Responses in the brain of estrogen receptor α-disrupted mice

These studies sought to determine if neurons in the estrogen receptor-α knockout (ERαKO) mouse brain concentrated 16α-[125I]iodo-11β-methoxy-17β-estradiol (125I-estrogen), and if so, whether estrogen binding augmented the expression of progesterone receptor (PR) mRNA. Mice were injected with 125I-estrogen and cryostat sections thaw mounted onto emulsion-coated slides. After 30–90 days of exposure, cells with a nuclear uptake and retention of 125I-estrogen were observed in a number of ERαKO mouse brain regions including the preoptic nucleus and arcuate nucleus of the hypothalamus, bed nucleus of the stria terminalis, and amygdala, although the number of labeled cells and intensity of nuclear concentration was markedly attenuated when compared with wild-type littermates. Competition studies with excess 17β-estradiol, diethylstilbestrol, or moxestrol, but not with R5020 or dihydrotestosterone, prevented the nuclear concentration of 125I-estrogen. To determine if the low level of estrogen binding was capable of regulating gene expression, in situ hybridization was used to evaluate PR mRNA in the brain. ERαKO and wild-type mice were ovariectomized and treated with vehicle or 17β-estradiol, and brains were sectioned and hybridized with a PR cRNA probe. Analysis of hybridization signal revealed a similar, low level of PR mRNA in ovariectomized wild-type and homozygous mice, and a marked increase in expression after treatment of ovariectomized animals with 17β-estradiol, with the level of hybridization signal being significantly higher in wild-type animals when compared with ERαKO mice. The results demonstrate that estrogen binds in the ERαKO brain and is capable of modulating PR gene expression, thus supporting the presence and functionality of a nonclassical estrogen receptor.

Ribosomes can slide over and beyond “hungry” codons, resuming protein chain elongation many nucleotides downstream

In cells subjected to moderate aminoacyl-tRNA limitation, the peptidyl-tRNA–ribosome complex stalled at the “hungry” codon can slide well beyond it on the messenger RNA and resume translation further downstream. This behavior is proved by unequivocal amino acid sequence data, showing a protein that lacks the bypassed sequence encoded between the hungry codon and specific landing sites. The landing sites are codons cognate to the anticodon of the peptidyl-tRNA. The efficiency of this behavior can be as high as 10–20% but declines with the length of the slide. Interposition of “trap” sites (nonproductive landing sites) in the bypassed region reduces the frequency of successful slides, confirming that the ribosome–peptidyl-tRNA complex passes through the untranslated region of the message. This behavior appears to be quite general: it can occur at the two kinds of hungry codons tested, AUA and AAG; the sliding peptidyl-tRNA can be any of three species tested, phenylalanine, tyrosine, or leucine tRNA; the peptidyl component can be either of two very different peptide sequences; and translation can resume at any of the three codons tested.

Red blood cell adhesion on a solid/liquid interface

Red blood cells (RBCs), previously fixed with glutaraldehyde, adhere to glass slides coated with fibrinogen. The RBC deposition process on the horizontal glass surface is investigated by analyzing the relative surface covered by the RBCs, as well as the variance of this surface coverage, as a function of the concentration of particles. This study is performed by optical microscopy and image analysis. A model, derived from the classical random sequential adsorption model, has been developed to account for the experimental results. This model highlights the strong influence of the hydrodynamic interactions during the deposition process.

Blood-borne tissue factor: Another view of thrombosis

Arterial thrombosis is considered to arise from the interaction of tissue factor (TF) in the vascular wall with platelets and coagulation factors in circulating blood. According to this paradigm, coagulation is initiated after a vessel is damaged and blood is exposed to vessel-wall TF. We have examined thrombus formation on pig arterial media (which contains no stainable TF) and on collagen-coated glass slides (which are devoid of TF) exposed to flowing native human blood. In both systems the thrombi that formed during a 5-min perfusion stained intensely for TF, much of which was not associated with cells. Antibodies against TF caused ≈70% reduction in the amount of thrombus formed on the pig arterial media and also reduced thrombi on the collagen-coated glass slides. TF deposited on the slides was active, as there was abundant fibrin in the thrombi. Factor VIIai, a potent inhibitor of TF, essentially abolished fibrin production and markedly reduced the mass of the thrombi. Immunoelectron microscopy revealed TF-positive membrane vesicles that we frequently observed in large clusters near the surface of platelets. TF, measured by factor Xa formation, was extracted from whole blood and plasma of healthy subjects. By using immunostaining, TF-containing neutrophils and monocytes were identified in peripheral blood; our data raise the possibility that leukocytes are the main source of blood TF. We suggest that blood-borne TF is inherently thrombogenic and may be involved in thrombus propagation at the site of vascular injury.

Immobilization of oligodeoxyribonucleotides with multiple anchors to microchips

Facile modification of oligodeoxyribonucleotides is required for efficient immobilization to a pre-activated glass surface. This report presents an oligodeoxyribonucleotide which contains a hairpin stem–loop structure with multiple phosphorothioate moieties in the loop. These moieties are used to anchor the oligo to glass slides that are pre-activated with bromoacetamidopropylsilane. The efficiency of the attachment reaction was improved by increasing the number of phosphorothioates in the loop, as shown in the remarkable enhancement of template hybridization and single base extension through catalysis by DNA polymerase. The loop and stem presumably serve as lateral spacers between neighboring oligodeoxyribonucleotides and as a linker arm between the glass surface and the single-stranded sequence of interest. The oligodeoxyribonucleotides of this hairpin stem–loop architecture with multiple phosphorothioate moieties have broad application in DNA chip-based gene analysis.

Detection of mitochondrial single nucleotide polymorphisms using a primer elongation reaction on oligonucleotide microarrays

We have developed a novel allele-specific primer elongation protocol using a DNA polymerase on oligonucleotide chips. Oligonucleotide primers carrying polymorphic sites at their free 3́end were covalently bound to glass slides. The generation of single-stranded targets of genomic DNA containing single nuclotide polymorphisms (SNPs) to be typed was achieved by an asymmetric PCR reaction or exonuclease treatment of phosphothioate (PTO)-modified PCR products. In the presence of DNA polymerase and all four dNTPs, with Cy3-dUTP replacing dTTP, allele-specific extension of the immobilized primers took place along a stretch of target DNA sequence. The yield of elongated products was increased by repeated reaction cycles. We performed multiplexed assays with many small DNA targets, or used single targets of up to 4.4 kb mitochondrial DNA (mtDNA) sequence to detect multiple SNPs in one reaction. The latter approach greatly simplifies preamplification of SNP-containing regions, thereby providing a framework for typing hundreds of mtDNA polymorphisms.

Manufacturing DNA microarrays of high spot homogeneity and reduced background signal

Analyses on DNA microarrays depend considerably on spot quality and a low background signal of the glass support. By using betaine as an additive to a spotting solution made of saline sodium citrate, both the binding efficiency of spotted PCR products and the homogeneity of the DNA spots is improved significantly on aminated surfaces such as glass slides coated with the widely used poly-l-lysine or aminosilane. In addition, non-specific background signal is markedly diminished. Concomitantly, during the arraying procedure, the betaine reduces evaporation from the microtitre dish wells, which hold the PCR products. Subsequent blocking of the chip surface with succinic anhydride was improved considerably in the presence of the non-polar, non-aqueous solvent 1,2-dichloroethane and the acylating catalyst N-methylimidazole. This procedure prevents the overall background signal that occurs with the frequently applied aqueous solvent 1-methyl-2-pyrrolidone in borate buffer because of DNA that re-dissolves from spots during the blocking process, only to bind again across the entire glass surface.

Designing surfaces that kill bacteria on contact

Poly(4-vinyl-N-alkylpyridinium bromide) was covalently attached to glass slides to create a surface that kills airborne bacteria on contact. The antibacterial properties were assessed by spraying aqueous suspensions of bacterial cells on the surface, followed by air drying and counting the number of cells remaining viable (i.e., capable of growing colonies). Amino glass slides were acylated with acryloyl chloride, copolymerized with 4-vinylpyridine, and N-alkylated with different alkyl bromides (from propyl to hexadecyl). The resultant surfaces, depending on the alkyl group, were able to kill up to 94 ± 4% of Staphylococcus aureus cells sprayed on them. A surface alternatively created by attaching poly(4-vinylpyridine) to a glass slide and alkylating it with hexyl bromide killed 94 ± 3% of the deposited S. aureus cells. On surfaces modified with N-hexylated poly(4-vinylpyridine), the numbers of viable cells of another Gram-positive bacterium, Staphylococcus epidermidis, as well as of the Gram-negative bacteria Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli, dropped more than 100-fold compared with the original amino glass. In contrast, the number of viable bacterial cells did not decline significantly after spraying on such common materials as ceramics, plastics, metals, and wood.

Potential effects of gas hydrate on human welfare

For almost 30 years. serious interest has been directed toward natural gas hydrate, a crystalline solid composed of water and methane, as a potential (i) energy resource, (ii) factor in global climate change, and (iii) submarine geohazard. Although each of these issues can affect human welfare, only (iii) is considered to be of immediate importance. Assessments of gas hydrate as an energy resource have often been overly optimistic, based in part on its very high methane content and on its worldwide occurrence in continental margins. Although these attributes are attractive, geologic settings, reservoir properties, and phase-equilibria considerations diminish the energy resource potential of natural gas hydrate. The possible role of gas hydrate in global climate change has been often overstated. Although methane is a “greenhouse” gas in the atmosphere, much methane from dissociated gas hydrate may never reach the atmosphere, but rather may be converted to carbon dioxide and sequestered by the hydrosphere/biosphere before reaching the atmosphere. Thus, methane from gas hydrate may have little opportunity to affect global climate change. However, submarine geohazards (such as sediment instabilities and slope failures on local and regional scales, leading to debris flows, slumps, slides, and possible tsunamis) caused by gas-hydrate dissociation are of immediate and increasing importance as humankind moves to exploit seabed resources in ever-deepening waters of coastal oceans. The vulnerability of gas hydrate to temperature and sea level changes enhances the instability of deep-water oceanic sediments, and thus human activities and installations in this setting can be affected.

Limited surface exposure of Borrelia burgdorferi outer surface lipoproteins.

We used novel immunofluorescence strategies to demonstrate that outer surface proteins (Osps) A, B and C of Borrelia burgdorferi have limited surface exposure, finding that contradicts the prevailing viewpoint that these antigens are exclusively surface exposed. Light labeling was observed when antibodies to OspA or OspB were added to motile organisms, whereas intense fluorescence was observed when the same slides were methanol-fixed and reprobed. Modest labeling also was observed when spirochetes encapsulated in agarose beads (gel microdroplets) were incubated with antibodies to these same two antigens. This contrasted with the intense fluorescence observed when encapsulated spirochetes were probed in the presence of 0.06% Triton X-100, which selectively removed outer membranes. Proteinase K (PK) treatment of encapsulated spirochetes abrogated surface labeling. However, PK-treated spirochetes fluoresced intensely after incubation with antibodies to OspA or OspB in the presence of detergent, confirming the existence of large amounts of subsurface Osp antigens. Modest surface labeling once again was detected when PK-treated spirochetes were reprobed after overnight incubation, a result consistent with the existence of a postulated secretory apparatus that shuttles lipoproteins to the borrelial surface. Last, experiments with the OspC-expressing B. burgdorferi strain 297 revealed that this antigen was barely detectable on spirochetal surfaces even though it was a major constituent of isolated outer mem- branes. We propose a model of B. burgdorferi molecular architecture that helps to explain spirochetal persistence during chronic Lyme disease.

Do psicólogo no programa de residência multiprofissional em saúde: posição-sujeito, análise de discurso e psicanálise lacaniana

A residência multiprofissional em saúde é uma modalidade de ensino de pós graduação lato sensu, voltada para a educação em serviço. Emerge no contexto brasileiro como uma proposta complementar a fim de se atingir as metas e os princípios preconizados pelo sistema único de saúde (SUS), principalmente quanto à integralidade. Além de trazer implicações e lançar desafios ao exercício profissional do psicólogo, inserindo-o no entrelaçamento de campos densos e complexos (saúde, educação e políticas públicas), a modalidade propõe que profissionais com formações diferentes atuem num mesmo campo, com discussões e intervenções conjuntas. A questão que move a pesquisa é a posição-sujeito no programa de residência multiprofissional face ao modelo de educação-saúde vinculado. Assevera-se que a posição-sujeito é objeto discursivo deslizante (de tessitura simbólica) que toma em consideração o sujeito constituído no claudicar da linguagem e interpelado pelo inconsciente e que se manifesta como efeito de significantes em direção ao grande Outro. Para tal, vale-se da interface dos aportes teóricos da análise de discurso pêchetiana e da psicanálise lacaniana. A análise de discurso sustenta o discurso como efeito de sentidos mediados pela ideologia e ocupa-se, especialmente, da incursão da alteridade do discurso-outro sobre o mesmo. A psicanálise lacaniana, por sua vez, reitera a primazia do inconsciente estruturado como linguagem diante de um eu imaginário e versa para o sujeito marcado como falta que, dividido, faz do discurso o estatuto do significado. Assim, é proeminente na análise do objeto a metodologia indiciária dada ao caráter simbólico e cambiante da posição-sujeito no discurso. A análise se realizou mediante o dispositivo da interpretação como gesto analítico, que acompanha as elações próprias do objeto. O corpora é constituído por uma materialidade escrita e por uma oral. A escrita compõe-se de recortes de leis, portarias e resoluções que fundam a modalidade de residência multiprofissional e reforçam os ideias do sistema único de saúde; a materialidade oral compõe-se de recortes e fragmentos discursivos advindos da transcrição de supervisões realizadas mediante a prática clínica do psicólogo-residente na cena hospitalar. Da análise, conclui-se que a materialidade escrita se posta como campo-Outro que ordena a estrutura política da residência multiprofissional e direciona a manutenção da ordem e reprodução das relações hierárquicas mediante ideologia assujeitante. Essa materialidade, por sua vez, age como intradiscurso e reverbera-se na memória discursiva e na prática clínica. A posição-sujeito, no plano da articulação significante, faz deslizar e produzir sentidos que denotam ora a manutenção e reprodução de uma posição fusionada ao discurso médico, científico-positivista; ora a posição-sujeito é marcada pelo saber condicionado ao fetiche da mercadoria, deflagrando a ordem do capital nas insígnias da multiprofissionalidade e da educação permanente. O trabalho propiciou, enfim, acompanhar as transmutações da posição-sujeito, independentemente do indivíduo ou da naturalização de sentidos provenientes da função que exerce. O objeto posição-sujeito reiterou a construção da realidade a partir da condição faltante. É essa condição faltante e incompleta que outorga ao desejo o modo de o sujeito se posicionar desta e outra maneira - na formação, no trabalho, na vida.

Anatomia ecológica do lenho de espécies arbustivas e arbóreas que ocorrem naturalmente em bosques com drástico gradiente de precipitação ao Noroeste da Patagônia, Argentina

A utilização de gradientes ambientais no estudo de comunidades vegetais possibilita a eleição de sítios onde há a predominância de um fator abiótico que determina o sucesso ou o fracasso de espécies ao longo de sua extensão. Entre as inúmeras ferramentas utilizadas no estudo de gradientes climáticos, se destaca a anatomia do lenho, pois, é um ramo da ciência que permite analisar, além dos aspectos espaciais, os aspectos temporais dos sítios por meio dos anéis de crescimento. Além disso, a ampla distribuição das plantas lenhosas ao longo do globo possibilita análises em praticamente todos os tipos de biomas e ecossistemas terrestres. Dentro desse contexto estão os bosques andino-patagônicos de Araucaria araucana (Pehuén) ao norte de sua distribuição na Argentina. Esses bosques ocupam territórios caracterizados por um acentuado gradiente de precipitação, que vai de cerca de 3000 a 100 milímetros anuais, entre a cordilheira do Andes e a estepe patagônica, que os define como bosques mésicos e xéricos, com diferenças ecológicas que condicionam a formação vegetal, dinâmica, estrutura, relações com o clima e vulnerabilidade em cenários de mudanças ambientais. O objetivo do projeto foi descrever e analisar comparativamente a estrutura anatômica do lenho de 33 espécies arbóreas e arbustivas ocorrentes ao longo de um gradiente de precipitação, entre a encosta da cordilheira dos Andes e a estepe Patagônica, para verificar possíveis alterações anatômicas que permitam a determinação de tendências e elucidem os limites de distribuição das espécies. Foram coletadas amostras não destrutivas de lenho durante três expedições para a Patagônia entre 2012 e 2014, seguidas de procedimentos laboratoriais de confeccção de lâminas histológicas, preparo de amostras para análises dendrocronológicas, captura de imagens com câmeras acopladas a microscópios óptico e eletrônico de varredura, mensurações, descrições e análises comparativas com o auxílio de softwares. Foram identificados caracteres anatômicos exclusivos de sítios secos e úmidos que permitiram a caracterização, posicionamento ao longo do gradiente de precipitação e grupamento de espécies xerófitas e mesófitas; A ultra-estrutura das pontoações de traqueídeos de Araucaria araucana apresentou diferenças marcantes na frequência e porosidade de suas membranas, sendo maior e menos porosas em sítios xéricos, e menor e mais porosas nos mésicos; a chave dicotômica microscópica permitiu a identificação das 32 espécies arbustivas, as espécies Chuquiraga oppositifolia e Nothofagus antarctica apresentaram potencial dendrocronológico, e foram identificadas tendências anatômicas latitudinais influenciadas pelo clima nos extremos da América do Sul. A anatomia do lenho se mostrou uma ferramenta confiável no estudo de um gradiente de precipitação na Patagônia argentina, e os resultados apontam para riscos de embolismos e morte induzida por falha no sistema hidráulico de Araucaria araucana ao longo de todo o gradiente, em função do atual cenário climático, e suas projeções em médio e longo prazos.

Infecção concomitante experimental de Rattus norvegicus por Toxocara canis e Toxoplasma gondii: estudo comportamental e histopatológico

A hipótese de \"manipulação comportamental\" supõe que um parasito pode alterar o comportamento de seu hospedeiro visando aumentar a probabilidade de completar seu ciclo evolutivo. Tais alterações aumentariam a taxa de transmissão hospedeirohospedeiro, assegurando ao parasito ou a seus propágulos o encontro de novo hospedeiro. A possibilidade de infecções parasitárias provocarem mudanças comportamentais em seus hospedeiros e a elevada frequência com que o acometimento de seres humanos por larvas de Toxocara e cistos de Toxoplasma ocorre, têm chamado à atenção de pesquisadores interessados no estudo das relações hospedeiro-parasita. Na infecção por Toxoplasma gondii e Toxocara canis, cistos e larvas estão presentes em diversos locais anatômicos incluindo musculatura, coração, pulmões, olhos e cérebro. A presença de parasitos no cérebro dá oportunidade de manipulação do comportamento do hospedeiro. Entretanto, não se sabe qual ou quais mecanismos estão envolvidos no processo de manipulação do comportamento. Os objetivos do presente estudo foram verificar alterações na ansiedade, medo, memória e aprendizagem de Rattus norvegicus experimentalmente infectados por Toxocara canis e/ou Toxoplasma gondii em dois períodos após infecção, bem como a localização das larvas e cistos e presença de placas beta amiloide ( A) na região do hipocampo no tecido cerebral desses roedores corado pela técnica de Hematoxilina e Eosina (HE), e Vermelho de Congo, respectivamente. Foram utilizadas 40 exemplares fêmeas da espécie Rattus norvegicus, com seis a oito semanas. Os animais foram divididos em quatro grupos: Toxocara - 10 ratos infectados com 300 ovos de Toxocara canis, Toxoplasma -10 ratos infectados com 10 cistos de Toxoplasma gondii, Infecção dupla - 10 ratos infectados com 300 ovos de Toxocara canis e 10 cistos de Toxoplasma gondii, e controle - 10 ratos sem infecção. Nos dias 40, 41, 70 e 71 após a infecção, os animais dos grupos infectados e controle foram submetidos à avaliação no Labirinto em Cruz Elevado e Campo aberto. Aos 120 após infecção foi feita avaliação da memória, aprendizado e aversão a urina de gato dos animais no Labirinto de Barnes. No final das análises comportamentais os animais foram levados a eutanásia para retirada do cérebro e confecção dos cortes histológicos preparados em HE e Vermelho de Congo. Os resultados mostraram efeito ansiolítico para ambas as infecções, principalmente para Toxoplasma gondii. Não houve comprometimento da memória e aprendizado no LB, porém os animais infectados por Toxocara canis ou Toxoplasma gondii apresentaram menor tempo para encontrar a toca com urina e entrar nela. A leitura dos cortes histológicos corados com HE mostraram larvas de Toxocara canis e cistos de Toxoplasma gondii em regiões do sistema nervoso central dos animais relacionadas com memória e aprendizado. As lâminas coradas com Vermelho de Congo apresentaram placas beta amiloides ( A) em metade dos animais infectados por Toxoplasma gondii. Conclui-se que a infecção por ambos os parasitos apresenta efeito ansiolítico quando ocorre infecção única. Quando a Infecção ocorre concomitantemente há modulação no comportamento. Além disso, ratas infectadas com infecção única apresentam-se menos aversivas à urina de gatos.

Estratégias de microfabricação utilizando toner para produção de dispositivos microfluídicos

Neste trabalho são apresentados processos de microfabricação de estruturas contendo microcanais e sistemas de manipulação hidrodinâmica e eletroosmótica de fluídos. Foram desenvolvidos processos de microfabricação utilizando toner sobre poliéster, toner sobre vidro, toner como resiste, além de métodos alternativos de perfuração de lâminas e selagem de microestruturas em vidro, desenvolvimento de microestruturas para eletroforese capilar e espectrometria de massas com ionização por eletronebulização. A caracterização dos materiais e processos permitiu uma ampla visão das potencialidades e alternativas dos processos de microfabricação, tendo sido demonstrado que os dispositivos produzidos em toner-poliéster são quimicamente resistentes às substâncias tipicamente utilizadas em eletroforese capilar. Neste trabalho, um detector condutométrico sem contato foi implementado em microestruturas de toner-poliéster e a separação eletroforética de alguns metais alcalinos é demonstrada. A microestrutura foi projetada no formato padrão em cruz, tendo o canal de separação 22 mm de comprimento, 12 µm de profundidade e largura típica. A cela condutométrica foi construída sobre o canal de separação utilizando-se fita adesiva de cobre (1 mm de largura) como eletrodos. O sinal aplicado na cela foi de 530 kHz e 10 Vpp . A separação de K+, Na+ e Li+ na concentração de 100 µmol L-1 foi efetuada em torno de 0,8 min, utilizando-se 1 kV como potencial de separação. Foram desenvolvidos microchips para análise por espectrometria de massas com introdução de amostra por eletronebulização, sendo determinado cluster do íon cloreto em concentração de 1 mmol L+. Também solução com 1 mmol/L de glucosamina em água/metanol 1: 1 (v/v), sob corrente de 100 nA gerou sinal estável e livre de descarga corona. Utilizando detecção amperométrica, obteve-se eletroferogramas mostrando a separação de iodeto (10 mmol L-1) e ascorbato (40 mmol L-1) em potencial de separação de 4,0 kV (800 V cm-1 potencial de detecção de 0,9 V (vs. Ag/AgCI), injeção com 1,0 kV/1°s, tampão borato de sódio 10 mmol L+ com CTAH 0,2 mmol L-1, pH 9,2. Obteve-se eficiência de 1,6.104 pratos/m e foi possível obter limites de detecção de 500 nmol L-1 (135 amol) e 1,8 µmol L-1 (486 amol) para iodeto e ascorbato, respectivamente. O processo de fabricação utilizando toner como material estrutural para microchips em vidro foi bem estabelecido, assim como os modos de detecção fotométrico e condutométrico foram demonstrados. Foram obtidos eletroferogramas par detecção condutométrica sem contato de solução 200 µmol L-1 de K+, Na+ e U+, em tampão histidina/ácido lático 30 mmol L-1 9:1 (v/v) água:metanol, injeção eletrocinética de 2,0 kV/5,0 s, potencial de separação de 1 kV, 530 kHz de frequência e tensão de 2,0 Vpp. Também foi implementado um sistema de detecção fotométrico para microchip operando em 660 nm, tendo sido utilizado para a detecção de azul de metileno 1,0 mmol L-1 em tampão de corrida de barato de sódio 20 mmol L-1 (pH 9,2), com o detector posicionado a 40 mm do ponto de injeção e com injeção eletrocinética a 2,0 kV por 12 s com picos bem resolvidos em menos de 1 min.