (p<0,05), estando presente o programa IAC em quatro destas cinco comparações. As estimativas de variabilidade da soja entre os períodos de melhoramento avaliados indicaram que somente 1,78% da variância total foi devida à diferença entre períodos (p>0,05). Os resultados sugerem que o germoplasma de soja utilizado em programas de melhoramento no Brasil manteve nível constante de diversidade genética nos últimos 30 anos, além de relativa heterogeneidade de determinados programas.