The implementation of liquid chromatography tandem mass spectrometry for the official control of lipophilic toxins in seafood: Single-laboratory validation under four chromatographic conditions

We performed a comprehensive study to assess the fit for purpose of four chromatographic conditions for the determination of six groups of marine lipophilic toxins (okadaic acid and dinophysistoxins, pectenotoxins, azaspiracids, yessotoxins, gymnodimine and spirolides) by LC-MS/MS to select the most suitable conditions as stated by the European Union Reference Laboratory for Marine Biotoxins (EURLMB). For every case, the elution gradient has been optimized to achieve a total run-time cycle of 12 min. We performed a single-laboratory validation for the analysis of three relevant matrices for the seafood aquaculture industry (mussels, pacific oysters and clams), and for sea urchins for which no data about lipophilic toxins have been reported before. Moreover, we have compared the method performance under alkaline conditions using two quantification strategies: the external standard calibration (EXS) and the matrix-matched standard calibration (MMS). Alkaline conditions were the only scenario that allowed detection windows with polarity switching in a 3200 QTrap mass spectrometer, thus the analysis of all toxins can be accomplished in a single run, increasing sample throughput. The limits of quantification under alkaline conditions met the validation requirements established by the EURLMB for all toxins and matrices, while the remaining conditions failed in some cases. The accuracy of the method and the matrix effects where generally dependent on the mobile phases and the seafood species. The MMS had a moderate positive impact on method accuracy for crude extracts, but it showed poor trueness for seafood species other than mussels when analyzing hydrolyzed extracts. Alkaline conditions with EXS and recovery correction for OA were selected as the most proper conditions in the context of our laboratory. This comparative study can help other laboratories to choose the best conditions for the implementation of LC-MS/MS according to their own necessities.

Protein phosphatase inhibition assays for okadaic acid detection in shellfish: matrix effects, applicability and comparison with LC-MS/MS analysis

The applicability of the protein phosphatase inhibition assay (PPIA) to the determination of okadaic acid (OA) and its acyl derivatives in shellfish samples has been investigated, using a recombinant PP2A and a commercial one. Mediterranean mussel, wedge clam, Pacific oyster and flat oyster have been chosen as model species. Shellfish matrix loading limits for the PPIA have been established, according to the shellfish species and the enzyme source. A synergistic inhibitory effect has been observed in the presence of OA and shellfish matrix, which has been overcome by the application of a correction factor (0.48). Finally, Mediterranean mussel samples obtained from Rı´a de Arousa during a DSP closure associated to Dinophysis acuminata, determined as positive by the mouse bioassay, have been analysed with the PPIAs. The OA equivalent contents provided by the PPIAs correlate satisfactorily with those obtained by liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS).

Compatibilidades e incompatibilidades entre radiação gama e óxido de etileno como métodos sucessivos de esterilização

A dúvida sobre a questão da re-esterilização de artigos confeccionados com cloreto de polivinila (PVC), esterilizados em radiação gama (RG) e posteriormente em óxido de etileno (EO) persiste até os dias atuais. Por meio da revisão integrativa da literatura, este artigo analisou estudos que evidenciaram compatibilidades e incompatibilidades entre os processos de esterilização com RG e EO quando utilizados como métodos sucessivos de esterilização. Foram analisados 7 estudos. Constatou-se que há influência multifatorial na segurança do procedimento e que o método analítico da cromatografia empregado na maioria dos estudos produziu resultados controversos. Esse fato indica a necessidade da realização de novos estudos sobre o assunto, utilizando-se métodos analíticos mais sensíveis do que a cromatografia gasosa, como o teste de reatividade biológica em culturas celulares, que poderá dirimir em nosso meio a crônica dúvida da compatibilidade ou incompatibilidade de se esterilizar em EO materiais previamente gamairradiados.

Adaptação cultural e propriedades psicométricas iniciais do instrumento DISABKIDS ® – Cystic Fibrosis Module – versão brasileira

Este estudo objetivou adaptar culturalmente e descrever as propriedades psicométricas iniciais do instrumento de mensuração de qualidade de vida relacionada à saúde DISABKIDS® − Cystic Fibrosis Module para crianças e adolescentes e seus pais/cuidadores. Estudo metodológico de desenvolvimento sequencial, incluindo 126 participantes em quatro estados brasileiros. Envolveu tradução e retrotradução dos itens, equivalência conceitual e semântica, validade de face e descrição das propriedades psicométricas iniciais relacionadas ao construto e fidedignidade . Para equivalência semântica da versão adaptada houve ajustes na redação de um item. O instrumento apresentou consistência interna satisfatória com valores de alfa de Cronbach entre 0,70 e 0,85, validade convergente com valores de correlação acima 0,40 em 85% dos itens e validade divergente com valores de ajuste superiores a 75%. A versão brasileira do DISABKIDS® - CFM certamente se constituirá em um instrumento válido e confiável para a mensuração da qualidade de vida de crianças e adolescentes brasileiros com fibrose cística.

Implementação e validação de um método cromatográfico para a Detecção e Quantificação de Furano em Feijão Enlatado

O furano tem sido detectado em diversos alimentos em particular nos que são sujeitos a tratamento térmico durante o processo de preparação industrial. É considerado um composto potencialmente cancerígeno para seres humanos, pelo que a sua presença nos alimentos se tornou uma questão de segurança alimentar. Desde 2007 que a Autoridade Europeia para a Segurança Alimentar tem procurado recolher o maior número de informação possível, relativa à presença de furano nos alimentos. Neste trabalho utilizou-se a técnica de Cromatografia Gasosa de Espaço de Cabeça acoplada a um espectrómetro de massa (HS-GC/MS) para avaliar os teores de furano em feijões enlatados. Foram analisadas 10 amostras (latas) independentes, seleccionadas aleatoriamente no mercado, de três marcas comercializadas em Portugal. A concentração média obtida foi de 3,27 ng/g, numa gama que variou entre 2,61 e 4,45 ng/g. Os limites de detecção calculados foram de 0,80 ng/g para as amostras PD, 1,26 ng/g para as amostras C e de 0,58 ng/g para as amostras F. Os limites de quantificação foram, respectivamente, de 2,44, 3,82 e 1,77 ng/g. Os coeficientes de variação do método foram inferiores a 10% e a percentagem de recuperação foi de 95%. Para estudar o efeito do tratamento térmico doméstico, foram também, analisadas amostras aquecidas à temperatura de 80°C, tendo-se verificado um aumento significativo na concentração do furano detectada. Comparou-se ainda a concentração média do furano obtido nos feijões em lata com a concentração média para o mesmo tipo de feijão conservado em frascos de vidro, tendose constatado não existirem diferenças significativas.

Lidar com a doença mental : a pluralidade de sistemas de cuidados e de itinerários terapêuticos : análise comparativa de dois estudos efectuados junto de duas populações residentes em Portugal

Several studies point to the plurality of care systems to deal with illness. They can be organized into professional, popular and alternative systems (the latter includes the complementary and the traditional ones). What the particular setup is in each cultural system is the core question of both the empirical studies we report. The purpose of this article is to understand how lay people deal with mental illness, examining the therapeutic itineraries that are constructed between plural care systems, featuring in particular the use of traditional medicine. The analysis of the two studies (one carried out in the north region and the other in Lisbon) allowed us to interpret these practices and discuss the social and cultural factors that determine and explain the settings that were found. Both researches fit into a qualitative methodology. In-depth, semi-structured interviews were performed and were analyzed using discourse analysis to describe and interpret data. The results point to a plurality of therapeutic itineraries, built around public and private speeches, where the explanatory systems underlying the use of official medicine and/or traditional practices found plural meanings. People may use these systems in several forms, using one or combining more than one, simultaneously or sequentially, depending on the context and on the needs they feel to face both illness and mental suffering. It is in between the space of the impotence and ‘incompetence’ of the ‘wise’ medicine that other therapeutic systems develop. It is important to understand those systems because of their achievements and their heuristic power to explain society and culture.

Gestão Integrada dos Recursos Hídricos da Ilha do Maio (Cabo Verde): o Contributo das Águas Subterrâneas

Cabo Verde é constituído por 10 ilhas, sendo a ilha do Maio a mais antiga do arquipélago, com uma área de 269 km2, tendo como comprimento máximo 24100 m, uma largura máxima de 16300 m e uma população total de 6740 habitantes. No que concerne à geomorfologia e geologia, a ilha é considerada plana e é composta por formações eruptivas e sedimentares, sendo as formações sedimentares dominantes na ilha. Apresenta as formações mais antigas de Cabo Verde, de idade jurássica e cretácica. No entanto, não apresenta as formações eruptivas mais recentes como as restantes ilhas. A ilha do Maio enquadra-se num clima do tipo árido e semiárido, com uma temperatura média de 24.5 ºC e uma precipitação anual de 125.4 mm. Estimativas efectuadas com base no modelo do balanço hídrico sequencial diário mostram que cerca de 7% da precipitação corresponde a escoamento superficial e 14.1% a escoamento subterrâneo. Pela aplicação deste modelo e do método do balanço químico do ião cloreto, os recursos hídricos subterrâneos renováveis anualmente na ilha do Maio estão, em ano médio, compreendidos entre 3.44 x 106 m3 e 4.76 x 106 m3.por sua vez, o escoamento total é estimado em 7.8 x 106 m3 anuais, o que equivale a cerca de 21 400 m3/dia. O escoamento subterrâneo na ilha do Maio faz-se globalmente de um modo centrífugo a partir das elevações do maciço central. O gradiente hidráulico assume valores entre 0.05% e 2.9%, sendo que o valor mais baixo ocorre no sector norte da ilha, o que favorece o fenómeno de intrusão salina. Relativamente à qualidade da água, verifica-se que as amostras recolhidas correspondem a águas muito mineralizadas, com valores de condutividade eléctrica compreendidos entre 832 μS/cm e 7730 μS/cm. Por sua vez, os valores de TDS estão compreendidos entre 705.8 mg/L e 4210.4 mg/L. Nestas condições, as águas subterrâneas analisadas podem ser consideradas águas salobras. A fácies hidroquímica dominante é a cloretada sódica, sendo que grande parte das amostras pode ser considerada cloretada-bicarbonatada sódica. Admitindo que a amostragem efectuada tem significado estatístico, poderá dizer-se que, a nível físico-químico, cerca de 20% das águas subterrâneas são próprias para o consumo humano. No que respeita à utilização da água para rega, as águas analisadas apresentam baixo a alto perigo de alcalinização do solo e alto a muito alto perigo de salinização. Em síntese, pode concluir-se que, não obstante o carácter árido da ilha do Maio, a mesma apresenta um potencial de recursos hídricos não negligenciável, eventualmente suficiente para suprir as necessidades hídricas da população. No entanto, o estudo desenvolvido mostra a necessidade de implementar medidas susceptíveis de proporcionarem um aproveitamento sustentado dos recursos hídricos, no quadro da gestão integrada dos recursos hídricos da ilha do Maio.

Efeito do óleo essencial de Tagetes patula L. (Asteraceae) sobre Sitophilus zeamais Motschulsky (Coleoptera, Curculionidae)

Resistência de pragas a inseticidas, danos ao ambiente em função da poluição do solo e de recursos hídricos vem sendo observados pelo uso de inseticidas químicos no controle de pragas em grãos armazenados. Com o intuito de minimizar estes problemas, estão sendo estudadas alternativas como o uso de inseticidas botânicos. Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar o efeito do óleo essencial de Tagetes patula L. sobre, Sitophilus zeamais Motschulsky, 1855 em milho sob condições de laboratório. O óleo essencial de T. patula foi obtido através de arraste a vapor com aparelho clevenger. A caracterização química dos compostos encontrados no óleo essencial de T. patula foi realizada através de cromatografia gasosa acoplado a espectrometria de massas, sendo observados: limoneno (37,05%), terpinoleno (32,61%), piperitone (14,40%), eofitadieno (5,91%), sabineno (2,88%), trans-ocimeno (2,02%), beta-cariofileno (1,98%), farnesol (1,84%) e alfa-pineno (1,30%). Os insetos utilizados nos bioensaios foram mantidos em temperatura e umidade relativa controlada. Foram avaliados os efeitos do óleo essencial de T. patula sobre o comportamento (atratividade e/ou repelência) e atividade inseticida sobre adultos de S. zeamais através de dois bioensaios. Pelos resultados pode-se observar o efeito repelente e inseticida do óleo essencial de T. patula sobre S. zeamais, na concentração de 10 µL (p<0,0001 e p=0,02) sendo portanto, eficaz no controle de adultos de S. zeamais.

Valorização da Drêche Cervejeira: Fermentação de Pentoses

O presente trabalho tem como objetivo a otimização da etapa de fermentação dos açúcares obtidos a partir da drêche cervejeira para produção do bioetanol através da utilização das leveduras Pichia stipitis NCYC 1541 e Kluyveromyces marxianus NCYC 2791 como agentes fermentativos. O meio de cultura usado para manter as culturas destas leveduras foi Yeast Extract Peptone Dextrose (YEPD). O principal propósito deste trabalho foi o de encontrar alternativas aos combustíveis fósseis, pautando-se por soluções inofensivas para o meio ambiente e sustentáveis. Assim, o trabalho está dividido em quatro etapas: 1) caraterização química e biológica da drêche; 2) pré-tratamento ácido e hidrólise enzimática para primeiramente quebrar as moléculas de lenhina que envolvem os polímeros de celulose e hemicelulose e em seguida romper as ligações poliméricas destas macromoléculas por ação enzimática e transforma-las em açúcares simples, respetivamente, obtendo-se então a glucose, a maltose, a xilose e a arabinose; e, por último, 3) otimização da etapa de fermentação da glucose, maltose e das pentoses que constitui a condição essencial para se chegar à síntese do bioetanol de um modo eficiente e sustentável e 4) a recuperação do bioetanol produzido por destilação fracionada. A quantificação dos açúcares libertados no processo foi feita recorrendo a análises por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Neste estudo foram identificados e quantificados cinco açúcares: Arabinose, Glucose, Maltose, Ribose e Xilose. Na etapa de pré-tratamento e hidrólise enzimática foram usados os ácidos clorídrico (HCl) e nítrico (HNO3) com a concentração de 1% (m/m), e as enzimas Glucanex 100g e Ultraflo L. Foram testadas seis condições de pré-tratamento e hidrólise enzimática, alterando os parâmetros tempo de contacto e razão enzimas/massa de drêche, respetivamente, e mantendo a temperatura (50 ºC), velocidade de agitação (75 rpm) e concentração dos ácidos (1% (m/m)). No processamento de 25 g de drêche seca com 0,5 g de Glucanex, 0,5 mL de Ultraflo e um tempo de reação de 60 minutos para as enzimas foi obtida uma eficiência de 15%, em hidrolisado com 6% da celulose. Realizou-se a fermentação do hidrolisado resultante do pré-tratamento ácido e hidrólise enzimática de drêche cervejeira e de meios sintéticos preparados com os açúcares puros, usando as duas estirpes selecionadas para este estudo: Pichia stipitis NCYC 1541 e Kluyveromyces marxianus NYCY 2791. As eficiências de fermentação dos açúcares nos meios sintéticos foram superiores a 80% para ambas as leveduras. No entanto, as eficiências de fermentação do hidrolisado da drêche foram de 45,10% Valorização da Drêche Cervejeira: Fermentação de Pentoses pela Pichia stipitis e de 36,58 para Kluyveromyces marxianus, para um tempo de fermentação de 72 horas e à temperatura de 30 °C. O rendimento teórico em álcool no hidrolisado da drêche é de 0,27 g/g, três vezes maior do que o real (0,0856 g/g), para Pichia stipitis e de 0,19 g/g seis vezes maior do que o real (0,0308 g/g), para a Kluyveromyces marxianus.

DETECÇÃO DE SUBPRODUTOS DA DESINFECÇÃO COM CLORO EM ÁGUA DESSALINIZADA

A dessalinização da água do mar é um método usado para obter água potável. Na dessalinização da água também é necessária a desinfecção de água com o cloro. Esta desinfecção garante à água condições seguras em termos microbiológicos mas promove a formação de novas substâncias consideradas tóxicas, resultantes da reacção do cloro com a matéria orgânica presente na água. Essas substâncias são designados por subprodutos de desinfecção de água com o cloro (DBP) dos quais destacam-se os trihalometanos (THM), os ácidos haloacéticos (HAA), os haloacetonitrilos (HAN), as haloacetonas (HK). A concentração dessas substâncias em águas para consumo humano é muito baixa e constitui sempre um desafio a sua detecção e quantificação. Neste trabalho desenvolveu-se e optimizou-se métodos de análises de DBP em água para consumo humano. Os DBP voláteis foram analisados por headspace e cromatografia gasosa com detecção por captura electrónica (HS-GC-ECD) e por microextracção em fase sólida no headspace e cromatografia gasosa com detecção por captura electrónica (SPME-HS-GC-ECD). Para os DBP não voláteis (HAA) aplicou-se a extracção em fase sólida e cromatografia líquida com detector de fila de diodos (SPE-RPHPLC- DAD). Foram analisados os DBP na água dessalinizada por osmose inversa proveniente de Cabo Verde e na água da cidade de Porto, de forma a verificar as diferenças em termos qualitativos e quantitativos. Usou-se um planeamento factorial de Box-Behnken para a optimização de métodos analíticos. Este modelo foi igualmente aplicado na simulação laboratorial de dessalinização da água do mar por osmose inversa e desinfecção com o cloro, tendo como objectivo identificar os factores mais significativos na formação de DBP em água dessalinizada (pH, temperatura e tempo de desinfecção).

Simple and fast methods based on solid-phase extraction coupled to liquid chromatography with UV detection for the monitoring of caffeine in natural and waste waters as marker of anthropogenic impact

Two concentration methods for fast and routine determination of caffeine (using HPLC-UV detection) in surface, and wastewater are evaluated. Both methods are based on solid-phase extraction (SPE) concentration with octadecyl silica sorbents. A common “offline” SPE procedure shows that quantitative recovery of caffeine is obtained with 2 mL of an elution mixture solvent methanol-water containing at least 60% methanol. The method detection limit is 0.1 μg L−1 when percolating 1 L samples through the cartridge. The development of an “online” SPE method based on a mini-SPE column, containing 100 mg of the same sorbent, directly connected to the HPLC system allows the method detection limit to be decreased to 10 ng L−1 with a sample volume of 100 mL. The “offline” SPE method is applied to the analysis of caffeine in wastewater samples, whereas the “on-line” method is used for analysis in natural waters from streams receiving significant water intakes from local wastewater treatment plants

Degradação de ametrina em areia quartzosa com adição de solo rizosférico de cana-de-açúcar

Utilizando amostras de Areia Quartzosa esterilizada, não esterilizada e com adição de 10% de solo da rizosfera de cana-de-açúcar cultivada em campo, na presença e na ausência do herbicida ametrina, a biodegradação de 14C-ametrina foi avaliada juntamente com a quantidade de resíduos extraíveis, não-extraíveis e número de microrganismos presentes. A taxa de desprendimento de 14CO2 aumentou em 3,5 vezes, com adição de solo rizosférico de culturas previamente tratadas com o herbicida, em 1,7 vez, com a adição de solo de rizosfera de culturas não tratadas. A presença de metabólitos detectada por cromatografia de camada delgada revela a maior degradação nas amostras que tiveram a adição de solo rizosférico. A microbiota presente na rizosfera ocasionou maior mineralização do herbicida ametrina.

Degradação de xenobióticos por fungos filamentosos isolados de areia fenólica

Microrganismos foram isolados de areia fenólica resultante de atividades metalúrgicas, utilizando meio mínimo para fungos e pentaclorofenol (PCF) como única fonte de carbono. Após quatro repiques sucessivos em intervalos de 15 dias de incubação, as culturas foram plaqueadas em meio de Martin. Três gêneros de fungos foram isolados e identificados como Acremonium sp., Paecilomyces sp. e Penicillium sp. Estes foram testados para degradar os corantes índigo e RBBR (Azul Brilhante de Remazol - R) e o organoclorado PCF. A descoloração do índigo foi de 99%, para Paecilomyces e Penicillium, e de 74%, para Acremonium, e a de RBBR foi de 16%, para Penicillium; 14%, para Acremonium, e 5%, para Paecilomyces. Usando azul de bromotimol como indicador de degradação de PCF, foram obtidos 24% de descoloração para Acremonium; 22%, para Penicillium, e 17%, para Paecilomyces Utilizando cromatografia gasosa, detectou-se degradação de PCF de 69%, para Penicillium; 65%, para Paecilomyces, e 40% para Acremonium, respectivamente. Os resultados mostraram que foi possível isolar microrganismos de uma areia de fundição, altamente contaminada com fenóis, e os fungos isolados foram capazes de degradar PCF e outros xenobióticos testados.

Características estruturais de ácidos húmicos isolados de solos com adição de resíduos orgânicos de origem urbana: composição elementar, análise de RMN 13C e Pi-CG/EM

Foram avaliadas as alterações nas características estruturais de ácidos húmicos (AH) decorrentes da adição de matéria orgânica de resíduos urbanos. Os AH foram extraídos da camada superficial (0-20 cm) de um Argissolo Vermelho-Amarelo (Seropédica, RJ) e de um Latossolo Vermelho Amarelo (Piraí, RJ), ambos tratados com o equivalente a 80 t ha-1 (em base seca) de composto de lixo urbano e lodo de estação de tratamento de esgotos. O tempo de incubação em laboratório foi de 24 semanas à temperatura ambiente e umidade mantida na capacidade de campo. Para caracterizar os AH, foram utilizadas a análise elementar, a ressonância magnética nuclear (RMN) de 13C e Pirólise acoplada à cromatografia gasosa e a espectrometria de massas (Pi-CG/EM). A análise de RMN 13C permitiu observar alterações na composição molecular dos AH de forma clara, principalmente, pelo aumento do teor de C mono e di oxigenados (δC 50-110) e pela diminuição dos teores de grupos CH2 e CH3 (δC 50-110). O aumento no teor de carboidratos evidencia a presença de estruturas mais lábeis nos AH com adição dos resíduos. Em adição, a técnica de Pi-CG/EM permitiu verificar diferenças qualitativas significativas nos compostos orgânicos, provenientes da fragmentação térmica dos AH com incorporação de novas estruturas, sobretudo da fração lipídica e de derivados de carboidratos (furanos), nas amostras de solos tratados com ambos os resíduos orgânicos. O uso em conjunto das técnicas analíticas de RMN 13C e de Pi-CG/EM foi eficiente para avaliar as mudanças na composição molecular de ácidos húmicos decorrentes da adição de resíduos orgânicos de origem urbana.

Resíduos de plantas de cobertura e mobilidade dos produtos da dissolução do calcário aplicado na superfície do solo

As plantas de cobertura têm recebido atenção adicional em função da liberação de ácidos orgânicos de baixo peso molecular capazes de formar complexos orgânicos com alumínio, cálcio e magnésio. Dessa forma, além de neutralizarem o alumínio tóxico, esses ácidos podem aumentar a mobilidade, no perfil do solo, dos produtos originados da dissolução do calcário aplicado na superfície. Os objetivos deste trabalho foram (a) identificar os ácidos orgânicos de baixo peso molecular presentes nos resíduos de plantas de cobertura e na solução do solo; (b) avaliar o efeito desses resíduos, juntamente com a aplicação superficial de calcário, na correção da acidez das camadas subsuperficiais do solo no sistema plantio direto, e (c) verificar a relação dos ácidos orgânicos de baixo peso molecular, liberados na decomposição de resíduos vegetais, com os efeitos, na profundidade do solo, da aplicação superficial de calcário. O experimento foi realizado em casa de vegetação em colunas de PVC com amostras indeformadas de um Cambissolo Húmico Alumínico Léptico argiloso há cinco anos no sistema plantio direto. Os tratamentos constaram da aplicação de resíduos (10 Mg ha-1) de aveia preta (1), ervilhaca (2) e nabo forrageiro (3), calcário (13 Mg ha-1) (4), calcário mais resíduo de aveia preta (5), de ervilhaca (6) e de nabo forrageiro (7) calcário mais ácido cítrico (0,91 Mg ha-1) (8) e uma testemunha (9), dispostos em blocos ao acaso. O uso da cromatografia líquida permitiu identificar os ácidos orgânicos de baixo peso molecular nos resíduos vegetais utilizados. Na aveia preta, houve predomínio do ácido transaconítico, na ervilhaca predominou o ácido málico e no nabo forrageiro os ácidos cítrico e málico. Não foi possível detectar nenhum tipo de ácido orgânico de baixo peso molecular tanto na solução percolada como na solução do solo. Os resíduos vegetais não tiveram efeito na correção da acidez do solo em profundidade. Seus efeitos restringiram-se na camada de 0-2,5 cm, tanto isoladamente como junto com o calcário.