Indagine sul coinvolgimento del sistema neuropeptidergico nocicettina/recettore NOP a carico della trasmissione nocicettiva

Oggetto di studio in questa tesi �� stato il ruolo modulatorio svolto dal neuropeptide nocicettina/orfanina FQ a carico della trasmissione nocicettiva. A scopo introduttivo, sono state illustrate le conoscenze attuali sul sistema nocicettina-NOP; sono state descritte le funzioni, la struttura e la distribuzione del recettore NOP, le azioni farmacologiche finora note e la distribuzione della nocicettina stessa al livello del S.N.C. e in periferia. Lo studio �� stato condotto principalmente con due approcci differenti A) E��� stata studiata la capacit�� della nocicettina esogena o di suoi analoghi agonisti e antagonisti, di modificare la trasmissione nocicettiva. B) Sono state studiate le variazioni a carico del sistema endogeno nocicettina/recettore NOP in seguito a trattamenti di tipo farmacologico. A) E��� stata indagata la capacit�� della nocicettina e degli analoghi sintetici [Arg14, Lys15]N/OFQ e UFP-101 di modificare la soglia nocicettiva nel ratto, rilevata con il test del tail-flick, a seguito di somministrazione diretta nello spazio subaracnoideo, in confronto con la nocicettina stessa. La somministrazione intratecale del neuropeptide nocicettina (10 nmol/ratto) ha determinato un innalzamento statisticamente significativo delle latenze di risposta al test del tail-flick. L���analogo [Arg14, Lys15]N/OFQ �� stato somministrato alla dose di 1 nmole/ratto i.t. provocando un innalzamento massimale delle soglie di latenza per tutto il periodo di osservazione, mentre alla dose 0,2 nmoli/ratto i.t ha provocato un effetto antinocicettivo sottomassimale pur dimostrandosi significativo rispetto ai controlli (p < 0,05 vs controlli a tutti i tempi di rilevazione). Il composto antagonista UFP-101 �� risultato capace di antagonizzare l���azione sulla soglia analgesica sia della nocicettina sia dell���analogo [Arg14, Lys15]N/OFQ nel suo dosaggio minore, mentre contro la dose di 1 nmole/ratto i.t ha prodotto solamente una riduzione di effetto. Anche la somministrazione intratecale di MAP-N/OFQ si �� dimostrata in grado di modificare la soglia nocicettiva determinata mediante il test del tail-flick, nel ratto, in modo dose dipendente. differentementeuna seconda somministrazione di MAP-N/OFQ dopo 24 ore, si �� dimostrata totalmente inefficace nel modificare la soglia nocicettiva nei ratti precedentemente trattati, pur permanendo la loro suscettibilit�� all���azione analgesica della morfina, mostrando quindi il rapido sviluppo di tolerance al potente peptide nocicettinergico somministrato per via i.t.. Inoltre l���antagonista UFP-101 oltre ad essere ingrado di antagonizzare l���effetto della MAP-N/OFQ, ha mostrato la capacit�� di ridurre la tolerance sviluppata nei confronti del dendrimero. La somministrazione di MAP-N/OFQ per via i.c.v. ha prodotto variazione della soglia nocicettiva, producendo un innalzamento del volore soglia, dato contrastante con la maggior parte dei dati riguardanti la nocicettina in letteratura. Ha invece replicato l���effetto di antagonismo funzionale nei confronti della morfina, la quale dopo somministrazione di MAP-N/OFQ �� risultata essere incapace di modificare la soglia nocicettiva nel ratto. Tale effetto perdura dopo 24 ore, quando una somministrazione di morfina produce un effetto analgesico inversamente proporzionale alla dose ricevuta di MAP-N/OFQ 24 ore prima. E���stato indagato il possibile ruolo neuromodulatorio del neuropeptide nocicettina esogeno, nell���analgesia prodotta da un farmaco di natura non oppiacea. In tal senso si �� proceduto ad indagare l���eventuale capacit�� della nocicettina esogena, somministrata per via intracerebroventricolare e del suo analogo [Arg14, Lys15]N/OFQ, di antagonizzare l���analgesia prodotta dal farmaco paracetamolo. La nocicettina ha evidenziato la capacit�� di antagonizzare il potere antinocicettivo del paracetamolo fino a bloccarne completamente l���effetto al dosaggio pi�� elevato, mostrando quindi propriet�� antagonista dose-dipendente. Inoltre l���UFP-101, che di per se non altera l���analgesia indotta da paracetamolo, �� ingrado di antagonizzare l���effetto della nocicettina sul paracetamolo in maniera dose-dipendente. Medesimo �� risultato il comportamento dell���analogo della nocicettina, la Arg-Lys nocicettina. B) Sono state indagate le relazioni tra il sistema nocicettina/NOP e le propriet�� farmacologiche di un noto farmaco oppiaceo quale la buprenorfina, le cui peculiari caratteristiche farmacodinamiche sano state recentemente collegate alla sua capacit�� di agire come agonista diretto al recettore NOP. In tal senso si �� proceduto ad osservare l���effetto della somministrazione di buprenorfina sull��� assetto recettoriale di NOP, inseguito ad un trattamento prolungato con somministrazione sottocutanea mediante minipompe osmotiche nel ratto, rilevando successivamente, tramite uno studio di binding, le variazioni della densit�� recettoriale di NOP in alcune aree di interesse per la trasmissione nocicettiva. Sia nell���ippocampo che nel talamo e nella frontal cortex, la somministrazione prolungata di buprenorfina ha causato una riduzione significativa della densit�� recettoriale di NOP. Come ultimo aspetto indagato, al fine di determinare la presenza del neuropeptide nel liquido cerebrospinale e le sue eventuali modificazioni a seguito di manipolazioni farmacologiche e non farmacologiche, �� stata messa a punto una metodica di perfusione dello spazio subaracnoideo nel ratto, che consentisse di ottenere materiale biologico su cui compiere la ricerca e quantificazione della presenza di nocicettina mediante dosaggio radioimmunologico. La perfusione di CSF artificiale arricchito di ione potassio ad una concentrazione pari a 60 mM ha evidenziato la possibilit�� di stimolare la liberazione della nocicettina nel liquido cerebrospinale di ratto, suggerendo quindi una sua provenienza da elementi eccitabili. E��� stato quindi possibile osservare l���andamento dei livelli di peptide a seguito della stimolazione nocicettiva prodotta da due agenti irritanti con caratteristiche differenti, la carragenina e la formalina. La somministrazione sottocutanea di carragenina (100 ��l al 3 %) nella regione subplantare di entrambe le zampe posteriori del ratto non ha determinato alterazioni significative dei livelli di neuropeptide. Invece, la somministrazione di formalina (50 ��l al 5 %), dopo un iniziale periodo di 30 minuti, ha causato un incremento significativo della liberazione di N/OFQ a partire dal terzo intervallo di raccolta seguente la somministrazione della sostanza. Questo rispecchia l���andamento di risposta al formalin test ottenuto anche mediante test di natura differente dagli analgesimetrici (es. comportamentale, elettrofisiologico), in quest���ottica l���aumento di nocicettina pu�� essere interpretato come un evento dovuto alla sensibilizzazione centrale all���effetto pronocicettivo.

Linguaggio e numero: traiettorie evolutive e relazioni tra competenze in bambini con sviluppo tipico e a rischio

Linguaggio e numero rappresentano due aspetti centrali nella storia del genere umano, dal momento che competenze precoci sono gi�� descritte a partire dalla preistoria, accompagnano l���uomo durante la sua esistenza e non sono condivise pienamente da altre specie. I neonati mostrano gi�� delle predisposizioni per gli stimoli linguistici e numerici, queste abilit�� si sviluppano precocemente nei primi anni di vita e accompagnano il bambino durante l���iter scolastico e l���adulto nella vita di tutti i giorni. Linguaggio e numero condividono, quindi, molte caratteristiche e lo studio di tali competenze e delle loro relazioni aggiunge importanti riflessioni alle teorie dello sviluppo. Inoltre lo studio di questi aspetti in popolazioni con sviluppo tipico, atipico e a rischio permette una migliore comprensione della complessit�� dinamica dello sviluppo all���interno di una prospettiva neurocostruttivista interessata ai processi sottostanti e non agli esiti finali. La tesi analizza la letteratura sulle competenze linguistiche (orali: cap. 1; scritte: cap. 2; relazioni: cap. 3), numeriche (sistema numerico approssimativo: cap. 4; sistema numerico esatto: cap. 5; relazioni: cap. 6) e sulle loro relazioni (cap. 7), descrivendo le ricerche che si sono occupate delle popolazioni con sviluppo tipico, atipico e a rischio. In ogni singolo capitolo sono confrontate le competenze linguistiche e numeriche e le loro reciproche relazioni in bambini con sviluppo tipico (nati a termine) e bambini nati pretermine sani, caratterizzati da un���elevata immaturit�� neonatale. I dati sono stati raccolti alla fine della scuola dell���infanzia e dopo due anni di scolarizzazione per comprendere le traiettorie evolutive in due momenti rilevanti di transizione. I risultati emersi hanno aggiunto nuove considerazioni interessanti per i bambini con sviluppo tipico, soprattutto rispetto alle relazioni tra linguaggio e numero che rappresentano un campo non ancora esplorato. I dati emersi con i nati pretermine hanno mostrato che questi bambini non presentano un ritardo cognitivo generalizzato, ma difficolt�� specifiche e relazioni diverse da quelle descritte nello sviluppo tipico, indicando la presenza di una traiettoria che possiamo definire atipica. I risultati ottenuti aggiungono importanti considerazioni teoriche rispetto alle relazioni tra competenze innate ed apprese e tra fasi di acquisizione e di consolidamento delle abilit��. Al tempo stesso emergono importanti indicazioni cliniche per la programmazione di interventi specifici per il recupero delle competenze maggiormente compromesse nei nati pretermine.

3-D reconstruction of the human skeleton during motion

L���analisi del movimento umano ha come obiettivo la descrizione del movimento assoluto e relativo dei segmenti ossei del soggetto e, ove richiesto, dei relativi tessuti molli durante l���esecuzione di esercizi fisici. La bioingegneria mette a disposizione dell���analisi del movimento gli strumenti ed i metodi necessari per una valutazione quantitativa di efficacia, funzione e/o qualit�� del movimento umano, consentendo al clinico l���analisi di aspetti non individuabili con gli esami tradizionali. Tali valutazioni possono essere di ausilio all���analisi clinica di pazienti e, specialmente con riferimento a problemi ortopedici, richiedono una elevata accuratezza e precisione perch�� il loro uso sia valido. Il miglioramento della affidabilit�� dell���analisi del movimento ha quindi un impatto positivo sia sulla metodologia utilizzata, sia sulle ricadute cliniche della stessa. Per perseguire gli obiettivi scientifici descritti, �� necessario effettuare una stima precisa ed accurata della posizione e orientamento nello spazio dei segmenti ossei in esame durante l���esecuzione di un qualsiasi atto motorio. Tale descrizione pu�� essere ottenuta mediante la definizione di un modello della porzione del corpo sotto analisi e la misura di due tipi di informazione: una relativa al movimento ed una alla morfologia. L���obiettivo �� quindi stimare il vettore posizione e la matrice di orientamento necessari a descrivere la collocazione nello spazio virtuale 3D di un osso utilizzando le posizioni di punti, definiti sulla superficie cutanea ottenute attraverso la stereofotogrammetria. Le traiettorie dei marker, cos�� ottenute, vengono utilizzate per la ricostruzione della posizione e dell���orientamento istantaneo di un sistema di assi solidale con il segmento sotto esame (sistema tecnico) (Cappozzo et al. 2005). Tali traiettorie e conseguentemente i sistemi tecnici, sono affetti da due tipi di errore, uno associato allo strumento di misura e l���altro associato alla presenza di tessuti molli interposti tra osso e cute. La propagazione di quest���ultimo ai risultati finali �� molto pi�� distruttiva rispetto a quella dell���errore strumentale che �� facilmente minimizzabile attraverso semplici tecniche di filtraggio (Chiari et al. 2005). In letteratura �� stato evidenziato che l���errore dovuto alla deformabilit�� dei tessuti molli durante l���analisi del movimento umano provoca inaccuratezze tali da mettere a rischio l���utilizzabilit�� dei risultati. A tal proposito Andriacchi scrive: ���attualmente, uno dei fattori critici che rallentano il progresso negli studi del movimento umano �� la misura del movimento scheletrico partendo dai marcatori posti sulla cute��� (Andriacchi et al. 2000). Relativamente alla morfologia, essa pu�� essere acquisita, ad esempio, attraverso l���utilizzazione di tecniche per bioimmagini. Queste vengono fornite con riferimento a sistemi di assi locali in generale diversi dai sistemi tecnici. Per integrare i dati relativi al movimento con i dati morfologici occorre determinare l���operatore che consente la trasformazione tra questi due sistemi di assi (matrice di registrazione) e di conseguenza �� fondamentale l���individuazione di particolari terne di riferimento, dette terne anatomiche. L���identificazione di queste terne richiede la localizzazione sul segmento osseo di particolari punti notevoli, detti repere anatomici, rispetto ad un sistema di riferimento solidale con l���osso sotto esame. Tale operazione prende il nome di calibrazione anatomica. Nella maggior parte dei laboratori di analisi del movimento viene implementata una calibrazione anatomica a ���bassa risoluzione��� che prevede la descrizione della morfologia dell���osso a partire dall���informazione relativa alla posizione di alcuni repere corrispondenti a prominenze ossee individuabili tramite palpazione. Attraverso la stereofotogrammetria �� quindi possibile registrare la posizione di questi repere rispetto ad un sistema tecnico. Un diverso approccio di calibrazione anatomica pu�� essere realizzato avvalendosi delle tecniche ad ���alta risoluzione���, ovvero attraverso l���uso di bioimmagini. In questo caso �� necessario disporre di una rappresentazione digitale dell���osso in un sistema di riferimento morfologico e localizzare i repere d���interesse attraverso palpazione in ambiente virtuale (Benedetti et al. 1994 ; Van Sint Jan et al. 2002; Van Sint Jan et al. 2003). Un simile approccio �� difficilmente applicabile nella maggior parte dei laboratori di analisi del movimento, in quanto normalmente non si dispone della strumentazione necessaria per ottenere le bioimmagini; inoltre �� noto che tale strumentazione in alcuni casi pu�� essere invasiva. Per entrambe le calibrazioni anatomiche rimane da tenere in considerazione che, generalmente, i repere anatomici sono dei punti definiti arbitrariamente all���interno di un���area pi�� vasta e irregolare che i manuali di anatomia definiscono essere il repere anatomico. L���identificazione dei repere attraverso una loro descrizione verbale �� quindi povera in precisione e la difficolt�� nella loro identificazione tramite palpazione manuale, a causa della presenza dei tessuti molli interposti, genera errori sia in precisione che in accuratezza. Tali errori si propagano alla stima della cinematica e della dinamica articolare (Ramakrishnan et al. 1991; Della Croce et al. 1999). Della Croce (Della Croce et al. 1999) ha inoltre evidenziato che gli errori che influenzano la collocazione nello spazio delle terne anatomiche non dipendono soltanto dalla precisione con cui vengono identificati i repere anatomici, ma anche dalle regole che si utilizzano per definire le terne. E��� infine necessario evidenziare che la palpazione manuale richiede tempo e pu�� essere effettuata esclusivamente da personale altamente specializzato, risultando quindi molto onerosa (Simon 2004). La presente tesi prende lo spunto dai problemi sopra elencati e ha come obiettivo quello di migliorare la qualit�� delle informazioni necessarie alla ricostruzione della cinematica 3D dei segmenti ossei in esame affrontando i problemi posti dall���artefatto di tessuto molle e le limitazioni intrinseche nelle attuali procedure di calibrazione anatomica. I problemi sono stati affrontati sia mediante procedure di elaborazione dei dati, sia apportando modifiche ai protocolli sperimentali che consentano di conseguire tale obiettivo. Per quanto riguarda l���artefatto da tessuto molle, si �� affrontato l���obiettivo di sviluppare un metodo di stima che fosse specifico per il soggetto e per l���atto motorio in esame e, conseguentemente, di elaborare un metodo che ne consentisse la minimizzazione. Il metodo di stima �� non invasivo, non impone restrizione al movimento dei tessuti molli, utilizza la sola misura stereofotogrammetrica ed �� basato sul principio della media correlata. Le prestazioni del metodo sono state valutate su dati ottenuti mediante una misura 3D stereofotogrammetrica e fluoroscopica sincrona (Stagni et al. 2005), (Stagni et al. 2005). La coerenza dei risultati raggiunti attraverso i due differenti metodi permette di considerare ragionevoli le stime dell���artefatto ottenute con il nuovo metodo. Tale metodo fornisce informazioni sull���artefatto di pelle in differenti porzioni della coscia del soggetto e durante diversi compiti motori, pu�� quindi essere utilizzato come base per un piazzamento ottimo dei marcatori. Lo si �� quindi utilizzato come punto di partenza per elaborare un metodo di compensazione dell���errore dovuto all���artefatto di pelle che lo modella come combinazione lineare degli angoli articolari di anca e ginocchio. Il metodo di compensazione �� stato validato attraverso una procedura di simulazione sviluppata ad-hoc. Relativamente alla calibrazione anatomica si �� ritenuto prioritario affrontare il problema associato all���identificazione dei repere anatomici perseguendo i seguenti obiettivi: 1. migliorare la precisione nell���identificazione dei repere e, di conseguenza, la ripetibilit�� dell���identificazione delle terne anatomiche e della cinematica articolare, 2. diminuire il tempo richiesto, 3. permettere che la procedura di identificazione possa essere eseguita anche da personale non specializzato. Il perseguimento di tali obiettivi ha portato alla implementazione dei seguenti metodi: ��� Inizialmente �� stata sviluppata una procedura di palpazione virtuale automatica. Dato un osso digitale, la procedura identifica automaticamente i punti di repere pi�� significativi, nella maniera pi�� precisa possibile e senza l'ausilio di un operatore esperto, sulla base delle informazioni ricavabili da un osso digitale di riferimento (template), preliminarmente palpato manualmente. ��� E��� stato poi condotto uno studio volto ad indagare i fattori metodologici che influenzano le prestazioni del metodo funzionale nell���individuazione del centro articolare d���anca, come prerequisito fondamentale per migliorare la procedura di calibrazione anatomica. A tale scopo sono stati confrontati diversi algoritmi, diversi cluster di marcatori ed �� stata valutata la prestazione del metodo in presenza di compensazione dell���artefatto di pelle. ��� E���stato infine proposto un metodo alternativo di calibrazione anatomica basato sull���individuazione di un insieme di punti non etichettati, giacenti sulla superficie dell���osso e ricostruiti rispetto ad un TF (UP-CAST). A partire dalla posizione di questi punti, misurati su pelvi coscia e gamba, la morfologia del relativo segmento osseo �� stata stimata senza identificare i repere, bens�� effettuando un���operazione di matching dei punti misurati con un modello digitale dell���osso in esame. La procedura di individuazione dei punti �� stata eseguita da personale non specializzato nell���individuazione dei repere anatomici. Ai soggetti in esame �� stato richiesto di effettuare dei cicli di cammino in modo tale da poter indagare gli effetti della nuova procedura di calibrazione anatomica sulla determinazione della cinematica articolare. I risultati ottenuti hanno mostrato, per quel che riguarda la identificazione dei repere, che il metodo proposto migliora sia la precisione inter- che intraoperatore, rispetto alla palpazione convenzionale (Della Croce et al. 1999). E��� stato inoltre riscontrato un notevole miglioramento, rispetto ad altri protocolli (Charlton et al. 2004; Schwartz et al. 2004), nella ripetibilit�� della cinematica 3D di anca e ginocchio. Bisogna inoltre evidenziare che il protocollo �� stato applicato da operatori non specializzati nell���identificazione dei repere anatomici. Grazie a questo miglioramento, la presenza di diversi operatori nel laboratorio non genera una riduzione di ripetibilit��. Infine, il tempo richiesto per la procedura �� drasticamente diminuito. Per una analisi che include la pelvi e i due arti inferiori, ad esempio, l���identificazione dei 16 repere caratteristici usando la calibrazione convenzionale richiede circa 15 minuti, mentre col nuovo metodo tra i 5 e i 10 minuti.