Unique regulatory properties of the type 2a Ca2+ channel β subunit caused by palmitoylation

β subunits of voltage-gated Ca2+ channels are encoded in four genes and display additional molecular diversity because of alternative splicing. At the functional level, all forms are very similar except for β2a, which differs in that it does not support prepulse facilitation of α1C Ca2+ channels, inhibits voltage-induced inactivation of neuronal α1E Ca2+ channels, and is more effective in blocking inhibition of α1E channels by G protein-coupled receptors. We show that the distinguishing properties of β2a, rather than interaction with a distinct site of α1, are because of the recently described palmitoylation of cysteines in positions three and four, which also occurs in the Xenopus oocyte. Essentially, all of the distinguishing features of β2a were lost in a mutant that could not be palmitoylated [β2a(Cys3,4Ser)]. Because protein palmitoylation is a dynamic process, these findings point to the possibility that regulation of palmitoylation may contribute to activity-dependent neuronal and synaptic plasticity. Evidence is presented that there may exist as many as three β2 splice variants differing only in their N-termini.

Superactivation of an immune response triggered by oligomerized T cell epitopes

The peptides bound to class II major histocompatibility complex (MHC) molecules extend out both ends of the peptide binding groove. This structural feature provided the opportunity to design multivalent polypeptide chains that cross-link class II MHC molecules through multiple, repetitive MHC binding sites. By using recombinant techniques, polypeptide oligomers were constructed that consist of up to 32 copies of an HLA-DR1-restricted T cell epitope. The epitope HA306–318, derived from influenza virus hemagglutinin, was connected by 12- to 36-aa long spacer sequences. These oligomers were found to cross-link soluble HLA-DR1 molecules efficiently and, upon binding to the MHC molecules of a monocyte line, to trigger signal transduction indicated by the enhanced expression of some cell surface molecules. A particularly strong effect was evident in the T cell response. A hemagglutinin-specific T cell clone recognized these antigens at concentrations up to three to four orders of magnitude lower than that of the peptide or the hemagglutinin protein. Both signal transduction in the monocyte and the proliferative response of the T cell were affected greatly by the length of the oligomer (i.e., the number of repetitive units) and the distance of the epitopes within the oligomer (spacing). Thus, the formation of defined clusters of T cell receptor/MHC/peptide antigen complexes appears to be crucial for triggering the immune response and can be used to enhance the antigenicity of a peptide antigen by oligomerizing the epitope.

The crystal structure of modified bovine fibrinogen

Here we report the crystal structure at ≈4-Å resolution of a selectively proteolyzed bovine fibrinogen. This key component in hemostasis is an elongated 340-kDa glycoprotein in the plasma that upon activation by thrombin self-assembles to form the fibrin clot. The crystals are unusual because they are made up of end-to-end bonded molecules that form flexible filaments. We have visualized the entire coiled-coil region of the molecule, which has a planar sigmoidal shape. The primary polymerization receptor pockets at the ends of the molecule face the same way throughout the end-to-end bonded filaments, and based on this conformation, we have developed an improved model of the two-stranded protofibril that is the basic building block in fibrin. Near the middle of the coiled-coil region, the plasmin-sensitive segment is a hinge about which the molecule adopts different conformations. This segment also includes the boundary between the three- and four-stranded portions of the coiled coil, indicating the location on the backbone that anchors the extended flexible Aα arm. We suggest that a flexible branch point in the molecule may help accommodate variability in the structure of the fibrin clot.

Competition for Microtubule-binding with Dual Expression of Tau Missense and Splice Isoforms

How tau mutations lead to neurodegeneration is unknown but may be related to altered microtubule binding properties of mutant tau protein. The tendency for the mutations to cluster around the microtubule-binding domain of tau or to alter the ratios of those splice isoforms that affect binding supports the view that the tau/microtubule interaction is critical and finely regulated. In cells transfected with both mutant and wild-type tau isoforms fused to either yellow fluorescent protein or cyan fluorescent protein we can observe tau fusion proteins that differ by a single amino acid or by the inclusion or exclusion of exon 10. With coexpression of mutant and wild-type tau, the mutant isoform appears diffuse throughout the cytoplasm; however, when mutant tau is expressed alone, it appears mostly bound to the microtubules. Dual imaging of the three- and four-repeat tau isoforms indicated that the expression of four-repeat tau displaced three-repeat tau from the microtubules. These results suggest that altered kinetic competition among the isoforms for microtubule binding could be a disease precipitant.

The use of mRNA display to select high-affinity protein-binding peptides

We report the use of “mRNA display,” an in vitro selection technique, to identify peptide aptamers to a protein target. mRNA display allows for the preparation of polypeptide libraries with far greater complexity than is possible with phage display. Starting with a library of ≈1013 random peptides, 20 different aptamers to streptavidin were obtained, with dissociation constants as low as 5 nM. These aptamers function without the aid of disulfide bridges or engineered scaffolds, yet possess affinities comparable to those for monoclonal antibody–antigen complexes. The aptamers bind streptavidin with three to four orders of magnitude higher affinity than those isolated previously by phage display from lower complexity libraries of shorter random peptides. Like previously isolated peptides, they contain an HPQ consensus motif. This study shows that, given sufficient length and diversity, high-affinity aptamers can be obtained even from random nonconstrained peptide libraries. By engineering structural constraints into these ultrahigh complexity peptide libraries, it may be possible to produce binding agents with subnanomolar binding constants.

Water Deficit and Spatial Pattern of Leaf Development. Variability in Responses Can Be Simulated Using a Simple Model of Leaf Development1

We analyzed the effect of short-term water deficits at different periods of sunflower (Helianthus annuus L.) leaf development on the spatial and temporal patterns of tissue expansion and epidermal cell division. Six water-deficit periods were imposed with similar and constant values of soil water content, predawn leaf water potential and [ABA] in the xylem sap, and with negligible reduction of the rate of photosynthesis. Water deficit did not affect the duration of expansion and division. Regardless of their timing, deficits reduced relative expansion rate by 36% and relative cell division rate by 39% (cells blocked at the G0-G1 phase) in all positions within the leaf. However, reductions in final leaf area and cell number in a given zone of the leaf largely differed with the timing of deficit, with a maximum effect for earliest deficits. Individual cell area was only affected during the periods when division slowed down. These behaviors could be simulated in all leaf zones and for all timings by assuming that water deficit affects relative cell division rate and relative expansion rate independently, and that leaf development in each zone follows a stable three-phase pattern in which duration of each phase is stable if expressed in thermal time (C. Granier and F. Tardieu [1998b] Plant Cell Environ 21: 695–703).

Nucleotide sequences provide evidence of genetic exchange among distantly related lineages of Trypanosoma cruzi

Simple phylogenetic tests were applied to a large data set of nucleotide sequences from two nuclear genes and a region of the mitochondrial genome of Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas' disease. Incongruent gene genealogies manifest genetic exchange among distantly related lineages of T. cruzi. Two widely distributed isoenzyme types of T. cruzi are hybrids, their genetic composition being the likely result of genetic exchange between two distantly related lineages. The data show that the reference strain for the T. cruzi genome project (CL Brener) is a hybrid. Well-supported gene genealogies show that mitochondrial and nuclear gene sequences from T. cruzi cluster, respectively, in three or four distinct clades that do not fully correspond to the two previously defined major lineages of T. cruzi. There is clear genetic differentiation among the major groups of sequences, but genetic diversity within each major group is low. We estimate that the major extant lineages of T. cruzi have diverged during the Miocene or early Pliocene (3–16 million years ago).

Aluminum Induces Oxidative Stress Genes in Arabidopsis thaliana1

Changes in gene expression induced by toxic levels of Al were characterized to investigate the nature of Al stress. A cDNA library was constructed from Arabidopsis thaliana seedlings treated with Al for 2 h. We identified five cDNA clones that showed a transient induction of their mRNA levels, four cDNA clones that showed a longer induction period, and two down-regulated genes. Expression of the four long-term-induced genes remained at elevated levels for at least 48 h. The genes encoded peroxidase, glutathione-S-transferase, blue copper-binding protein, and a protein homologous to the reticuline:oxygen oxidoreductase enzyme. Three of these genes are known to be induced by oxidative stresses and the fourth is induced by pathogen treatment. Another oxidative stress gene, superoxide dismutase, and a gene for Bowman-Birk protease inhibitor were also induced by Al in A. thaliana. These results suggested that Al treatment of Arabidopsis induces oxidative stress. In confirmation of this hypothesis, three of four genes induced by Al stress in A. thaliana were also shown to be induced by ozone. Our results demonstrate that oxidative stress is an important component of the plant's reaction to toxic levels of Al.

Bacteriophage T4 gene 41 helicase and gene 59 helicase-loading protein: A versatile couple with roles in replication and recombination

Bacteriophage T4 uses two modes of replication initiation: origin-dependent replication early in infection and recombination-dependent replication at later times. The same relatively simple complex of T4 replication proteins is responsible for both modes of DNA synthesis. Thus the mechanism for loading the T4 41 helicase must be versatile enough to allow it to be loaded on R loops created by transcription at several origins, on D loops created by recombination, and on stalled replication forks. T4 59 helicase-loading protein is a small, basic, almost completely α-helical protein whose N-terminal domain has structural similarity to high mobility group family proteins. In this paper we review recent evidence that 59 protein recognizes specific structures rather than specific sequences. It binds and loads the helicase on replication forks and on three- and four-stranded (Holliday junction) recombination structures, without sequence specificity. We summarize our experiments showing that purified T4 enzymes catalyze complete unidirectional replication of a plasmid containing the T4 ori(uvsY) origin, with a preformed R loop at the position of the R loop identified at this origin in vivo. This replication depends on the 41 helicase and is strongly stimulated by 59 protein. Moreover, the helicase-loading protein helps to coordinate leading and lagging strand synthesis by blocking replication on the ori(uvsY) R loop plasmid until the helicase is loaded. The T4 enzymes also can replicate plasmids with R loops that do not have a T4 origin sequence, but only if the R loops are within an easily unwound DNA sequence.

A designed beta-hairpin peptide in crystals.

Beta-hairpin structures have been crystallographically characterized only in very short acyclic peptides, in contrast to helices. The structure of the designed beta-hairpin, t-butoxycarbonyl-Leu-Val-Val-D-Pro-Gly-Leu-Val-Val-OMe in crystals is described. The two independent molecules of the octapeptide fold into almost ideal beta-hairpin conformations with the central D-Pro-Gly segment adopting a Type II' beta-turn conformation. The definitive characterization of a beta-hairpin has implications for de novo peptide and protein design, particularly for the development of three- and four-stranded beta-sheets.

Discontinuous epitopes of hepatitis B surface antigen derived from a filamentous phage peptide library.

The structure of the small hepatitis B virus surface antigen (HBsAg) was investigated by epitope mapping of four anti-HBsAg monoclonal antibodies (mAbs). Amino acid sequences of epitopes were derived from affinity-enrichment experiments (biopanning) using a filamentous phage peptide library. The library consists of 10(9) different clones bearing a 30-residue peptide fused to gene III. Sequence homologies between peptides obtained from panning the library against the antibodies and the native HBsAg sequence allowed for precise description of the binding regions. Three of four mAbs were found to bind to distinct discontinuous epitopes between amino acid residues 101 and 207 of HBsAg. The fourth mAb was demonstrated to bind to residues 121-124. The sequence data are supported by ELISA assays demonstrating the binding of the HBsAg-specific peptides on filamentous phage to mAbs. The sequence data were used to map the surface of HBsAg and to derive a topological model for the alpha-carbon trace of the 101-207 region of HBsAg. The approach should be useful for other proteins for which the crystal structure is not available but a representative set of mAbs can be obtained.

The antiproliferative activity of c-myb and c-myc antisense oligonucleotides in smooth muscle cells is caused by a nonantisense mechanism.

Smooth muscle cell (SMC) proliferation is thought to play a major role in vascular restenosis after angioplasty and is a serious complication of the procedure. Developing antisense (AS) oligonucleotides as therapeutics is attractive because of the potentially high specificity of binding to their targets, and several investigators have reported inhibition of SMC proliferation in vitro and in vivo by using AS strategies. We report here the results of our experiments on vascular SMCs using AS oligonucleotides directed toward c-myb and c-myc. We found that significant inhibition of SMC proliferation occurred with these specific AS sequences but that this inhibition was clearly not via a hybridization-dependent AS mechanism. Rather, inhibition was due to the presence of four contiguous guanosine residues in the oligonucleotide sequence. This was demonstrated in vitro in primary cultures of SMCs and in arteries ex vivo. The ex vivo model developed here provides a rapid and effective system in which to screen potential oligonucleotide drugs for restenosis. We have further explored the sequence requirements of this non-AS effect and determined that phosphorothioate oligonucleotides containing at least two sets of three or four consecutive guanosine residues inhibit SMC proliferation in vitro and ex vivo. These results suggest that previous AS data obtained using these and similar, contiguous guanosine-containing AS sequences be reevaluated and that there may be an additional class of nucleic acid compounds that have potential as antirestenosis therapeutics.

Aprendizagem de substantivos e adjetivos por meio de leitura compartilhada para crianças com desenvolvimento típico e com Síndrome de Down

A leitura compartilhada de livros para crianças é uma atividade que tem sido estudada como forma de ensino incidental de vocabulário, que envolve, dentre outros processos, o responder por exclusão. O objetivo do presente trabalho foi investigar a ocorrência de aprendizagem de relações entre estímulos visuais (figuras) com seus respectivos estímulos auditivos (palavras) a partir de diferentes condições de leitura compartilhada de livros para crianças com Síndrome de Down (SD) e com desenvolvimento típico (DT). Para a pesquisa foram desenvolvidos dois estudos. No Estudo 1, participaram seis crianças com SD com seis a sete anos, e seis crianças com DT com três a quatro anos (amostras pareadas em função do nível de vocabulário). Foi utilizado um livro de história produzido pela pesquisadora, no qual havia dois substantivos e dois adjetivos desconhecidos (estímulos visuais S1, S2, A1, A2), apresentados uma única vez na história. Esse livro foi lido para cada criança duas vezes em sequência por sessão e em cada sessão foi realizada uma condição de leitura diferente. Foram apresentadas três condições de leitura e cada criança passou por todas, mas em diferentes ordens (contrabalanceamento). Na Condição 1, o livro foi lido para a criança sem intervenções. Na Condição 2, o livro foi lido para a criança e ela tinha que repetir o nome dos estímulos desconhecidos. Na Condição 3, o livro foi lido e foram realizadas perguntas relacionadas aos estímulos-alvo. Ao final de cada sessão foram realizadas sondas de aprendizagem (sondas de emparelhamento ao modelo e nomeação), e após uma semana da última sessão foi aplicada uma sonda de manutenção e uma de generalização. As crianças com DT apresentaram maior número de acertos que as com SD, e os acertos foram mais relacionados ao estímulo S1. As crianças não aprenderam a relação nome-cor. A análise dos resultados sugeriu que o número de estímulos-alvo era excessivo e com apresentações insuficientes no livro. No Estudo 2 participaram seis crianças com DT de 3 a 4 anos e seis crianças com SD, de 5 a 8 anos. O procedimento utilizado no Estudo 2 foi semelhante ao primeiro com as seguintes alterações no livro: utilização de apenas duas relações-alvo (um substantivo-alvo e um adjetivo-alvo - S2 e A3), cada uma sendo apresentada três vezes ao longo da história, em figuras que possibilitavam o responder por exclusão. Também foi acrescentada uma tentativa de exclusão nas sondas de aprendizagem. Nesse estudo, todas as crianças com DT conseguiram selecionar e nomear estímulo S2 e duas mostraram indícios de aprendizagem do estímulo A3. As crianças com SD apresentaram um menor número de acertos nas sondas de emparelhamento, mas apresentaram algumas nomeações corretas, o que não foi observado no Estudo 1. Os dados sugerem que as mudanças realizadas no livro melhoram o desempenho das crianças com DT, mas não o das crianças com SD. Não foram encontradas diferenças entre as condições de leituras nos dois estudos. No entanto, são necessários estudos adicionais para avaliar essas diferentes condições e as variáveis envolvidas na aprendizagem de palavras a partir da leitura compartilhada de livro.

Avaliação de microtécnicas de extração para análise de lamotrigina em plasma de pacientes epilépticos por eletroforese capilar

A lamotrigina (LTG) é um fármaco pertencente à classe das feniltriazinas utilizado no tratamento de crises epilépticas generalizadas e focais e no tratamento adjunto da epilepsia refratária. Devido à alta variabilidade interindividual, às interações medicamentosas e aos efeitos adversos apresentados durante a administração da LTG, a monitorização terapêutica nos pacientes que fazem uso deste fármaco é necessária para ajuste de dose individual e evitar os efeitos adversos. Assim, o objetivo deste trabalho foi a avaliação de duas técnicas de microextração: a microextração em fase líquida com fibras ocas (HF-LPME) e a microextração líquido-líquido dispersiva (DLLME) para análise da lamotrigina em amostras de plasma de pacientes epilépticos. Primeiramente foram definidas as condições eletroforéticas: foi utilizado um capilar de sílica fundida de 75 ?m de diâmetro interno e 50 cm de comprimento efetivo. O eletrólito de corrida (BGE) foi composto por ácido 2-morfolinoetanosulfônico (MES), na concentração de 130 mmol L-1 e pH 5,0. As análises foram realizadas à temperatura de 20°C e tensão de 15 kV. A amostra foi injetada hidrodinamicamente (0,5 psi por 10 s) e a detecção foi feita em 214 nm. Nestas condições a LTG e o padrão interno (PI), lidocaína, puderam ser analisados em menos de 7 minutos. A HF-LPME foi avaliada no modo de 3 fases, usando 500 ?L de plasma e 3,5 mL de solução fosfato de sódio 50 mmol L-1 pH 9,0 como fase doadora. O solvente utilizado para impregnar a fibra foi o 1-octanol. Como fase aceptora foram utilizados 60 ?L de solução de ácido clorídrico pH 4,0. Para avaliação da DLLME, foi necessária uma etapa de pré-tratamento da amostra (500 ?L de plasma) com 1 mL de acetonitrila. Após isto, 1,3 mL do sobrenadante foram adicionados a 4 mL de solução fosfato de sódio 50 mmol L-1 pH 9,0 e 120 ?L de clorofórmio (solvente extrator) foram injetados nesta amostra aquosa e 165 ?L de fase sedimentada foram recuperados. As características de desempenho analítico para ambos os métodos foram avaliadas, sendo obtida linearidade na faixa de concentração plasmática de 1-20 ?g/mL e limite inferior de quantificação (LIQ) de 1 ?g mL-1. Os ensaios de precisão e exatidão apresentaram valores de acordo com os guias oficiais. Além disso, os métodos foram seletivos, não apresentaram efeito residual e as amostras foram estáveis. Os valores de recuperação foram de 54,3 e 23% para HF-LPME e DLLME, respectivamente. Os métodos validados foram aplicados com sucesso em amostras de plasma de pacientes epilépticos em tratamento com a LTG. Além disso, as duas técnicas foram comparadas e a HF-LPME apresentou vantagens em relação à DLLME, mostrando ser uma técnica promissora para análise de matrizes complexas, com reduzido consumo de solvente orgânico e possibilidade de automação.

Um modelo multiescala concorrente para representar o processo de fissuração do concreto.

Este trabalho propõe uma técnica de modelagem multiescala concorrente do concreto considerando duas escalas distintas: a mesoescala, onde o concreto é modelado como um material heterogêneo, e a macroescala, na qual o concreto é tratado como um material homogêneo. A heterogeneidade da estrutura mesoscópica do concreto é idealizada considerando três fases distintas, compostas pelos agregados graúdos e argamassa (matriz), estes considerados materiais homogêneos, e zona de transição interfacial (ZTI), tratada como a parte mais fraca entre as três fases. O agregado graúdo é gerado a partir de uma curva granulométrica e posicionado na matriz de forma aleatória. Seu comportamento mecânico é descrito por um modelo constitutivo elástico-linear, devido a sua maior resistência quando comparado com as outras duas fases do concreto. Elementos finitos contínuos com alta relação de aspecto em conjunto com um modelo constitutivo de dano são usados para representar o comportamento não linear do concreto, decorrente da iniciação de fissuras na ZTI e posterior propagação para a matriz, dando lugar à formação de macrofissuras. Os elementos finitos de interface com alta relação de aspecto são inseridos entre todos os elementos regulares da matriz e entre os da matriz e agregados, representando a ZTI, tornando-se potenciais caminhos de propagação de fissuras. No estado limite, quando a espessura do elemento de interface tende a zero (h ?0) e, consequentemente, a relação de aspecto tende a infinito, estes elementos apresentam a mesma cinemática da aproximação contínua de descontinuidades fortes (ACDF), sendo apropriados para representar a formação de descontinuidades associados a fissuras, similar aos modelos coesivos. Um modelo de dano à tração é proposto para representar o comportamento mecânico não linear das interfaces, associado à formação de fissuras, ou até mesmo ao eventual fechamento destas. A fim de contornar os problemas causados pela malha de elementos finitos de transição entre as malhas da macro e da mesoescala, que, em geral, apresentam diferenças expressivas 5 de refinamento, utiliza-se uma técnica recente de acoplamento de malhas não conformes. Esta técnica é baseada na definição de elementos finitos de acoplamento (EFAs), os quais são capazes de estabelecer a continuidade de deslocamento entre malhas geradas de forma completamente independentes, sem aumentar a quantidade total de graus de liberdade do problema, podendo ser utilizados tanto para acoplar malhas não sobrepostas quanto sobrepostas. Para tornar possível a análise em multiescala em casos nos quais a região de localização de deformações não pode ser definida a priori, propõe-se uma técnica multiescala adaptativa. Nesta abordagem, usa-se a distribuição de tensões da escala macroscópica como um indicador para alterar a modelagem das regiões críticas, substituindo-se a macroescala pela mesoescala durante a análise. Consequentemente, a malha macroscópica é automaticamente substituída por uma malha mesoscópica, onde o comportamento não linear está na iminência de ocorrer. Testes numéricos são desenvolvidos para mostrar a capacidade do modelo proposto de representar o processo de iniciação e propagação de fissuras na região tracionada do concreto. Os resultados numéricos são comparados com os resultados experimentais ou com aqueles obtidos através da simulação direta em mesoescala (SDM).