Purification of post-translationally modified proteins from bacteria: homologous expression and purification of histidine-tagged pilin from Neisseria meningitidis

Until recently, glycosylation of proteins in prokaryotes was regarded as uncommon and thought to be limited to special cases such as S-layer proteins and some archeal outer membrane proteins. Now, there are an increasing number of reports of bacterial proteins that are glycosylated. Pilin of pathogenic Neisseria is one of the best characterised post-translation ally modified bacterial proteins, with four different types of modifications reported, including a novel glycosylation. Pilin monomers assemble to form pilus fibres, which are long protein filaments that protrude from the surface of bacterial cells and are key virulence factors. To aid in the investigation of these modifications, pure pilin is required. A number of pilin purification methods have been published, but none are appropriate for the routine purification of pilin from many different isolates. This study describes a novel, rapid, and simple method of pilin purification from Neisseria meningitidis C311#3, which facilitates the production of consistent quantities of pure, native pilin. A 6 x histidine tag was fused to the C-terminus of the pilin subunit structural gene, pilE, via homologous recombination placing the 6 x histidine-tagged allele in the chromosome of N. meningitidis C311#3. Pilin was purified under non-denaturing conditions via a two-step process using immobilised metal affinity chromatography (IMAC), followed by dye affinity chromatography. Analysis of the purified pilin confirmed that it retained both of the post-translational modifications examined. This novel approach may prove to be a generally applicable method for purification and analysis of post-translationally modified proteins in bacteria. (C) 2003 Elsevier Science (USA). All rights reserved.

Genetic characterization of pilin glycosylation and phase variation in Neisseria meningitidis

Pili of Neisseria meningitidis are a key virulence factor, being the major adhesin of this capsulate organism and contributing to specificity for the human host. Pili are post-translationally modified by addition of either an O-linked trisaccharide, Gal (beta1-4) Gal (alpha1-3) 2,4-diacetamido-2,4,6-trideoxyhexose or an O-linked disaccharide Gal (alpha1,3) GlcNAc. The role of these structures in meningococcal pathogenesis has not been resolved. In previous studies we identified two separate genetic loci, pglA and pglBCD, involved in pilin glycosylation. Putative functions have been allocated to these genes; however, there are not enough genes to account for the complete biosynthesis of the described structures, suggesting additional genes remain to be identified. In addition, it is not known why some strains express the trisaccharide structure and some the disaccharide structure. In order to find additional genes involved in the biosynthesis. of these structures, we used the recently published group A strain Z2491 and group B strain MC58 Neisseria meningitidis genomes and the unfinished Neisseria meningitidis group C strain FAM18 and Neisseria gonorrhoeae strain FA1090 genomes to identify novel genes involved in pilin glycosylation, based on homology to known oligosaccharide biosynthetic genes. We identified a new gene involved in pilin glycosylation designated pglE and examined four additional genes pgIB/B2, pglF, pglG and pglH. A strain survey revealed that pglE and pglF were present in each strain examined. The pglG, pglH and pgIB2 polymorphisms were not found in strain C311#3 but were present in a large number of clinical isolates. Insertional mutations were constructed in pglE and pglF in N. meningitidis strain C311#3, a strain with well-defined lipopolysaccharide (LPS) and pilin-linked glycan structures. Increased gel migration of the pilin subunit molecules of pglE and pglF mutants was observed by Western analysis, indicating truncation of the trisaccharide structure. Antisera specific for the C311#3 trisaccharide failed to react with pilin from these pglE and pglF mutants. GC-MS analysis of the sugar composition of the pglE mutant showed a reduction in galactose compared with C311#3 wild type. Analysis of amino acid sequence homologies has suggested specific roles for pglE and pglF in the biosynthesis of the trisaccharide structure. Further, we present evidence that pglE, which contains heptanucleotide repeats, is responsible for the phase variation between trisaccharide and disaccharide structures in strain C311#3 and other strains. We also present evidence that pglG, pglH and pgIB2 are potentially phase variable.

Caracterização molecular, formação de biofilme e susceptibilidade a antimicrobianos de isolados de E. coli de aderência difusa Afa/Dr e não Afa/Dr

A Escherichia coli de aderência difusa (DAEC), um patotipo diarreiogênico de E. coli, corresponde a um grupo heterogêneo sem marcador de virulência comum a todos os isolados e de papel controverso na diarreia infantil. O objetivo deste estudo foi caracterizar genotipica e fenotipicamente amostras de DAEC, portadoras e não portadoras de adesinas Afa/Dr, isoladas de crianças com e sem diarreia. Em 70 amostras de DAEC, PCR foi realizado para pesquisa de genes descritos em DAEC, EAEC ou UPEC, que codificam: (i) oito adesinas fimbriais e afimbriais (fimH, papC, sfa, aggA, aafA, agg3A, aidA/aah, afaC); (ii) cinco toxinas (pet, astA, set1A, sat, hlyA); (iii) três proteínas captadoras/receptora de ferro (irp2, iucA, chuA/shuA); (iv) invasina (daaD) e; antígeno 43 (agn43). Ensaio de formação de biofilme foi realizado a partir da bactéria cultivada em caldo Luria-Bertani e inoculada em placas de poliestireno com DMEM suplementado com 0,4% glicose. A leitura da densidade ótica (DO490) foi realizada após coloração com safranina. Soroaglutinação para 23 antígenos O (Probac do Brasil) foi realizada em 50% das DAEC. Método de difusão de disco foi realizado para testar a suscetibilidade a 13 antimicrobianos. A presença de pelo menos um gene que codifica adesinas, toxinas, proteínas captadoras/receptora de ferro, invasina ou antígeno 43 foram encontrados em 58,6%, 51,4%, 80%, 48,6% e 57,1%, respectivamente, com os genes fimH, irp2, agn43, iucA, chuA/shuA, presentes em mais de 50% das amostras. Gene afaC+ (PCR) e/ou sonda afaBC+ (hibridização de colônias) classificou 50% das DAEC como Afa/Dr, sendo pet, sat, irp2, iucA, chuA/shuA e agn43 significantes nessas amostras (p<0,05). Do total das DAEC, 44,3% foram formadoras de biofilme, igualmente distribuídas entre as Afa/Dr e não Afa/Dr, e nenhum gene foi associado com esse fenótipo. Sorologia de 35 amostras evidenciou os seguintes sorogrupos: 1 O29, 2 O125, 2 O127 e 7 O86. Todas as O86 foram de DAEC Afa/Dr. Maiores frequências de resistência antimicrobiana foram encontradas para ampicilina (55,7%), sulfametoxazol/trimetoprim (35,7%) e tetraciclina (28,6%) e o perfil resistente/intermediário para amoxicilina/ácido clavulânico, ampicilina, sulfametoxazol/trimetoprim foi significante nas DAEC Afa/Dr, assim como a multi-droga resistência (p<0,05). Em conclusão, observou-se: (i) alta frequência de fimH e pet e presença de agn43, até então não descrito em DAEC, em frequências similares àquelas encontradas em EAEC, UPEC e EAEC/UPEC, respectivamente; (ii) que as amostras de DAEC Afa/Dr e não Afa/Dr constituíram grupos com perfis genéticos diferenciados entre si; (iii) poucos sorogrupos foram encontrados entre as DAEC; (iv) frequências de resistência menores quando comparado com as poucas descrições em DAEC, sugerindo uma menor pressão seletiva da população do presente estudo e; (v) amostras de DAEC Afa/Dr podem representar um importante reservatório de genes de resistência a antimicrobianos, além de diversos fatores de virulência.

Detecção e caracterização de patotipos diarreiogênicos de Escherichia coli por métodos fenotípicos e genotípicos em indivíduos de todas as idades atendidos nas unidades de saúde de Vitória-ES

A diarreia é a segunda causa de mortalidade em <5 anos e é responsável pela diminuição da produtividade na população economicamente ativa. Dentre os agentes infecciosos envolvidos, seis patotipos diarreiogênicos de Escherichia coli (DEC) merecem destaque: E. coli enteropatogênica (EPEC), E.coli enteroinvasora (EIEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), E. coli enteroemorrágica ou produtora de toxina de Shiga (EHEC/STEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) e E. coli de aderência difusa (DAEC). O objetivo deste estudo foi determinar a frequência dos patotipos de DEC e caracterizar fenotípica e genotipicamente EAEC, DAEC, aEPEC e E. coli chain-like adhesion (CLA) isolados de fezes indivíduos de todas as idades atendidos nas Unidades de Saúde do município de Vitória, ES, entre janeiro de 2008 e junho de 2011. Os isolados de E. coli foram submetidos à: (i) PCR para detecção dos genes eae, bfpA, aat, lt, st, ipaH, stx1 e stx2; (ii) hibridização de colônia com as sondas eae, aat e daaC; (iii) adesão em cultura de células HEp-2 para evidenciar padrão de aderência agregativa (AA), difusa (DA) e chain-like adhesion (CLA). PCR para detecção de genes de virulência foi realizado em isolados de EAEC, CLA, DAEC e aEPEC. Isolados de EAEC e CLA, foram submetidos a testes de formação de biofilme e de película. Foram obtidos 328 espécimes fecais e E. coli foi isolada de 85,7%. Os seguintes patotipos foram identificados: EAEC (18,3%), DAEC (11%), aEPEC (2,6%), ETEC (0,7%). CLA foi identificada em 4,9% e EIEC, tEPEC e STEC não foram detectados. Dos 60 isolados de EAEC (AA) (25% aat+ por PCR e 35% por hibridização), fímbrias de aderência agregativa foram evidenciadas em baixa frequência (aggA- 1,7%, aafA- 0%, agg3A- 11,7%, hdA- 8,3%). EAEC típica correspondeu a 31,7% dos isolados de EAEC (aggR+), e foram significantes nestas a formação de biofilme, escore 3+ de produção de película e presença dos genes aat, agg3A, hdA, aap, sat, pet, set1A e iucA. Todos os isolados CLA apresentaram o gene pet, 87,5%, foram aggR-, formaram película e nenhum produziu biofilme. Dentre dos 42 isolados de DAEC (DA), a sonda daaC detectou 52,4%. PCR evidenciou adesinas afa/Dr (daaD e afa) em 59,5% e adesina AIDA-I não foi encontrada, sugerindo que outras adesinas estejam envolvidas na adesão da DAEC. Isolados de DAEC afa/Dr + foram estatisticamente mais isolados de <5 anos. Em aEPEC, os genes da ilha de patogenicidade OI-122 pesquisados, nleE, efa1/lifA e paa foram evidenciados em 30% dos isolados, todos provenientes de <5 anos. Características de virulência de tEAEC e DAEC Afa/Dr sugerem que sejam subpopulações relacionadas com diarreia. CLA não parece ser variante de EAEC.

Estudo sobre acetilação da isoniazida em pacientes com tuberculose pulmonar e da sua implicação na redução ou eliminação da carga bacilar no escarro

A N-acetiltransferase 2 é a principal enzima responsável pelo metabolismo e inativação da isoniazida no organismo humano. Mutações no gene NAT2 levam a 3 perfis genotípicos de acetilação que alteram os níveis séricos do fármaco: acetiladores lentos, intermediários e rápidos, o que pode alterar o desfecho terapêutico. O objetivo do estudo foi investigar se os diferentes perfis podem influenciar no tempo de negativação da cultura de escarro, e se existe correlação entre carga bacilar e gravidade da doença com tempo de conversão da cultura. A população de estudo foi composta por 62 pacientes, que tiveram seus DNAs sequenciados para identificação de mutações no gene NAT2 e seus perfis de acetilação determinados. A análise genotípica detectou 10 SNPs, sendo as mutações 341 T>C (39,65%) e 481 C>T (38,71%) as mais frequentes. A determinação das variantes alélicas identificou NAT2*5B (29,03%), NAT2*6A (23,39%) e NAT2*4 (24,19%) como os alelos mais frequentes e NAT2*5B/*5B como o genótipo mais frequente (20,4%). Dentre os 62 pacientes, foi possível correlacionar tempo de negativação da cultura e perfil de acetilação entre 43 deles, os quais 58,3% e 55,6% tiveram o genótipo lento com maior frequência no mês 1 e mês 3, respectivamente. Por meio de dados microbiológicos, a carga bacilar e a gravidade da doença também foram comparadas com o tempo de negativação, indicando que os pacientes com doença moderada ou avançada (76,7%) e aqueles com carga bacilar alta (60,4%), não tiveram associação estatística com o tempo de conversão da cultura. Por último, curvas de crescimento de isolados de M. tuberculosis de pacientes foram construídas para verificar possíveis diferenças na duração da fase lag entre os isolados, porém não foi observada diferença estatística entre elas. Com base nos resultados encontrados, verifica-se que não existe associação entre o perfil de acetilação do paciente, a carga bacilar, a gravidade da doença e o tempo de negativação da cultura de escarro

Caracterização de isolados de Corynespora cassiicola e avaliação da sensibilidade in vitro a fungicidas

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2015.

Accessing Planktothrix species diversity and associated toxins using quantitative real-time PCR in natural waters

Tese de Doutoramento em Biologia apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, 2015.

Isolation and serological identification of enteropathogenic Escherichia coli in pasteurized milk in Brazil

OBJECTIVE: To evaluate the microbiological quality of pasteurized milk commercialized in Rio de Janeiro, Brazil, and determine serologically enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) strains in E. coli isolates obtained from milk samples. METHODS: Ninety samples of pasteurized milk -- types B and C -- of three different commercial brands, purchased in supermarkets and bakeries in Rio de Janeiro, were examined. The amount of total and fecal coliform bacteria was estimated using the Most Probable Number technique. Mesophilic, psychrotrophic, and thermoduric microorganism counts were determined by the Standard Plate Count technique. Isolation and identification of E. coli were carried out using conventional physiological tests. Commercial antisera were used for serological characterization of EPEC. RESULTS: The three milk brands analyzed revealed bacterial counts above the regulated values of the Brazilian government. It was found that among 208 strains of E. coli isolated, 46 (22.1%) were serologically classified as EPEC. The most common EPEC serogroup was O55 (15.2%). CONCLUSIONS: Though recent studies on virulence factors indicate that not all strains serologically classified as EPEC are able to attaching/effacing lesion, it is believed that the isolation of EPEC serogroups from pasteurized milk represent a potential risk for children, as well as an indicative of the presence of other enteropathogens.

PHYLOViZ: phylogenetic inference and data visualization for sequence based typing methods

Background: With the decrease of DNA sequencing costs, sequence-based typing methods are rapidly becoming the gold standard for epidemiological surveillance. These methods provide reproducible and comparable results needed for a global scale bacterial population analysis, while retaining their usefulness for local epidemiological surveys. Online databases that collect the generated allelic profiles and associated epidemiological data are available but this wealth of data remains underused and are frequently poorly annotated since no user-friendly tool exists to analyze and explore it. Results: PHYLOViZ is platform independent Java software that allows the integrated analysis of sequence-based typing methods, including SNP data generated from whole genome sequence approaches, and associated epidemiological data. goeBURST and its Minimum Spanning Tree expansion are used for visualizing the possible evolutionary relationships between isolates. The results can be displayed as an annotated graph overlaying the query results of any other epidemiological data available. Conclusions: PHYLOViZ is a user-friendly software that allows the combined analysis of multiple data sources for microbial epidemiological and population studies. It is freely available at http://www.phyloviz.net.

Prevalência de resistência a antimicrobianos em isolados ambientais de Escherichia coli e enterococos

A água é um recurso escasso e indispensável à vida, podendo ser um importante veículo de microrganismos patogénicos com origem fecal. A matéria fecal é também uma fonte de microrganismos resistentes a antimicrobianos e contribui para a sua disseminação e dos seus genes de resistência no ambiente e entre as comunidades microbianas comensais e microrganismos patogénicos humanos e animais. A qualidade microbiológica da água é monitorizada recorrendo à utilização de bioindicadores como Escherichia coli, enterococos e microrganismos totais. O presente estudo apresentou como principal objetivo determinar a prevalência de ESBLs e AmpCs e ainda avaliar a prevalência de estirpes de enterococos com resistência à vancomicina (VRE) em águas do rio Douro e da orla costeira da cidade do Porto. As amostragens de água foram realizadas em quatro locais localizados no estuário do rio Douro e orla costeira da cidade do Porto entre o mês de Abril e Julho. A deteção e quantificação dos bioindicadores foram realizadas pelo método de filtração por membrana. A suscetibilidade das estirpes de E. coli e enterococos foi testada pelo método de difusão em disco relativamente a várias classes de antimicrobianos. As contagens microbianas mais elevadas foram determinadas entre Abril e Junho e em amostras de água doce. Foram isoladas 62 estirpes de E. coli e 49 estirpes de enterococos que apresentaram prevalências de resistência a antimicrobianos de 90,3% (56/62) e 83,7% (41/49), respetivamente. As estirpes de E. coli apresentaram altas frequências de resistência à ampicilina (74,2%) e tetraciclina (61,3%). Nestas estirpes verificou-se ainda fenótipos associados a multirresistência a um mínimo de três classes de antimicrobianos em 56,5% (35/62) dos isolados. Verificou-se que as estirpes de enterococos apresentaram altos níveis de resistência à rifampicina (34,7%) e azitromicina (40,8%), detetando-se ainda a manifestação de fenótipo de resistência à vancomicina em 26,5% das estirpes. Observou-se uma prevalência de 36,7% (18/49) de estirpes de enterococos associadas a fenómenos de multirresistência antimicrobiana. Ana Martins vi Os resultados obtidos sugerem que o rio Douro e orla costeira, bem como os ambientes aquáticos, constituem reservatórios de bactérias e genes de resistência a antimicrobianos e possuem um papel preponderante na sua disseminação.

Biochemical and structural characterization of β-lactamases tem-180 and tem-201

With the constant development of new antibiotics, selective pressure is a force to reckon when investigating antibiotic resistance. Although advantageous for medical treatments, it leads to increasing resistance. It is essential to use more potent and toxic antibiotics. Enzymes capable of hydrolyzing antibiotics are among the most common ways of resistance and TEM variants have been detected in several resistant isolates. Due to the rapid evolution of these variants, complex phenotypes have emerged and the need to understand their biological activity becomes crucial. To investigate the biochemical properties of TEM-180 and TEM-201 several computational methodologies have been used, allowing the comprehension of their structure and catalytic activity, which translates into their biological phenotype. In this work we intent to characterize the interface between these proteins and the several antibiotics used as ligands. We performed explicit solvent molecular dynamics (MD) simulations of these complexes and studied a variety of structural and energetic features. The interfacial residues show a distinct behavior when in complex with different antibiotics. Nevertheless, it was possible to identify some common Hot Spots among several complexes – Lys73, Tyr105 and Glu166. The structural changes that occur during the Molecular Dynamic (MD) simulation lead to the conclusion that these variants have an inherent capacity of adapting to the various antibiotics. This capability might be the reason why they can hydrolyze antibiotics that have not been described until now to be degraded by TEM variants. The results obtained with computational and experimental methodologies for the complex with Imipenem have shown that in order to this type of enzymes be able to acylate the antibiotics, they need to be capable to protect the ligand from water molecules.

Extended-spectrum β-lactamases from the North of Portugal in the boundaries to Spain: emergence of high resistance to 4th generation cephalosporins

During the past 15 years, emergence and dissemination of third-generation cephalosporins resistance in nosocomial Enterobacteriaceae became a serious problem worldwide, due to the production of extended-spectrum-β-lactamases (ESBLs). The aim of this study was to investigate among the presence of ESBL-producing enterobacteria among Portuguese clinical isolates nearby Spain, to investigate the antimicrobial susceptibility patterns and to compare the two countries. The β-lactamases genes, blaTEM, blaSHV and blaCTX-M were detected by molecular methods. Among the ESBL-producing isolates it was found extraordinary levels (98.9%) of resistance to the fourth-generation cephalosporin Cefepime. These findings point to the need of reevaluate the definition of ESBL.

Detection of pathogens from periodontal lesions

OBJECTIVE: To comparatively detect A. actinomycetemcomitans and F. nucleatum from periodontal and healthy sites. METHODS: Subgingival clinical samples from 50 periodontitis adult patients and 50 healthy subjects were analyzed. Both organisms were isolated using a trypticase soy agar-bacitracin-vancomycin (TSBV) medium and detected by PCR. Conventional biochemical tests were used for bacteria identification. RESULTS: A. actinomycetemcomitans and F. nucleatum were isolated in 18% and 20% of the patients, respectively, and in 2% and 24% of healthy subjects. Among A. actinomycetemcomitans isolates, biotype II was the most prevalent. Primer pair AA was 100% sensitive in the detection of A. actinomycetemcomitans from both subject groups. Primers ASH and FU were also 100% sensitive to detect this organism in healthy subject samples. Primer pair FN5047 was more sensitive to detect F. nucleatum in patients or in healthy samples than primer 5059S. Primers ASH and 5059S were more specific in the detection of A. actinomycetemcomitans and F. nucleatum, respectively, in patients and in healthy subject samples. CONCLUSIONS: PCR is an effective tool for detecting periodontal pathogens in subgingival samples, providing a faster and safer diagnostic tool of periodontal diseases. The method's sensitivity and specificity is conditioned by the choice of the set of primers used.

Determination of chitin content in fungal cell wall: an alternative flow cytometric method

The conventional methods used to evaluate chitin content in fungi, such as biochemical assessment of glucosamine release after acid hydrolysis or epifluorescence microscopy, are low throughput, laborious, time-consuming, and cannot evaluate a large number of cells. We developed a flow cytometric assay, efficient, and fast, based on Calcofluor White staining to measure chitin content in yeast cells. A staining index was defined, its value was directly related to chitin amount and taking into consideration the different levels of autofluorecence. Twenty-two Candida spp. and four Cryptococcus neoformans clinical isolates with distinct susceptibility profiles to caspofungin were evaluated. Candida albicans clinical isolate SC5314, and isogenic strains with deletions in chitin synthase 3 (chs3Δ/chs3Δ) and genes encoding predicted Glycosyl Phosphatidyl Inositol (GPI)-anchored proteins (pga31Δ/Δ and pga62Δ/Δ), were used as controls. As expected, the wild-type strain displayed a significant higher chitin content (P < 0.001) than chs3Δ/chs3Δ and pga31Δ/Δ especially in the presence of caspofungin. Ca. parapsilosis, Ca. tropicalis, and Ca. albicans showed higher cell wall chitin content. Although no relationship between chitin content and antifungal drug susceptibility phenotype was found, an association was established between the paradoxical growth effect in the presence of high caspofungin concentrations and the chitin content. This novel flow cytometry protocol revealed to be a simple and reliable assay to estimate cell wall chitin content of fungi.

Diversidade e prospecção de fungos endofíticos de Begonia spp. encontradas na Mata Atlântica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)