Mechanismen der Progenitorzell-induzierten Gefäßneubildung und myokardialen Funktionsverbesserung

Entscheidend für die Sauerstoffversorgung im ischämischen Gewebe ist die Bildung von Blutgefäßen. Dieser Vorgang findet im erwachsenen Organismus in Form von Arteriogenese, Angiogenese und Vaskulogenese statt. Die Entdeckung, dass endotheliale Progenitorzellen (EPC) aus dem Knochenmark mobilisiert werden können, um sich im Ischämiegebiet an der Bildung neuer Kapillaren zu beteiligen, eröffnet einen vollkommen neuen therapeutischen Ansatz. In der hier vorliegenden Arbeit konnte in drei unterschiedlichen Tiermodellen, dem Matrigelmodell, dem Hinterlaufischämiemodell und dem Infarktmodell der Nacktmaus gezeigt werden, dass eine Zelltherapie mit EPC die Neovaskularisation steigert und zu einer myokardialen Funktionsverbesserung beiträgt. Der entscheidende Beitrag der Arbeit liegt jedoch in der Erforschung des Zeitraums der Wirkung der Stammzelltherapie. In allen drei Tiermodellen konnte durch ein spezifisches Abtöten der mit der viralen Thymidinkinase (TK) transduzierten EPC der positive Effekt auf die Neovaskularisation gestoppt werden. Im Herzinfarktmodell der Nacktmaus kam es sogar zu einer signifikanten Verschlechterung der Herzfunktion sowie zu einer Vergrößerung des Infarktareals. Dieser Effekt war durch Apoptose der Zellen in der dritten und vierten Woche nach Infarkt und Zellinfusion zu beobachten. Somit besitzen EPC nicht nur eine Rolle in der initialen Freisetzung von Zytokinen, sondern tragen auch langfristig zur Aufrechterhaltung des zelltherapeutischen Effektes bei. Ob hierfür allein der Mechanismus der Differenzierung verantwortlich ist, bleibt in weiteren Untersuchungen abzuklären. Denkbar wäre auch eine Beeinflussung des Remodeling über parakrine Langzeiteffekte. Im zweiten Teil der Doktorarbeit wurde versucht, das eingeschränkte zelltherapeutische Potential von Progenitorzellen von Patienten mit „Koronarer Herzkrankheit“ (KHK) und ischämischer Kardiomyopathie mit Hilfe zweier eNOSTranskriptionsverstärker, „eNOS-enhancer“, zu verbessern. Im Matrigelmodell der Maus konnten wir eine Verbesserung des Neovaskularisationspotentials von Knochenmarkszellen (BMC) von Patienten nach Präinkubation mit dem eNOS-enhancer nachweisen. Auch im Myokardinfarktmodell der Maus konnten eine Verbesserung der Herzfunktion und eine Reduktion der Infarktgröße beobachtet werden. Beim direkten Vergleich der beiden eNOS-enhancer konnte kein Unterschied gefunden werden. Zusammenfassend leistet die hier vorliegende Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis für die Bedeutung von Progenitorzellen im Rahmen der Stammzelltherapie nach Myokardinfarkt. Ferner wurde die Möglichkeit aufgezeigt, durch gezielte Beeinflussung der Progenitorzellen ihr therapeutisches Potential signifikant zu steigern.

Valutazione del ruolo dell'espressione di IRS-1 nel differenziamento osteoblastico di cellule di osteosarcoma ed MSCs

L’osteosarcoma (OS) è il tumore primitivo dell’osso più comune in età pediatrica e adolescenziale. L’OS è stato recentemente riconsiderato come una patologia da de-differenziamento, legata all’interruzione del processo cui vanno incontro i precursori osteoblastici, quali le cellule staminali mesenchimali (MSCs), per trasformarsi in osteoblasti maturi. Il sistema IGF è coinvolto nella regolazione della proliferazione e del differenziamento di cellule di OS. IRS-1 è un mediatore critico di tale via di segnalazione e il suo livello di espressione modula il differenziamento di cellule ematopoietiche. Lo scopo di questa tesi è stato quello di definire il ruolo di IRS-1 nel differenziamento osteoblastico di MSCs e cellule di OS. Il potenziale differenziativo di cellule di OS umano e murino e di MSCs derivate da midollo osseo è stato valutato tramite Alizarin Red staining e Real Time-PCR. Dai dati ottenuti è emerso come i livelli di espressione di IRS-1 diminuiscano durante il differenziamento osteoblastico. Conseguentemente, i livelli di espressione di IRS-1 sono stati manipolati utilizzando shRNA per down-regolare l’espressione della proteina o un plasmide per sovra-esprimerla. Sia la down-regolazione sia la sovra-espressione di IRS-1 hanno inibito il differenziamento osteoblastico delle linee cellulari considerate. Allo scopo di valutare il contributo di IRS-1 nella via di segnalazione di IGF-1R è stato utilizzato l’inibitore di tale recettore, αIR-3. Anche in questo caso è stata osservata una riduzione della capacità differenziativa. L’inibitore del proteasoma MG-132 ha portato ad un aumento dei livelli di IRS-1, portando nuovamente all’inibizione del differenziamento osteoblastico e suggerendo che l’ubiquitinazione di questa proteina potrebbe avere un ruolo importante nel mantenimento di appropriati livelli di espressione di IRS-1. I risultati ottenuti indicano la criticità dei livelli di espressione di IRS-1 nella determinazione della capacità differenziativa sia di cellule di OS umano e murino, sia delle MSCs.

Evaluation der Leukämie-Reaktivität von PRAME- und p53-spezifischen T-Zellen bei lymphohämatopoetischen Neoplasien im Rahmen einer adoptiven Immuntherapie

Der Transplantat-gegen-Leukämie (GVL) Effekt als immuntherapeutisches Mittel bei der allogenen hämatopoetischen Stammzell Transplantation (HSZT) ist hauptsächlich durch Spender Lymphozyten vermittelt, welche hämatopoetische Minor-Histokompatibilitäts Antigene bzw. Leukämie-assoziierte Antigene (z. B.: PRAME, p53) erkennen. Der adoptive Transfer von Leukämie-spezifischen T-Zellen kann den GVL-Effekt, ohne ein Auftreten einer Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung (GVHD), steigern. Unter Verwendung von HLA-A2 und human CD8 transgenen Mäusen (CD8yCyA2Kb) konnten in dieser Arbeit PRAME spezifische CD8+ zytotoxischen T-Zellen generiert werden. Diese zytotoxischen CD8+ T-Zellen zeigten in Chromfreisetzungsuntersuchungen lytische Aktivität gegen eine Vielzahl von Zelllinien, die PRAME endogen prozessieren sowie gegen das spezifische PRAME-Peptid. Des Weiteren wurden die hier generierten T-Zellen auf ihre zytotoxische Aktivität gegen akute myeloische Leukämie Blasten hin untersucht, und diese Untersuchungen zeigten AML-Reaktivität der PRAME-spezifischen sowie der als Vergleich genutzten p53- und HLA-A2-spezifischen T-Zellen. Das Potenzial der PRAME-spezifischen ZTL die GVL-Immunität in vivo zu erhöhen ohne das Vorkommen einer GVHD wurde in einem Tumor-Protektions-Model unter der Nutzung von NOD/SCIDgcnull Mäusen untersucht. Die PRA100- bzw. p53-ZTL wurden adoptiv in NOD/SCIDgcnull Rezipienten transferiert und gleichzeitig wurden die Tiere mit PRAME-, oder p53-exprimierende Tumorzelllinien inokuliert. Die Reduktion des Tumorwachstums bestätigte die Spezifität der T-Zellen auch in vivo. In weiteren in vivo Experimenten wurden NOD/SCIDgcnull Mäuse mit AML-Blasten rekonstituiert. Durch die Applikation von nur CD34 positiven Zellen aus einer AML-Probe, oder einer CD56 depletierten Probe, konnten Rekonstitutionen in 95 % aller Versuche erfolgreich beendet werden. Wurde eine Rekonstitution mittels PCR- und FACS-Analysen diagnostiziert, so folgten mehrere Applikationen der PRAME- oder p53-spezifischen ZTL. In diesen Untersuchungen konnten wir in einem therapeutischen AML-in vivo-Modell zeigen, dass die in diesen Untersuchungen generierten/verwandten ZTL in der Lage sind AML-Blasten in vivo zu bekämpfen und so die leukämische Last der Tiere im Blut sowie in der Milz auf unter 1 % zu regulieren. Der prozentuale Anteil humaner AML Zellen im Knochenmark konnte deutlich gesenkt werden (< 10 %). Zusammenfassend sind die von uns generierten PRAME-spezifischen T-Zellen in der Lage, in vitro und auch in vivo, endogen prozessiertes Protein auf Zelllinien und AML-Blasten zu erkennen und zu lysieren. Auch die p53-ZTL, welche als eine weitere Antigen-spezifische ZTL-Population in vivo getestet wurden, zeigten GVL-Effekte. Die Kenntnis von Tumor- bzw. Leukämie assoziierten Antigenen und die daraus erwachsene Möglichkeit der Generierung krankheitsspezifischer ZTL bietet die Grundlage für eine spezifische Immuntherapie maligner Erkrankungen.

Therapeutic vaccination for chronic hepatitis B in the Trimera mouse model

Therapeutic vaccination for chronic hepatitis B in the Trimera mouse modelrnRaja Vuyyuru and Wulf O. BöcherrnHepatitis B is a liver disease caused by Hepatitis B virus (HBV). It ranges in severity from a mild illness, lasting a few weeks (acute), to a serious long-term (chronic) illness that can lead either to liver disease or liver cancer. Acute infection is self limiting in most adults, resulting in clearance of virus from blood and liver and the development of lasting immunity. However 5% of acutely infected patients do not resolve primary HBV infection, leading to chronic infection with persistent viral replication in the liver. The strength of the initial antiviral immune response elicited to Hepatitis B determines the subsequent clinical outcome. A strong and broad T cell response leads to spontaneous resolution. Conversely, a weak T cell response favours viral persistence and establishment of chronic disease. While treatments using interferon-alpha or nucleos(t)ide analogues can reduce disease progression, they rarely lead to complete recovery. The lack of a suitable small animal model hampered efforts to understand the mechanisms responsible for immune failure in these chronic patients.rnIn current study we used Trimera mice to study the efficacy of potential vaccine candidates using HBV loaded dendritic cells in HBV chronic infection in vivo. The Trimera mouse model is based on Balb/c mice implanted with SCID mouse bone marrow and human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from HBV patients, and thus contains the immune system of the donor including their HBV associated T cell defect.rnIn our present study, strong HBV specific CD4+ and CD8+ T cell responses were enhanced by therapeutic vaccination in chronic HBV patients. These T cell responses occurred independently of either the course of the disease or the strength of their underlying HBV specific T cell failure. These findings indicate that the Trimera mouse model represents a novel experimental tool for evaluating potential anti-HBV immunotherapeutic agents. This in vivo data indicated that both the HBV specific CD4+ cell and CD8+ responses were elicited in the periphery. These HBV specific T cells proliferated and secreted cytokines upon restimulation in Trimera mice. The observation that these HBV specific T cells are not detectable directly ex vivo indicates that they must be immune tolerant or present at a very low frequency in situ. HBV specific T cell responses were suppressed in Trimera mice under viremic conditions, suggesting that viral factors might be directly involved in tolerizing or silencing antiviral T cell responses. Thus, combination of an effective vaccine with antiviral treatment to reduce viremia might be a more effective therapeutic strategy for the future. Such approaches should be tested in Trimera mice generated in HBV or HBs expressing transgenic mice before conducting clinical trials.rn

SMO inhibitor specifically targets the Hedgehog Pathway and reverts the drug-resistance of Leukemic Stem Cells

Abnormal Hedgehog signaling is associated with human malignancies. Smo, a key player of that signaling, is the most suitable target to inhibit this pathway. To this aim several molecules, antagonists of Smo, have been synthesized, and some of them have started the phase I in clinical trials. Our hospital participated to one of these studies which investigated the oral administration of a new selective inhibitor of Smo (SMOi). To evaluate ex vivo SMOi efficacy and to identify new potential clinical biomarkers of responsiveness, we separated bone marrow CD34+ cells from 5 acute myeloid leukemia (AML), 1 myelofibrosis (MF), 2 blastic phases chronic myeloid leukemia (CML) patients treated with SMOi by immunomagnetic separation, and we analysed their gene expression profile using Affimetrix HG-U133 Plus 2.0 platform. This analysis, showed differential expression after 28 days start of therapy (p-value ≤ 0.05) of 1,197 genes in CML patients and 589 genes in AML patients. This differential expression is related to Hedgehog pathway with a p-value = 0.003 in CML patients and with a p-value = 0.0002 in AML patients, suggesting that SMOi targets specifically this pathway. Among the genes differentially expressed we observed strong up-regulation of Gas1 and Kif27 genes, which may work as biomarkers of responsiveness of SMOi treatment in CML CD34+ cells whereas Hedgehog target genes (such as Smo, Gli1, Gli2, Gli3), Bcl2 and Abca2 were down-regulated, in both AML and CML CD34+ cells. It has been reported that Bcl-2 expression could be correlated with cancer therapy resistance and that Hedgehog signaling modulate ATP-binding (ABC) cassette transporters, whose expression has been correlated with chemoresistance. Moreover we confirmed that in vitro SMOi treatment targets Hedgehog pathway, down-regulate ABC transporters, Abcg2 and Abcb1 genes, and in combination with tyrosine kinase inhibitors (TKIs) could revert the chemoresistance mechanism in K562 TKIs-resistant cell line.

Die Rolle der Mastzelle bei der Entstehung einer allergischen Atemwegserkrankung

In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der Mastzelle und deren Mediatoren für die Entstehung einer allergischen Atemwegsentzündung untersucht. Anhand von zwei mastzelldefizienten Mausstämmen (C57BL/6-KitWsh/Wsh und WBB6FI-KitW/Wv), konnte gezeigt werden, dass Mastzellen an der Entstehung einer allergischen Entzündung und Atemwegsüberempfindlichkeit beteiligt sind. Durch die Rekonstitution von mastzelldefizienten Tieren mit aus Knochenmark gewonnenen Mastzellen (BMMC) von Wildtyp-Spendern konnte die wichtige Funktion der Mastzelle in diesem Model bestätigt werden. Überdies konnte durch die Rekonstitution mit TNF-defizienten BMMC eine wichtige Rolle für diesen mastzellproduzierten Mediator im allergischen Modell demonstriert werden. Weiterhin konnte die Arbeit zeigen, dass Mastzellen wichtig für die Migration von antigenbeladenen Dendritischen Zellen aus der Lunge in die regionalen Lymphknoten sind. Dieses stellt einen wichtigen Schritt für die Ausbildung einer lokalen allergischen Antwort dar. Im Gegensatz dazu war die Entstehung einer allergischen Atemwegserkrankung nach Transfer von in vitro generierten DC und Allergenprovokation nicht mastzellabhängig. Diese Ergebnisse zeigen, dass es auf die Wahl des Sensibilisierungs- und Provokationsmodels ankommt, um mastzellspezifische Effekte zu demonstrieren. Die vorliegende Arbeit zeigt die wichtige Rolle der Mastzelle und von mastzellproduziertem TNF bei der Ausbildung einer allergischen Entzündung der Atemwege. Die Mastzelle und deren Mediatoren stellen somit mögliche Ziele für die therapeutische Behandlung der allergischen Entzündung der Atemwege dar.

Die Rolle des Fibronektins bei der Entstehung und dem Wachstum von Tumoren

Diese Arbeit befasst sich mit der Rolle des Fibronektins für die Entstehung und des Wachstums von Knochenmetastasen. rnrnTumorzellspezifische Faktoren bereiten entfernte Gewebe auf die Besiedelung durch disseminierte Tumorzellen vor. Dabei wird Fibronektin im Bereich der prämetastatischen Nische vermehrt gebildet. Dies führte zu der Annahme, dass Fibronektin eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Tumoren einnimmt. Um die Bedeutung des Fibronektins bezüglich des Metastasierungsprozesses näher zu charakterisieren, wurde dieses im Bereich der vaskulären Nische über das Cre/loxP-System ausgeschaltet. Die Inaktivierung von zirkulierendem Fibronektin und Knochenmarks-Fibronektin in vivo hatte ein verlangsamtes Tumorwachstum zur Folge, welches auf eine um 22% verminderte Angiogenese zurückzuführen war. Im Gegensatz dazu beeinträchtigte die Ausschaltung des Osteoblasten-Fibronektins lediglich die frühen Entwicklungsstadien der Tumore. Diese Beobachtungen könnten einerseits mit der eingeschränkten Funktionsweise der Osteoblasten in Abwesenheit von Fibronektin erklärt werden, andererseits könnte der Einfluss auf das Fehlen osteoblastenspezifischer Fibronektin-Isoformen zurückgeführt werden, die die Metastasierung, Zelladhäsion, Proliferation und Motilität von Tumorzellen erhöhen. rnrnDie Deletion des Tumorzell-Fibronektins hatte eine durchschnittlich um 60% reduzierte Anzahl gebildeter Metastasen, ein eingeschränktes Tumorwachstum, hervorgerufen durch eine um 37% verminderte Blutgefäßanzahl, und letztendlich eine dreifache Verlängerung der mittleren Überlebensraten zur Folge. Die kombinierte Ausschaltung von lokalem Fibronektin und Tumorzell-Fibronektin vermochte den Einfluss auf die Etablierung und das Wachstum der Tumore zu verstärken. rnrnEin Drittel der Tiere, denen Metastasen induziert wurden, zeigten eine spontane Rückbildung der Tumore, ohne dass eine medizinische Intervention erfolgte. Dabei wurde zwischen einer kompletten Regression, bei der eine vollständige Rückbildung aller Tumore beobachtet werden konnte, und einer partiellen Regression, von der nur einzelne Tumore betroffen waren, unterschieden. Die spontane Regression war altersabhängig und trat 8-17 Wochen im Anschluss an die Applikation der Tumorzellen auf. Die vollständige Rückbildung der osteolytischen Knochenläsionen war mit dem Heilungsprozess des Knochengewebes verbunden, der sich in einer Verdichtung der Knochensubstanz äußerte. Erste Ergebnisse lieferten Hinweise darauf, dass die spontane Tumorregression auf eine mögliche Beteiligung von Granulozyten zurückzuführen war.rnrnZusammenfassend zeigten unsere Untersuchungen, dass sowohl Fibronektin der Mikroumgebung als auch Tumorzell-Fibronektin die Entwicklung und das Wachstum von Tumoren beeinträchtigte. Diese Arbeit lieferte erste Hinweise auf die Existenz eines sehr effektiven Mechanismus, der in Zusammenhang mit Fibronektin steht und dazu in der Lage ist, Tumorzellen selbst bei fortgeschrittenen Krebserkrankungen zu beseitigen. rn

Studio di fase I sulla reinfusione intraepatica di cellule staminali CD 133+ altamente purificate nei pazienti con malattia epatica terminale

Numerose evidenze sperimentali hanno dimostrato il contributo delle cellule staminali di derivazione midollare nei processi di rigenerazione epatica dopo danno tissutale. E’ cresciuto pertanto l’interesse sul loro potenziale impiego in pazienti con cirrosi. Questo studio si propone di valutare la fattibilità e la sicurezza della reinfusione intraepatica di cellule staminali midollari autologhe CD133+ in 12 pazienti con insufficienza epatica terminale definita da un punteggio di Model for End Stage of Liver Disease (MELD) compreso tra 17 e 25. L’efficacia in termini di funzionalità epatica rappresenta un obiettivo secondario. Previa mobilizzazione nel sangue periferico mediante somministrazione di granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) alla dose di 7,5 mcg/Kg/b.i.d. e raccolta per leucoaferesi, le cellule CD133+ altamente purificate vengono reinfuse in arteria epatica a partire da 5x104/Kg fino a 1x106/kg. Nei tre giorni successivi si somministra G-CSF per favorire l’espansione e l’attecchimento delle cellule. Durante la mobilizzazione, la reinfusione e nei 12 mesi successivi i pazienti sono sottoposti a periodici controlli clinici, laboratoristici e strumentali e ad attenta valutazione di effetti collaterali. Lo studio è tuttora in corso e ad oggi, 11 pazienti sono stati sottoposti a reinfusione e 4 hanno completato i 12 mesi di follow-up. Il G-CSF è stato ben tollerato e ha consentito di ottenere una buona espansione cellulare. Dopo la reinfusione sono stati documentati un ematoma inguinale e due episodi transitori di encefalopatia portosistemica. Durante il follow-up 4 pazienti sono stati trapiantati e 2 sono morti. Non è stata osservata alcuna modificazione significativa degli indici di funzione epatica. Questi risultati preliminari confermano la possibilità di mobilizzare e reinfondere un numero adeguato di cellule staminali di derivazione midollare in pazienti con malattia epatica in stadio terminale.

In vivo consequences of AML1-ETO fusion protein expression for hematopoiesis

The t(8;21) (q22;q22) translocation fusing the ETO (also known as MTG8) gene on human chromosome 8 with the AML1 (also called Runx1 or CBFα) gene on chromosome 21 is one of the most common genetic aberrations found in acute myeloid leukemia (AML). This chromosomal translocation occurs in 12 % of de novo AML cases and in up to 40 % of the AML-M2 subtype of the French-American-British classification. To date, the in vivo function of aberrant AML1-ETO fusion protein expression has been investigated by several groups. However, in these studies, controversial results were reported and some key issues remain unknown. Importantly, the consequences of aberrant AML1-ETO expression for self-renewing hematopoietic stem cells (HSCs), multipotent hematopoietic progenitors (MPPs) and lineage-restricted precursors are not known. rn The aim of this thesis was to develop a novel experimental AML1-ETO in vivo model that (i) overcomes the current lack of insight into the pre-leukemic condition of t(8;21)-associated AML, (ii) clarifies the in vivo consequences of AML1-ETO for HSCs, MPPs, progenitors and more mature blood cells and (iii) generates an improved mouse model suitable for mirroring the human condition. For this purpose, a conditional tet on/off mouse model expressing the AML1-ETO fusion protein from the ROSA26 (R26) locus was generated. rn Aberrant AML1-ETO activation in compound ROSA26/tetOAML1-ETO (R26/AE) mice caused high rates of mortality, an overall disruption of hematopoietic organs and a profound alteration of hematopoiesis. However, since the generalized activity of the R26 locus did not recapitulate the leukemic condition found in human patients, it was important to restrict AML1-ETO expression to blood cell lineages. Therefore, bone marrow cells from non-induced R26/AE mice were adoptively transplanted into sublethal irradiated RAG2-/- recipient mice. First signs of phenotypical differences between AML1-ETO-expressing and control mice were observed after eight to nine months of transgene induction. AML1-ETO-expressing mice showed profound changes in hematopoietic organs accompanied by manifest extramedullary hematopoiesis. In addition, a block in early erythropoiesis, B- and T-cell maturation was observed and granulopoiesis was significantly enhanced. Most interestingly, conditional activation of AML1-ETO in chimeric mice did not increase HSCs, MPPs, common lymphoid precursors (CLPs), common myeloid progenitors (CMPs) and megakaryocyte-erythrocyte progenitors (MEPs) but promoted the selective amplification of granulocyte-macrophage progenitors (GMPs). rn The results of this thesis provide clear experimental evidence how aberrant AML1-ETO modulates the developmental properties of normal hematopoiesis and establishes for the first time that AML1-ETO does not increase HSCs, MPPs and common lineage-restricted progenitor pools but specifically amplifies GMPs. The here presented mouse model not only clarifies the role of aberrant AML1-ETO for shaping hematopoietic development but in addition has strong implications for future therapeutic strategies and will be an excellent pre-clinical tool for developing and testing new approaches to treat and eventually cure AML.rn

Identifizierung und Überexpression immunregulatorischer Moleküle in dendritischen Zellen zur gezielten Modulation ihrer T-Zell-stimulierenden Eigenschaften

Die Modifizierung von dendritischen Zellen (DCs) in vitro erfolgt meist durch eine Behandlung mit Mediatoren, die den Aktivierungszustand sowie die T-Zell-polarisierenden DC-Eigenschaften verändern. In dieser Doktorarbeit sollten zunächst mediatorinduzierte tolerogene Schlüsselmoleküle identifiziert werden. Als Modell wurden murine Knochenmarkszellen unter DC-differenzierenden Bedingungen mit dem Glucocorticoid Dexamethason (DEX) behandelt. Die generierten DEX-APCs (antigenpräsentierende Zellen) zeigten einen protolerogenen, weitgehend maturierungsresistenten Phänotyp und eine gesteigerte Expression toleranzassoziierter Moleküle. DEX-APCs induzierten in vitro aus CD25+ depletierten allogenen T-Zellen de novo CD4+ und CD8+ regulatorische T-Zellen (Tregs). Basierend auf diesen Ergebnissen und Literaturstudien wurden protolerogene Moleküle für eine Überexpression in DCs selektiert. Da DCs non-viral kaum transfizierbar sind, wurde die lentivirale Transduktion von DCs optimiert, wodurch Effizienzen bis zu 95% erreicht werden konnten. Der mit der Transduktion assoziierte physikalische Stress resultierte in einer partiellen DC-Aktivierung. Trotzdessen zeigten DCs, die die Zytokine IL-10 oder IL-21 überexprimierten, einen protolerogenen Phänotyp und induzierten in vitro Tregs. Beide DC-Populationen reduzierten im therapeutischen Ansatz im murinen Krankheitsmodell der Kontaktallergie haptenspezifisch die Ohrschwellungsreaktion. Auch DCs, die andere Zytokine, intrazelluläre Proteine oder Oberflächenrezeptoren mit protolerogenen Eigenschaften überexprimierten, wiesen eine jeweils spezifische Genexpressionssignatur auf. Diese DC-Populationen waren zumeist durch eine verminderte allogene T-Zell-Aktivierungskapazität gekennzeichnet und veränderten die Th1-/Th2-Zytokinmuster in kokultivierten T-Zellen.

Valutazione dell'efficacia dell'infusione intraepatica di cellule staminali (SC) autologhe CD133+ in pazienti affetti da cirrosi ed insufficienza epatica di grado avanzato

Numerose evidenze sperimentali hanno dimostrato il contributo delle cellule staminali (SC) di derivazione midollare nei processi di rigenerazione epatica dopo danno tissutale. E’ cresciuto pertanto l’interesse sul loro potenziale impiego in pazienti con cirrosi. Questo studio si proponeva di valutare la fattibilità e la sicurezza della reinfusione intraepatica di cellule staminali midollari autologhe CD133+ in 12 pazienti con insufficienza epatica terminale. Previa mobilizzazione nel sangue periferico mediante somministrazione di granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) alla dose di 7,5 mcg/Kg/b.i.d. e raccolta per leucoaferesi (solo se la concentrazione di CD133 + SC era > 8/μL), le cellule CD133+ altamente purificate sono state reinfuse in arteria epatica a partire da 5x104/Kg fino a 1x106/kg. Nei tre giorni successivi è stato somministrato G-CSF per favorire l’espansione e l’attecchimento delle cellule. Durante la fase della mobilizzazione e quella della reinfusione sono stati eseguiti saggi biologici quali: caratterizzazione fenotipica delle SC circolanti, saggi clonogenici, valutazione della concentrazione sierica del Hepatocyte Growth Factor (HGF), Stromal-Derived Factor-1 (SDF-1) ed il Vascular-Endotelial Growth Factor (VEGF) e caratterizzazione fenotipica delle CD133+SC purificate. Fino ad oggi sono stati reinfusi 12 pazienti. Questi dati preliminari suggeriscono che è possibile mobilizzare e reinfondere un numero considerevole di SC autologhe CD133+ altamente purificate in pazienti con ESLD . Gli studi biologici mostrano che: il numero di progenitori ematopoietici ed endoteliali circolanti è aumentato dopo il trattamento con G–CSF; le SCs CD133+ altamente purificato esprimono marcatori emopoietici ed endoteliali; la concentrazione sierica di HGF, SDF-1, VEGF e la capacità clonogenica di progenitori emopoietici sono aumentati durante la mobilitazione e nelle fasi di reinfusione; il potenziale clonogenico dei progenitori endoteliali mostra espressione variabile.

Leucemia Acuta Mieloide e signaling purinergico: possibili sviluppi terapeutici

I nucleotidi trifosfato sono, dal punto di vista evoluzionistico, tra le molecole più antiche e conservate tra le specie. Oltre al ruolo che ricoprono nella sintesi degli acidi nucleici e nel metabolismo energetico della cellula, negli ultimi anni è emerso sempre di più il loro coinvolgimento nella regolazione di numerose funzioni cellulari. Questi importanti mediatori cellulari sono presenti nel microambiente e cambiamenti nella loro concentrazione extracellulare possono modulare la funzionalità cellulare. I nucleotidi trifosfato ATP e UTP, presenti nel microambiente midollare, sono dei potenti stimolatori dei progenitori emopoietici. Essi stimolano la proliferazione e l’attecchimento delle cellule staminali emopoietiche, così come la loro capacità migratoria, attraverso l’attivazione di specifici recettori di membrana, i recettori purinergici (P2R). In questo studio abbiamo dimostrato che ATP e UTP esercitano un effetto opposto sul compartimento staminale leucemico di leucemia acuta mieloide (LAM). Abbiamo dimostrato che le cellule leucemiche esprimono i recettori P2 funzionalmente attivi. Studi di microarray hanno evidenziato che, a differenza di ciò che avviene nelle CD34+, la stimolazione di cellule leucemiche con ATP induce la down-regolazione dei geni coinvolti nella proliferazione e nella migrazione, mentre up-regola geni inibitori del ciclo cellulare. Abbiamo poi confermato a livello funzionale, mediante test in vitro, gli effetti osservati a livello molecolare. Studi di inibizione farmacologica, ci hanno permesso di capire che l’attività inibitoria dell’ATP sulla proliferazione si esplica attraverso l’attivazione del recettore P2X7, mentre i sottotipi recettoriali P2 prevalentemente coinvolti nella regolazione della migrazione sono i recettori P2Y2 e P2Y4. Esperimenti di xenotrapianto, hanno evidenziato che l’esposizione ad ATP e UTP sia dei blasti leucemici sia delle cellule staminali leucemiche CD38-CD34+ diminuisce la loro capacità di homing e di engraftment in vivo. Inoltre, il trattamento farmacologico con ATP, di topi ai quali è stata indotta una leucemia umana, ha diminuito lo sviluppo della leucemia in vivo.

Assessing the role of sCYLD and Bcl-3 in immune regulation

CYLD is a deubiquitinating enzyme, which negatively regulates NF-κB signaling by removing Lys63-linked polyubiquitin chains from its substrates. In mice, there are two variants of CYLD: full-length CYLD (FL-CYLD) and its short splice variant sCYLD. sCYLD lacks the NEMO and TRAF2 binding sites and CYLDex7/8 mice, which have been generated in our laboratory, overexpress sCYLD in the absence of the full length transcript. In this thesis, we show that bone marrow-derived macrophages (BMDCs) overexpressing sCYLD display a hyperactive phenotype. They have increased levels of the inflammatory cytokines IL-6 and TNFα, have exaggerated stimulatory capacity and fail to induce tolerance in in vivo experiments. CYLDex7/8 BMDCs have increased levels of nuclear Bcl-3, which we could show to be directly induced by sCYLD expression. NF-κB signaling was markedly upregulated in CYLDex7/8 BMDCs.rnBcl-3 overexpressing BMDCs with normal CYLD expression, however, were not hyperactive, suggesting that Bcl-3 overexpression is not sufficient for causing the observed phenotype. Taken together we propose a model in which the exclusive overexpression of sCYLD with high nuclear levels of Bcl-3 in BMDCs is accompanied by an increased NF-κB activation, resulting in a hyperactive phenotype.rnWe further analyzed macrophages overexpressing sCYLD using the LysMcre CyldFL/FL strain, but could not detect differences in activation marker expression, cytokine secretion or iNOS production. LysMcre CyldFL/FL mice immunized with MOG35-55 peptide showed a more severe course of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), which could not be explained by enhanced levels of MHC class II on CNS-resident macrophages and microglia or increased T cell infiltration.rnMice overexpressing Bcl-3 in T cells develop spontaneous colitis. They have less peripheral memory/effector T cells and less Th1 cells, whereas Th17 numbers are normal. Naïve T cells overexpressing Bcl-3 show defects in in vitro differentiation to the Th1 or Th17 fate. CD4+ T cells overexpressing Bcl-3 show enhanced survival capacity in in vitro culture, but have a defect in proliferative capacity when stimulated in vitro or when adoptively transferred into lymphopenic hosts.

The role of B cells during acute and latent infections with murine cytomegalovirus and Leishmania major

This thesis focuses on the role of B cells in mCMV and Leishmania major infection. B cells are an essential component of the adaptive immune system and play a key role in the humoral immune response. In mCMV infection we analyzed the influence of B cells on the virus-specific CD8 T cell response, in detail the role of B cells as IL-10 secreting cells, as source of immunoglobulin (Ig) and as antigen presenting cells. In Leishmania major infection we investigated the role of Ig in Th1 and Th2 directed disease.rnWe found in mCMV infection that the B cell secreted IL-10 suppresses effectively the acute virus-specific CD8 T cell response, while the IL-10 secreted by dendritic cell has no obvious effect. Ig has no effect in the acute virus-specific CD8 T cell response, but in memory response Ig is essential. If Ig is missing the CD8 T cell population remains high in memory response 135 days post infection. The complete absence of B cells dramatically reduces the acute virus-specific CD8 T cell response, while B cell reconstitution just partially rescues this dramatic reduction. A comparison of this reduction in a B cell free organism to an organism with depleted dendritic cells gave a similar result. To exclude a malfunction of the CD8 T cells in the B cell deficient mice, the decreased virus-specific CD8 T cell population was confirmed in a B cell depletion model. Further, bone marrow chimeras with a B cell compartment deficient for CD40-/- showed a decrease of the virus-specific response and an involvement of CD40 on B cells. Taken together these results suggest a role for B cells in antigen presentation during mCMV infection.rnFurther we took advantage of the altered mCMV specific CD8 T cell memory response in mice without Ig to investigate the memory inflation of CD8 T cells specific for distinct mCMV specifc peptides. Using a SIINFEKL-presenting virus system, we were able to shorten the time until the memory inflation occurs and show that direct presentation stimulates the memory inflation. rnIn Leishmania major infection, Ig of Th2 balanced BALB/c mice has a central role in preventing a systemic infection, although the ear lesions are smaller in IgMi mice without specific Ig. Here the parasite loads of ears and spleen are elevated, and an IMS-reconstitution does not affect the parasite load. In contrast in Th1 balanced C57BL/6 mice, reconstitution of IgMi mice with serum of either untreated or immunized mice decreased the parasite load of spleen and ear, further IMS treatment reduces the size of the spleen and the cytokine-levels of IL-10, IL-4, IL-2 and IFN-γ to a level comparable to wt mice. rn

Generierung und Charakterisierung tolerogener muriner dendritischer Zellen

Mechanismen der zentralen und der peripheren Toleranz schützen den Körper vor Immunreaktionen gegen körpereigenes Gewebe oder gegen harmlose Umweltantigene. An der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz sind tolerogene Dendritische Zellen (DC) beteiligt. Tolerogene DC können in vitro u.a. mit Hilfe von immunsuppressiven und antiinflammatorischen Substanzen, aber auch durch virale Transduktionen, die zur Denovo- oder Überexpression toleranzassoziierter Moleküle führen, generiert werden. rnDa die Wirkung einiger immunmodulatorischer Substanzen über den intrazellulären sekundären Botenstoff cAMP vermittelt wird, sollte getestet werden, welchen Einfluss eine direkte Erhöhung des intrazellulären cAMP-Niveaus mittels Dibutyryl-cyclo-Adenosin-3´,5´-Mono-Phoshat (db-cAMP) auf die phänotypischen und funktionellen Eigenschaften von BM-DC („bone marrow derived dendritic cells“) hat.rnIm Vergleich zu unbehandelten BM-DC wiesen db-cAMP-DC ein vermindertes T-Zell-Stimulierungs-potenzial auf. Dieses verminderte T-Zell-Stimulierungspotenzial wird teilweise über die Proteinkinase A, nicht aber über Cyclooxygenase-2 (Cox-2) vermittelt. rnAnhand der FACS-Analyse mit DC- und MDSC- („myeloid derived suppressor cells“) spezifischen Markern konnte gezeigt werden, dass es sich bei den db-cAMP-DC um CD11c-positive DC mit einer vergleichsweise niedrigen Expression von MHCII und kostimulatorischen Oberflächenmolekülen handelt. Des Weiteren zeigte sich, dass sie verglichen mit BM-DC eine vermehrte mRNA-Expression der koinhibitorischen Moleküle B7-H1 und LIGHT und der toleranzassoziierten Moleküle FcγRIIB, HO-1 und Cox-2 aufweisen. Mittels ELISA konnte eine gesteigerte Expression der HO-1- und eine moderat gesteigerte PGE2-Synthese beobachtet werden. PGE2 wird mit Hilfe der Cox-2 aus Arachidonsäure gebildet.rnIm Gegensatz zu BM-DC wiesen db-cAMP-DC in beiden Reifungsstadien ein verändertes Zytokinprofil auf: Auf mRNA-Ebene zeigte sich, dass db-cAMP-DC verglichen mit BM-DC vermehrt IL-1RA und IL-10 exprimieren. Dieser Unterschied konnte für IL-10 auch mittels ELISA bestätigt werden. In den Kulturüberständen der stimulierten db-cAMP-DC konnte, im Gegensatz zu denen stimulierter BM-DC, kaum bioaktives IL-12 nachgewiesen werden. rnDb-cAMP-DC induzierten des Weiteren in kokultivierten allogenen T-Zellen ein differenzielles Zytokinprofil: Sie förderten die INFγ- und IL-17-Sezernierung durch T-Zellen, während die IL-5-Sezernierung geringer war, wenn T-Zellen mit stimulierten db-cAMP-DC kokultiviert wurden. Db-cAMP-DC hatten hingegen keinen Einfluss auf die IL-10-Produktion. Außerdem führte eine Kokultur der db-cAMP-DC mit allogenen T-Zellen nicht zu einer gesteigerten Induktion von FoxP3+ Treg. rnIn einem zweiten Ansatz sollte getestet werden ob es möglich ist die murine DC-Linie SP37A3 lentiviral mit dem toleranzassoziierten Oberflächenprotein B7-H3 zu transduzieren. Dies ist von Interesse, da die SP37A3-Zellen einige Vorteile gegenüber BM-DC aufweisen, wie z.B. ihren homogeneren Phänotyp und die Möglichkeit sie in einer Expansionskultur zu halten.rnEs konnte gezeigt werden, dass SP37A3-Zellen als Modell für myeloide DC für die Transduktion mit lentiviralen Partikeln geeignet sind. Hierbei zeigte es sich aber, dass darauf geachtet werden muss, mit konzentriertem Virus zu arbeiten und dass die Reportergen-Expression der Zielzellen über mehr als 3 Tage (mindestens 7 Tage) untersucht werden muss. Nur so kann eine eventuell auftretende Pseudotransduktion erkannt und verhindert werden. Ab einer MOI („multiplicity of infection“) von 50 konnte in SP37A3-Zellen eine Transgen-Expression nachgewiesen werden.rn