Reduced pancreatic β-cell mass is associated with decreased FoxO1 and Erk1/2 protein phosphorylation in low-protein malnourished rats

A low-protein diet leads to functional and structural pancreatic islet alterations, including islet hypotrophy. Insulin-signaling pathways are involved in several adaptive responses by pancreatic islets. We determined the levels of some insulin-signaling proteins related to pancreatic islet function and growth in malnourished rats. Adult male Wistar rats (N = 20 per group) were fed a 17% protein (normal-protein diet; NP) or 6% protein (low-protein diet; LP), for 8 weeks. At the end of this period, blood glucose and serum insulin and albumin levels were measured. The morphometric parameters of the endocrine pancreas and the content of some proteins in islet lysates were determined. The β-cell mass was significantly reduced (≅65%) in normoglycemic but hypoinsulinemic LP rats compared to NP rats. Associated with these alterations, a significant 30% reduction in insulin receptor substrate-1 and a 70% increase in insulin receptor substrate-2 protein content were observed in LP islets compared to NP islets. The phosphorylated serine-threonine protein kinase (pAkt)/Akt protein ratio was similar in LP and NP islets. The phosphorylated forkhead-O1 (pFoxO1)/FoxO1 protein ratio was decreased by 43% in LP islets compared to NP islets (P < 0.05). Finally, the ratio of phosphorylated-extracellular signal-related kinase 1/2 (pErk1/2) to total Erk1/2 protein levels was decreased by 71% in LP islets compared to NP islets (P < 0.05). Therefore, the reduced β-cell mass observed in LP rats is associated with the reduction of phosphorylation in mitogenic-related signals, FoxO1 and Erk proteins. The cause/effect basis of this association remains to be determined.

Propofol pretreatment attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats by activating the phosphoinositide-3-kinase/Akt pathway

The aim of this study was to investigate the effect of propofol pretreatment on lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI) and the role of the phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) pathway in this procedure. Survival was determined 48 h after LPS injection. At 1 h after LPS challenge, the lung wet- to dry-weight ratio was examined, and concentrations of protein, tumor necrosis factor-α (TNF-α), and interleukin-6 (IL-6) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were determined using the bicinchoninic acid method or ELISA. Lung injury was assayed via lung histological examination. PI3K and p-Akt expression levels in the lung tissue were determined by Western blotting. Propofol pretreatment prolonged survival, decreased the concentrations of protein, TNF-α, and IL-6 in BALF, attenuated ALI, and increased PI3K and p-Akt expression in the lung tissue of LPS-challenged rats, whereas treatment with wortmannin, a PI3K/Akt pathway specific inhibitor, blunted this effect. Our study indicates that propofol pretreatment attenuated LPS-induced ALI, partly by activation of the PI3K/Akt pathway.

La Rapamycine inhibe l’expression de l’ARNm de l’ADAMTS-4 induit par les cytokines dans les chondrocytes articulaires

Introduction: Durant la pathogenèse d’ostéoarthrose (OA), les cytokines pro-inflammatoires IL-1β (Interleukin-1 beta) et TNF-α (Tumor necrosis factor alpha) stimulent la dégradation des agrécanes par l’aggrécanase-1 ou ADAMTS-4 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif). Ces cytokines peuvent stimuler plusieurs voies de signalisation conduisant ainsi à l’augmentation de l’expression des ADAMTS dans les chondrocytes humains. Les TIMPs (tissue inhibitor of metalloproteinases) présentent des inhibiteurs endogènes de l’ADAMTS. Nous avons démontré que la Rapamycine (un immunosuppresseur et un inhibiteur du mamalian target of Rapamycin (mTOR)) peut avoir des effets bénéfiques dans cette pathologie. Notre étude examine l’effet de la Rapamycine sur l’expression de l’ADAMTS-4 induit par les cytokines, son implication dans certaines voies de signalisation, et son effet sur l’expression du TIMP-3. Méthodes: Des chondrocytes normaux sont traités avec la Rapamycine seule ou stimulés aussi avec l’IL-1β et le TNF-α. Les effets de la Rapamycine sur l’expression de l’ADAMTS-4 et du TIMP-3 ont été étudiés par l’analyse RT-PCR et l’activité enzymatique a été étudiée par la technique d’ELISA. Les effets de la Rapamycine sur certaines voies de signalisation ont été étudiés par le Western blot. Résultats: Nous avons trouvé que la Rapamycine inhibe l’expression de l’ARNm de l’ADAMTS-4 induit par les cytokines pro-inflammatoires dans les chondrocytes humains. L’activité enzymatique de l’ADAMTS-4 induit par l’IL-1β a été légèrement diminuée par la Rapamycine. En plus, cette dernière a montré de différents effets sur plusieurs voies de signalisation stimulées par l’IL-1β et le TNF-α telles que les voies des MAPKs (Mitogen activated protein kinase), de l’AKT, et de la p70 S6 kinase. La Rapamycine a inhibé partiellement l’activation de la phosphorylation de l’ERK1/2 MAPK (extracellular signal-regulated protein kinase MAPK) en présence du TNF-α seulement. En outre, la Rapamycine a inhibé la phosphorylation des protéines p38 MAPK, JNK (c-Jun N-terminal kinase), et AKT activée par l’IL-1β seulement. En plus, la phosphorylation de la protéine p70 S6K stimulée par l’IL-1β et le TNF-α a été inhibée par la Rapamycine. D’autre part, nous avons démontré que le niveau du TIMP-3 a été augmenté en présence de la Rapamycine. Conclusion: Ces résultats suggèrent que la Rapamycine peut bloquer l’action de l’ADAMTS-4 via l’inhibition de l’activation des MAPKs, de l’AKT, et de la p70 S6K. La Rapamycine pourrait ainsi être considérée pour la prévention de la perte du cartilage chez les patients ostéoarthritiques.

Role of receptor and non-receptor protein tyrosine kinases in vasoactive peptide-induced signaling

L'endothéline-1 (ET-1) et l'angiotensine II (Ang II) jouent un rôle important dans le maintien de la pression artérielle et l'homéostasie vasculaire. Une activité accrue de ces peptides vasoactifs est présumée contribuer au développement de pathologies vasculaires, telles que l'hypertension, l'athérosclérose, l'hypertrophie et la resténose. Ceci est causé par une activation excessive de plusieurs voies de signalisation hypertrophiques et prolifératives, qui incluent des membres de la famille des Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK), ainsi que la famille phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) / protéine kinase B (PKB). Bien que l'activation de ces voies de signalisation soit bien élucidée, les éléments en amont responsables de l'activation des MAPK et de la PKB, induite par l'ET-1 et Ang II, demeurent mal compris. Durant les dernières années, le concept de la transactivation de récepteurs et/ou non-récepteurs protéines tyrosine kinases (PTK) dans le déclenchement des événements de signalisation induits par les peptides vasoactifs a gagné beaucoup de reconnaissance. Nous avons récemment démontré que la PTK Insulin-like Growth Factor type-1 Receptor (IGF-1R) joue un rôle dans la transduction des signaux induits par l‟H2O2, menant à la phosphorylation de la PKB. Étant donné que les peptides vasoactifs génèrent des espèces réactives d'oxygène, telles que l‟H2O2 lors de leur signalisation, nous avons examiné le rôle de d‟IGF-1R dans la phosphorylation de la PKB et les réponses hypertrophiques dans les cellules muscle lisse vasculaires (CMLV) induites par l'ET-1 et Ang II. AG-1024, un inhibiteur spécifique de l'IGF-1R, a atténué la phosphorylation de la PKB induite à la fois par l'ET-1 et Ang II. Le traitement des CMLVs avec l‟ET-1 et Ang II a également induit une phosphorylation des résidus tyrosine dans les sites d'autophosphorylation d'IGF-1R, celle-ci a été bloquée par l‟AG-1024. En outre, l‟ET-1 et l‟Ang II on tous les deux provoqué la phosphorylation de c-Src, une PTK non-récepteur, bloqué par PP-2, inhibiteur spécifique de la famille Src. La PP-2 a également inhibé la phosphorylation de PKB et d‟IGF-1R induite par l‟ET-1 et l‟Ang II. De plus, la synthèse de protéines ainsi que d‟ADN, marqueurs de la prolifération cellulaire et de l'hypertrophie, ont également été atténuée par l‟AG-1024 et le PP-2. Bien que ce travail démontre le rôle de c-Src dans la phosphorylation PKB induite par l'ET-1 et Ang II, son rôle dans l'activation des MAPK induit par l'ET-1 dans les CMLVs reste controversé. Par conséquent, nous avons examiné l'implication de c-Src dans l'activation de ERK 1/2, JNK et p38MAPK, par l'ET-1 et Ang II, ainsi que leur capacité à régulariser l'expression du facteur de transcription Early growth transcription factor-1 « Egr-1 ». ET-1 et Ang II ont induit la phosphorylation de ERK 1/2, JNK et p38 MAPK, et ont amplifié l'expression d'Egr-1 dans les CMLVs. Cette augmentation de la phosphorylation des MAPK a été diminuée par la PP-2, qui a aussi atténué l'expression d'Egr-1 induite par l'ET-1 et l'Ang II. Une preuve supplémentaire du rôle de c-Src dans ce processus a été obtenue en utilisant des fibroblastes embryonnaires de souris déficientes en c-Src (Src -/- MEF). L'expression d'Egr-1, ainsi que l'activation des trois MAPKs par l'ET-1 ont été atténuées dans les cellules Src -/- par rapport au MEF exprimant des taux normaux Src. En résumé, ces données suggèrent que l'IGF-1R et c-Src PTK jouent un rôle essentiel dans la régulation de la phosphorylation de PKB et des MAPK dans l‟expression d'Egr-1, ainsi que dans les réponses hypertrophiques et prolifératives induites par l'ET-1 et Ang II dans les CMLVs.

Les mécanismes de régulation du métabolisme lipidique par les peptides QRFP (pyroglutamylated RF-amide peptides)

Plusieurs cibles thérapeutiques dans le développement de médicaments contre l’obésité visent une diminution de l’appétit et de la masse adipeuse et à augmenter la dépense énergétique. L’appétit et le métabolisme énergétique sont régulés par certains neuropeptides qui agissent au niveau du système nerveux central, notamment dans l’hypothalamus. Parmi ces neuropeptides, les peptides RF-amide ou QRFP (pyroglutamylated RF-amide peptides), ainsi nommés par la présence du motif conservé Arg-Phe-NH2 dans le domaine C-terminal, induisent une hyperphagie et une augmentation de la masse adipeuse lorsqu’administrés par voie centrale. Les formes bioactives de ces peptides comprennent principalement 43 (QRFP-43) et 26 (QRFP-26) acides aminés. Outre les peptides QRFP, leurs récepteurs, les GPR103 de la famille des récepteurs à 7 passages transmembranaires couplés aux protéines G, sont exprimés dans l’hypothalamus. Plus récemment, des études ont montré la sécrétion de ces neuropeptides, et la présence du GPR103, dans le tissu adipeux. Cependant, le rôle de la voie signalétique (QRFP/GPR103) dans la régulation du métabolisme lipidique au niveau périphérique est peu connu. Les travaux de cette thèse ont porté sur la caractérisation des effets adipogéniques périphériques des neuropeptides QRFP. En premier lieu, nos travaux ont montré que les adipocytes 3T3-L1 et les adipocytes murins isolés des dépôts adipeux blancs expriment le prépro-QRFP et uniquement le récepteur GPR103B, un des deux sous-types de récepteurs présents chez la souris. De plus, nous avons montré que l’expression du récepteur est régulée par une diète riche en lipides réduisant l’expression du prépro-QRFP, mais augmentant celle du GPR103B dans les dépôts lipidiques. Chez l’humain, les adipocytes de l’omentum expriment autant le GPR103 que le prépro-QRFP. Nous avons de plus étudié la fonctionnalité du GPR103B dans les adipocytes 3T3-L1 par l’utilisation d’ARN interférents. Nous avons observé que ce récepteur médie les effets adipogéniques des QRFPs en augmentant l’expression du récepteur nucléaire PPAR-gamma (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) et le facteur de transcription C/EBP-alpha (CCAAT-enhancer binding protein alpha) résultant en une accumulation des triglycérides. Nous avons aussi mis en évidence les effets anti-lipolytiques des QRFPs. En effet, les QRFP inhibent fortement la lipolyse induite avec l’isoprotérénol. L’étude des mécanismes moléculaires à l’origine des effets anti-lipolytiques du QRFP-43 a montré l’activation de la voie de signalisation PI3-K/PKB (phosphatidylinositol 3-kinase/protéine kinase B) en réponse à la stimulation du GPR103B. La réponse anti-lipolytique induite par le QRFP-43 est associée à une diminution de la phosphorylation de la périlipine A (PLIN1a) et de la lipase hormono-sensible (HSL). Nos études ont élucidé les mécanismes conduisant à l’inhibition de la phosphorylation de la PLIN1a en réponse à l’activation du GPR103B, impliquant l’inhibition de la migration de la cavéoline 1 et de la sous unité catalytique de la protéine kinase A (PKA) au niveau des gouttelettes lipidiques, ainsi que l’inhibition de l’activité des Src kinases et de la protéine kinase C (PKC). En conclusion, nos travaux ont montré que les QRFP-43 et -26 exercent un effet adipogénique et anti-lipolytique dans les adipocytes, mettant ainsi en évidence le rôle des neuropeptides QRFPs dans la régulation du métabolisme lipidique au niveau adipocytaire.

Muscarinic M1, M3, Nicotinic,GABAA and GABAB Receptor Subtypes Gene Expression in Insulin Induced Hypoglycemic Rat Brain Regions: Functional Regulation through Phospholipase C and CREB Protein

In the present study, a detailed investigation on the alterations of muscarinic M1, M3, α7 nicotinic acetylcholine receptor (α7 nAchR), GABA receptors and its subtypes; GABAAα1 and GABAB in the brain regions of streptozotocin induced diabetic and insulin induced hypoglycemic rats were carried out. Gene expression of acetylcholine esterase (AChE), choline acetyltransferase (ChAT), GAD, GLUT3, Insulin receptor, superoxide dismutase (SOD), Bax protein, Phospholipase C and CREB in hypoglycemic and hyperglycemic rat brain were studied. Muscarinic M1, M3 receptors, AChE, ChAT, GABAAα1, GABAB, GAD, Insulin receptor, SOD, Bax protein and Phospholipase C expression in pancreas was also carried out. The molecular studies on the CNS and PNS damage will elucidate the therapeutic role in the corrective measures of the damage to the brain during hypoglycemia and hyperglycemia.

Neurochondrin und Rack1 vermitteln die Signalintegration der Proteinkinase A

Die Spezifität und Effizienz zellulärer Signalprozesse wird durch die intrazelluläre Kompartimentierung von Signalmolekülen erreicht. A-Kinase-Ankerproteine (AKAPs) bilden eine Familie aus Gerüstproteinen, die zeitliche und räumliche Lokalisation der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) übernehmen. Die direkte Interaktion wird dabei über die Dimerisierungs- und Dockingdomäne (DD-Domäne) der regulatorischen Untereinheiten von PKA vermittelt. Das charakteristische strukturelle Merkmal bei kanonischen AKAPs ist eine amphipathische Helix. Es existiert allerdings auch eine kleine Gruppe von nicht-kanonischen AKAPs, deren Bindung an die DD-Domäne nicht über eine amphipathische Helix vermittelt wird. In dieser Arbeit wurden die zwei potentiellen nicht-kanonischen AKAPs Neurochondrin (neurite-outgrowth promoting protein) und Rack1 (receptor of activated C-kinase 1) charakterisiert. Neurochondrin, dessen Expression mit dem Neuriten-Wachstum in jungen Neuronen korreliert ist und das vermutlich eine entscheidende Funktion bei der Langzeitpotenzierung im Hippocampus übernimmt, zeigt in SPR-Bindungsstudien eine hochaffine, nanomolare Interaktion mit der R-Untereinheit Typ IIalpha von PKA. Kompetitionsanalysen mit dem AKAP-Disruptor-Peptid Ht 31 und Untersuchungen mit der isolierten DD-Domäne von RIIalpha bestätigen eine spezifische Interaktion. Das nicht-kanonische RII-Bindemotiv von Neurochondrin ist aus zwei Domänen aufgebaut, die einen hohen alpha-helikalen Anteil besitzen, aber keine amphipathische Helix bilden. Peptidbasierte Interaktionsstudien der einzelnen Domänen zeigen dennoch ebenfalls nanomolare Affinitäten zu RIIalpha. Rack1 ist ein etabliertes Gerüstprotein mit einer propellerartigen beta-Faltblattstruktur, für das bereits über 100 verschiedene Interaktionspartner beschrieben werden konnten. Die Integration von Rack1 in unterschiedliche Signalprozesse ist äußerst vielfältig. Um dabei die Spezifität jeder einzelnen Interaktion zu gewährleisten, sind individuelle Bindungsstrategien nötig. Die niedrigaffine Interaktion zur RIbeta-Untereinheit von PKA wird daher über multiple Bindestellen vermittelt. Die DD-Domäne von RIbeta übernimmt dabei eine spezifische Funktion, wie unter anderem durch Kompetitionsanalysen mit dem RI-spezifischen AKAP-Disruptor-Peptid RIAD gezeigt werden konnte. Die einzigartige Struktur der DD-Domäne generiert zudem ein Bindemotiv für Rack1, das Ähnlichkeiten mit der „Rack1 interacting-Domäne“ (RAID) von PDE4D5 aufweist. Sowohl Neurochondrin als auch Rack1 besitzen essenzielle neuronale Funktionen. Daher erweitert die Identifizierung der beiden neuen nicht-kanonischen AKAPs nicht nur die strukturelle Diversität der AKAP-Familie, sondern trägt zudem zum Verständnis der neuronalen Signalintegration von PKA bei.

Convergencia de vías de señalización en un modelo de apoptosis

La sepsis es un evento inflamatorio generalizado del organismo inducido por un daño causado generalmente por un agente infeccioso. El patógeno más frecuentemente asociado con esta entidad es el Staphylococcus aureus, responsable de la inducción de apoptosis en células endoteliales debida a la producción de ceramida. Se ha descrito el efecto protector de la proteína C activada (PCA) en sepsis y su relación con la disminución de la apoptosis de las células endoteliales. En este trabajo se analizó la activación de las quinasas AKT, ASK1, SAPK/JNK y p38 en un modelo de apoptosis endotelial usando las técnicas de Western Blotting y ELISA. Las células endoteliales (EA.hy926), se trataron con C2-ceramida (130μM) en presencia de inhibidores químicos de cada una de estas quinasas y PCA. La supervivencia de las células en presencia de inhibidores químicos y PCA fue evaluada por medio de ensayos de activación de las caspasas 3, 7 y 9, que verificaban la muerte celular por apoptosis. Los resultados evidencian que la ceramida reduce la activación de AKT y aumenta la activación de las quinasas ASK, SAPK/JNK y p38, en tanto que PCA ejerce el efecto contrario. Adicionalmente se encontró que la tiorredoxina incrementa la activación/fosforilación de AKT, mientras que la quinasa p38 induce la defosforilación de AKT.

The citrus flavanone naringenin inhibits inflammatory signalling in glial cells and protects against neuroinflammatory injury

Neuroinflammation plays an integral role in the progression of neurodegeneration. In this study we investigated the anti-inflammatory effects of different classes of flavonoids (flavanones, flavanols and anthocyanidins) in primary mixed glial cells. We found that the flavanones naringenin and hesperetin and the flavols (+)-catechin and (-)-epicatechin, but not the anthocyanidins cyanidin and pelargonidin, attenuated LPS/IFN-gamma-induced TNF-alpha production in glial cells. Naringenin also inhibited LPS/IFN-gamma-induced iNOS expression and nitric oxide production in glial cells, thus showing the strongest antiinflammatory activity among all flavonoids tested. Moreover, naringenin protected against inflammatory-induced neuronal death in a primary neuronal-glial co-culture system. Naringenin also inhibited LPS/IFN-gamma-induced p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) phosphorylation and downstream signal transducer and activator of transcription-1 (STAT-1) in LPS/IFN-gamma stimulated primary mixed glial cells. Taken together, our results suggest that naringenin may produce an anti-inflammatory effect in LPS/IFN-gamma stimulated glial cells that may be due to its interaction with p38 signalling cascades and the STAT-I trascription factor. (C) 2009 Elseiver Inc. All rights reserved.

Isoflavones and endothelial function

Dietary isoflavones are thought to be cardioprotective due to their structural similarity to oestrogen. Oestrogen is believed to have beneficial effects on endothelial function and may be one of the mechanisms by which premenopausal women are protected against CVD. Decreased NO production and endothelial NO synthase activity, and increased endothelin-1 concentrations, impaired lipoprotein metabolism and increased circulating inflammatory factors result from oestrogen deficiency. Oestrogen acts by binding to oestrogen receptors alpha and beta. Isoflavones have been shown to bind with greater affinity to the latter. Oestrogen replacement therapy is no longer thought to be a safe treatment for prevention of CVD; isoflavones are a possible alternative. Limited evidence from human intervention studies suggests that isoflavones may improve endothelial function, but the available data are not conclusive. Animal studies provide stronger support for a role of isoflavones in the vasculature, with increased vasodilation and endothelial NO synthase activity demonstrated. Cellular mechanisms underlying the effects of isoflavones on endothelial cell function are not yet clear. Possible oestrogen receptor-mediated pathways include modulation of gene transcription, and also non-genomic oestrogen receptor-mediated signalling pathways. Putative non-oestrogenic pathways include inhibition of reactive oxygen species production and up regulation of the protein kinase A pathway (increasing NO bioavailability). Further research is needed to unravel effects of isoflavones on intracellular regulation of the endothelial function. Moreover, there is an urgent need for adequately powered, robustly designed human intervention studies in order to clarify the present equivocal findings.

Differential recognition of Staphylococcus aureus quorum-sensing signals depends on both extracellular loops 1 and 2 of the transmembrane sensor AgrC.

Virulence in Staphylococcus aureus is regulated via agr-dependent quorum sensing in which an autoinducing peptide (AIP) activates AgrC, a histidine protein kinase. AIPs are usually thiolactones containing seven to nine amino acid residues in which the thiol of the central cysteine is linked to the alpha-carboxyl of the C-terminal amino acid residue. The staphylococcal agr locus has diverged such that the AIPs of the four different S. aureus agr groups self-activate but cross-inhibit. Consequently, although the agr system is conserved among the staphylococci, it has undergone significant evolutionary divergence whereby to retain functionality, any changes in the AIP-encoding gene (agrD) that modifies AIP structure must be accompanied by corresponding changes in the AgrC receptor. Since AIP-1 and AIP-4 only differ by a single amino acid, we compared the transmembrane topology of AgrC1 and AgrC4 to identify amino acid residues involved in AIP recognition. As only two of the three predicted extracellular loops exhibited amino acid differences, site-specific mutagenesis was used to exchange the key AgrC1 and AgrC4 amino acid residues in each loop either singly or in combination. A novel lux-based agrP3 reporter gene fusion was constructed to evaluate the response of the mutated AgrC receptors. The data obtained revealed that while differential recognition of AIP-1 and AIP-4 depends primarily on three amino acid residues in loop 2, loop 1 is essential for receptor activation by the cognate AIP. Furthermore, a single mutation in the AgrC1 loop 2 resulted in conversion of (Ala5)AIP-1 from a potent antagonist to an activator, essentially resulting in the forced evolution of a new AIP group. Taken together, our data indicate that loop 2 constitutes the predicted hydrophobic pocket that binds the AIP thiolactone ring while the exocyclic amino acid tail interacts with loop 1 to facilitate receptor activation.

Modulation of endothelial cell KCa3.1 Channels during endothelium-derived hyperpolarizing factor signaling in mesenteric resistance arteries

Arterial hyperpolarization to acetylcholine (ACh) reflects coactivation of KCa3.1 (IKCa) channels and KCa2.3 (SKCa) channels in the endothelium that transfers through myoendothelial gap junctions and diffusible factor(s) to affect smooth muscle relaxation (endothelium-derived hyperpolarizing factor [EDHF] response). However, ACh can differentially activate KCa3.1 and KCa2.3 channels, and we investigated the mechanisms responsible in rat mesenteric arteries. KCa3.1 channel input to EDHF hyperpolarization was enhanced by reducing external [Ca2+]o but blocked either with forskolin to activate protein kinase A or by limiting smooth muscle [Ca2+]i increases stimulated by phenylephrine depolarization. Imaging [Ca2+]i within the endothelial cell projections forming myoendothelial gap junctions revealed increases in cytoplasmic [Ca2+]i during endothelial stimulation with ACh that were unaffected by simultaneous increases in muscle [Ca2+]i evoked by phenylephrine. If gap junctions were uncoupled, KCa3.1 channels became the predominant input to EDHF hyperpolarization, and relaxation was inhibited with ouabain, implicating a crucial link through Na+/K+-ATPase. There was no evidence for an equivalent link through KCa2.3 channels nor between these channels and the putative EDHF pathway involving natriuretic peptide receptor-C. Reconstruction of confocal z-stack images from pressurized arteries revealed KCa2.3 immunostain at endothelial cell borders, including endothelial cell projections, whereas KCa3.1 channels and Na+/K+-ATPase {alpha}2/{alpha}3 subunits were highly concentrated in endothelial cell projections and adjacent to myoendothelial gap junctions. Thus, extracellular [Ca2+]o appears to modify KCa3.1 channel activity through a protein kinase A-dependent mechanism independent of changes in endothelial [Ca2+]i. The resulting hyperpolarization links to arterial relaxation largely through Na+/K+-ATPase, possibly reflecting K+ acting as an EDHF. In contrast, KCa2.3 hyperpolarization appears mainly to affect relaxation through myoendothelial gap junctions. Overall, these data suggest that K+ and myoendothelial coupling evoke EDHF-mediated relaxation through distinct, definable pathways.

A novel, non-canonical mechanism of regulation of MST3 (mammalian Sterile20-related kinase 3)

The canonical pathway of regulation of the germinal centre kinase (GCK) III subgroup member, mammalian Sterile20-related kinase 3 (MST3), involves a caspase-mediated cleavage between N-terminal catalytic and C-terminal regulatory domains with possible concurrent autophosphorylation of the activation loop MST3(Thr178-), induction of Ser-/Thr-protein kinase activity and nuclear localisation. We identified an alternative ‘non-canonical’ pathway of MST3 activation (regulated primarily through dephosphorylation) which may also be applicable to other GCKIII (and GCKVI) subgroup members. In the basal state, inactive MST3 co-immunoprecipitated with the Golgi protein, GOLGA2/gm130. Activation of MST3 by calyculin A (a protein Ser-/Thr- phosphatase 1/2A inhibitor) stimulated (auto)phosphorylation of MST3(Thr178-) in the catalytic domain with essentially simultaneous cis-autophosphorylation of MST3(Thr328-) in the regulatory domain, an event also requiring the MST3(341-376) sequence which acts as a putative docking domain. MST3(Thr178-) phosphorylation increased MST3 kinase activity but this activity was independent of MST3(Thr328-) phosphorylation. Interestingly, MST3(Thr328-) lies immediately C-terminal to a STRAD pseudokinase-like site recently identified as being involved in binding of GCKIII/GCKVI members to MO25 scaffolding proteins. MST3(Thr178- /Thr328-) phosphorylation was concurrent with dissociation of MST3 from GOLGA2/gm130 and association of MST3 with MO25, and MST3(Thr328-) phosphorylation was necessary for formation of the activated MST3-MO25 holocomplex.

Structure of the ROC domain from the Parkinson's disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 reveals a dimeric GTPase

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) are the most common cause of Parkinson's disease (PD). LRRK2 contains a Ras of complex proteins (ROC) domain that may act as a GTPase to regulate its protein kinase activity. The structure of ROC and the mechanism(s) by which it regulates kinase activity are not known. Here, we report the crystal structure of the LRRK2 ROC domain in complex with GDP-Mg2+ at 2.0-Å resolution. The structure displays a dimeric fold generated by extensive domain-swapping, resulting in a pair of active sites constructed with essential functional groups contributed from both monomers. Two PD-associated pathogenic residues, R1441 and I1371, are located at the interface of two monomers and provide exquisite interactions to stabilize the ROC dimer. The structure demonstrates that loss of stabilizing forces in the ROC dimer is likely related to decreased GTPase activity resulting from mutations at these sites. Our data suggest that the ROC domain may regulate LRRK2 kinase activity as a dimer, possibly via the C-terminal of ROC (COR) domain as a molecular hinge. The structure of the LRRK2 ROC domain also represents a signature from a previously undescribed class of GTPases from complex proteins and results may provide a unique molecular target for therapeutics in PD.

Glycogen synthase kinase 3 (GSK3) in the heart: a point of integration in hypertrophic signalling and a therapeutic target? A critical analysis

Glycogen synthase kinase 3 (GSK3, of which there are two isoforms, GSK3alpha and GSK3beta) was originally characterized in the context of regulation of glycogen metabolism, though it is now known to regulate many other cellular processes. Phosphorylation of GSK3alpha(Ser21) and GSK3beta(Ser9) inhibits their activity. In the heart, emphasis has been placed particularly on GSK3beta, rather than GSK3alpha. Importantly, catalytically-active GSK3 generally restrains gene expression and, in the heart, catalytically-active GSK3 has been implicated in anti-hypertrophic signalling. Inhibition of GSK3 results in changes in the activities of transcription and translation factors in the heart and promotes hypertrophic responses, and it is generally assumed that signal transduction from hypertrophic stimuli to GSK3 passes primarily through protein kinase B/Akt (PKB/Akt). However, recent data suggest that the situation is far more complex. We review evidence pertaining to the role of GSK3 in the myocardium and discuss effects of genetic manipulation of GSK3 activity in vivo. We also discuss the signalling pathways potentially regulating GSK3 activity and propose that, depending on the stimulus, phosphorylation of GSK3 is independent of PKB/Akt. Potential GSK3 substrates studied in relation to myocardial hypertrophy include nuclear factors of activated T cells, beta-catenin, GATA4, myocardin, CREB, and eukaryotic initiation factor 2Bvarepsilon. These and other transcription factor substrates putatively important in the heart are considered. We discuss whether cardiac pathologies could be treated by therapeutic intervention at the GSK3 level but conclude that any intervention would be premature without greater understanding of the precise role of GSK3 in cardiac processes.