DNA synthesis and topoisomerase inhibitors increase transduction by adeno-associated virus vectors.

Viral vectors based on adeno-associated virus (AAV) preferentially transduce cells in S phase of the cell cycle. We recently found that DNA-damaging agents increased the transduction of nondividing cells. However, the optimal concentrations were toxic to cells. Here we show that the transduction of normal human fibroblasts by AAV vectors is increased by prior exposure to DNA synthesis inhibitors, such as aphidicolin or hydroxyurea, and topoisomerase inhibitors, such as etoposide or camptothecin. Transduction efficiencies could be increased > 300-fold in stationary cultures at concentrations that did not affect cell viability or proliferative potential. Both S-phase and non-S-phase cells were affected, suggesting that cellular functions other than replicative DNA synthesis may be involved. Applying these methods to gene transfer protocols should improve prospects for gene therapy by AAV vectors.

Iontophoresis for modulation of cardiac drug delivery in dogs.

Cardiac arrhythmias are a frequent cause of death and morbidity. Conventional antiarrhythmia therapy involving oral or intravenous medication is often ineffective and complicated by drug-associated side effects. Previous studies from our laboratory have demonstrated the advantages of cardiac drug-polymer implants for enhanced efficacy for cardiac arrhythmia therapy compared with conventional administration. However, these studies were based on systems that deliver drugs at a fixed release rate. Modulation of the drug delivery rate has the advantage of regulating the amount of the drug delivered depending upon the disease state of the patient. We hypothesized that iontophoresis could be used to modulate cardiac drug delivery. In this study, we report our investigations of a cardiac drug implant in dogs that is capable of iontophoretic modulation of the administration of the antiarrhythmic agent sotalol. We used a heterogeneous cation-exchange membrane (HCM) as an electrically sensitive and highly efficient rate-limiting barrier on the cardiac-contacting surface of the implant. Thus, electric current is passed only through the HCM and not the myocardium. The iontophoretic cardiac implant demonstrated in vitro drug release rates that were responsive to current modulation. In vivo results in dogs have confirmed that iontophoresis resulted in regional coronary enhancement of sotalol levels with current-responsive increases in drug concentrations. We also observed acute current-dependent changes in ventricular effective refractory periods reflecting sotalol-induced refractoriness due to regional drug administration. In 30-day dog experiments, iontophoretic cardiac implants demonstrated robust sustained function and reproducible modulation of drug delivery kinetics.

Pleasant sweeping grooming touch in rhesus monkey: effects on autonomic nervous system and its codification in posterior insular and secondary somatosensory cortex

Il tatto assume un'importanza fondamentale nella vita quotidiana, in quanto ci permette di discriminare le caratteristiche fisiche di un oggetto specifico, di identificarlo e di eventualmente integrare le suddette informazioni tattili con informazioni provenienti da altri canali sensoriali. Questa è la componente sensoriale-discriminativa del tatto. Tuttavia quotidianamente il tatto assume un ruolo fondamentale durante le diverse interazioni sociali, positive, come quando abbracciamo o accarezziamo una persona con cui abbiamo un rapporto affettivo e negative, per esempio quando allontaniamo una persona estranea dal nostro spazio peri-personale. Questa componente è la cosiddetta dimensione affettiva-motivazionale, la quale determina la codifica della valenza emotiva che l'interazione assume. Questa componente ci permette di creare, mantenere o distruggere i legami sociali in relazione al significato che il tocco assume durante l'interazione. Se per esempio riceviamo una carezza da un familiare, questa verrà percepita come piacevole e assumerà un significato affiliativo. Questo tipo di tocco è comunente definito come Tocco Sociale (Social Touch). Gli aspetti discriminativi del tatto sono stati ben caratterizzati, in quanto storicamente, il ruolo del tatto è stato considerato quello di discriminare le caratteristiche di ciò che viene toccato, mentre gli aspetti affettivi sono stati solo recentemente indagati considerando la loro importanza nelle interazioni sociali. Il tocco statico responsabile dell'aspetto discriminante attiva a livello della pelle le grandi fibre mieliniche (Aβ), modulando a livello del sistema nervoso centrale le cortecce sensoriali, sia primarie che secondarie. Questo permette la codifica a livello del sistema nervoso centrale delle caratteristiche fisiche oggettive degli oggetti toccati. Studi riguardanti le caratteristiche del tocco affiliativo sociale hanno messo in evidenza che suddetta stimolazione tattile 1) è un particolare tocco dinamico che avviene sul lato peloso delle pelle con una velocità di 1-10 cm/sec; 2) attiva le fibre amieliniche (fibre CT o C-LTMRs); 3) induce positivi effetti autonomici, ad esempio la diminuzione della frequenza cardiaca e l'aumento della variabilità della frequenza cardiaca; e 4) determina la modulazione di regioni cerebrali coinvolte nella codifica del significato affiliativo dello stimolo sensoriale periferico, in particolare la corteccia insulare. Il senso del tatto, con le sue due dimensioni discriminativa e affiliativa, è quotidianamente usato non solo negli esseri umani, ma anche tra i primati non umani. Infatti, tutti i primati non umani utilizzano la componente discriminativa del tatto per identificare gli oggetti e il cibo e l'aspetto emotivo durante le interazioni sociali, sia negative come durante un combattimento, che positive, come durante i comportamenti affiliativi tra cui il grooming. I meccanismi di codifica della componente discriminativa dei primati non umani sono simili a quelli umani. Tuttavia, si conosce ben poco dei meccanismi alla base della codifica del tocco piacevole affiliativo. Pur essendo ben noto che i meccanorecettori amilienici C-LTMRs sono presenti anche sul lato peloso della pelle dei primati non umani, attualmente non ci sono studi riguardanti la correlazione tra il tocco piacevole e la loro modulazione, come invece è stato ampiamente dimostrato nell'uomo. Recentemente è stato ipotizzato (Dunbar, 2010) il ruolo delle fibre C-LTMRs durante il grooming, in particolare durante il cosiddetto swepping. Il grooming è costituito da due azioni motorie, lo sweeping e il picking che vengono eseguite in modo ritmico. Durante lo sweeping la scimmia agente muove il pelo della scimmia ricevente con un movimento a mano aperta, per poter vedere il preciso punto della pelle dove eseguire il picking, ovvero dove prendere la pelle a livello della radice del pelo con le unghie dell'indice e del pollice e tirare per rimuovere parassiti o uova di parassiti e ciò che è rimasto incastrato nel pelo. Oltre il noto ruolo igenico, il grooming sembra avere anche una importante funzione sociale affiliativa. Come la carezza nella società umana, cosi il grooming tra i primati non umani è considerato un comportamento. Secondo l'ipotesi di Dunbar l'attivazione delle C-LTMRs avverrebbe durante lo sweeping e questo porta a supporre che lo sweeping, come la carezza umana, costituisca una componente affiliativa del grooming, determinando quindi a contribuire alla sua codifica come comportamento sociale. Fino ad ora non vi è però alcuna prova diretta a sostegno di questa ipotesi. In particolare, 1) la velocità cui viene eseguito lo sweeping è compatibile con la velocità di attivazione delle fibre CT nell'uomo e quindi con la velocità tipica della carezza piacevole di carattere sociale affiliativo (1-10 cm/sec)?; 2) lo sweeping induce la stessa modulazione del sistema nervoso autonomo in direzione della modulazione del sistema vagale, come il tocco piacevole nell'uomo, attraverso l'attivazione delle fibre CT?; 3) lo sweeping modula la corteccia insulare, cosi come il tocco piacevole viene codificato come affiliativo nell'uomo mediante le proiezioni delle fibre CT a livello dell'insula posteriore? Lo scopo del presente lavoro è quella di testare l'ipotesi di Dunbar sopra citata, cercando quindi di rispondere alle suddette domande. Le risposte potrebbero consentire di ipotizzare la somiglianza tra lo sweeping, caratteristico del comportamento affiliativo di grooming tra i primati non umani e la carezza. In particolare, abbiamo eseguito 4 studi pilota. Nello Studio 1 abbiamo valutato la velocità con cui viene eseguito lo sweeping tra scimmie Rhesus, mediante una analisi cinematica di video registrati tra un gruppo di scimmie Rhesus. Negli Studi 2 e 3 abbiamo valutato gli effetti sul sistema nervoso autonomo dello sweeping eseguito dallo sperimentatore su una scimmia Rhesus di sesso maschile in una tipica situazione sperimentale. La stimolazione tattile è stata eseguita a diverse velocità, in accordo con i risultati dello Studio 1 e degli studi umani che hanno dimostrato la velocità ottimale e non ottimale per l'attivazione delle C-LTMRs. In particolare, nello Studio 2 abbiamo misurato la frequenza cardiaca e la variabilità di questa, come indice della modulatione vagale, mentre nello Studio 3 abbiamo valutato gli effetti dello sweeping sul sistema nervoso autonomo in termini di variazioni di temperatura del corpo, nello specifico a livello del muso della scimmia. Infine, nello Studio 4 abbiamo studiato il ruolo della corteccia somatosensoriale secondaria e insulare nella codifica dello sweeping. A questo scopo abbiamo eseguito registrazioni di singoli neuroni mentre la medesima scimmia soggetto sperimentale dello Studio 2 e 3, riceveva lo sweeping a due velocità, una ottimale per l'attivazione delle C-LTMRs secondo gli studi umani e i risultati dei tre studi sopra citati, ed una non ottimale. I dati preliminari ottenuti, dimostrano che 1) (Studio 1) lo sweeping tra scimmie Rhesus viene eseguito con una velocità media di 9.31 cm/sec, all'interno dell'intervallo di attivazione delle fibre CT nell'uomo; 2) (Studio 2) lo sweeping eseguito dallo sperimentatore sulla schiena di una scimmia Rhesus di sesso maschile in una situazione sperimentale determina una diminuzione della frequenza cardiaca e l'aumento della variabilità della frequenza cardiaca se eseguito alla velocità di 5 e 10 cm/sec. Al contrario, lo sweeping eseguito ad una velocità minore di 1 cm/sec o maggiore di 10 cm/sec, determina l'aumento della frequenza cardiaca e la diminuzione della variabilità di questa, quindi il decremento dell'attivazione del sistema nervoso parasimpatico; 3) (Studio 3) lo sweeping eseguito dallo sperimentatore sulla schiena di una scimmia Rhesus di sesso maschile in una situazione sperimentale determina l'aumento della temperatura corporea a livello del muso della scimmia se eseguito alla velocità di 5-10 cm/sec. Al contrario, lo sweeping eseguito ad una velocità minore di 5 cm/sec o maggiore di 10 cm/sec, determina la diminuzione della temperatura del muso; 4) (Studio 4) la corteccia somatosensoriale secondaria e la corteccia insulare posteriore presentano neuroni selettivamente modulati durante lo sweeping eseguito ad una velocità di 5-13 cm/sec ma non neuroni selettivi per la codifica della velocità dello sweeping minore di 5 cm/sec. Questi risultati supportano l'ipotesi di Dunbar relativa al coinvolgimento delle fibre CT durante lo sweeping. Infatti i dati mettono in luce che lo sweeping viene eseguito con una velocità (9.31 cm/sec), simile a quella di attivazione delle fibre CT nell'uomo (1-10 cm/sec), determina gli stessi effetti fisiologici positivi in termini di frequenza cardiaca (diminuzione) e variabilità della frequenza cardiaca (incremento) e la modulazione delle medesime aree a livello del sistema nervoso centrale (in particolare la corteccia insulare). Inoltre, abbiamo dimostrato per la prima volta che suddetta stimolazione tattile determina l'aumento della temperatura del muso della scimmia. Il presente studio rappresenta la prima prova indiretta dell'ipotesi relativa alla modulazione del sistema delle fibre C-LTMRs durante lo sweeping e quindi della codifica della stimolazione tattile piacevole affiliativa a livello del sistema nervoso centrale ed autonomo, nei primati non umani. I dati preliminari qui presentati evidenziano la somiglianza tra il sistema delle fibre CT dell'uomo e del sistema C-LTMRs nei primati non umano, riguardanti il Social Touch. Nonostante ciò abbiamo riscontrato alcune discrepanze tra i risultati da noi ottenuti e quelli invece ottenuti dagli studi umani. La velocità media dello sweeping è di 9.31 cm / sec, rasente il limite superiore dell’intervallo di velocità che attiva le fibre CT nell'uomo. Inoltre, gli effetti autonomici positivi, in termini di battito cardiaco, variabilità della frequenza cardiaca e temperatura a livello del muso, sono stati evidenziati durante lo sweeping eseguito con una velocità di 5 e 10 cm/sec, quindi al limite superiore dell’intervallo ottimale che attiva le fibre CT nell’uomo. Al contrario, lo sweeping eseguito con una velocità inferiore a 5 cm/sec e superiore a 10 cm/sec determina effetti fisiologici negativo. Infine, la corteccia insula sembra essere selettivamente modulata dallo stimolazione eseguita alla velocità di 5-13 cm/sec, ma non 1-5 cm/sec. Quindi, gli studi sul sistema delle fibre CT nell’uomo hanno dimostrato che la velocità ottimale è 1-10 cm/sec, mentre dai nostri risultati la velocità ottimale sembra essere 5-13 cm / sec. Quindi, nonostante l'omologia tra il sistema delle fibre CT nell'umano deputato alla codifica del tocco piacevole affiliativo ed il sistema delle fibre C-LTMRs nei primati non umani, ulteriori studi saranno necessari per definire con maggiore precisione la velocità ottimale di attivazione delle fibre C-LTMR e per dimostrare direttamente la loro attivazione durante lo sweeping, mediante la misurazione diretta della loro modulazione. Studi in questa direzione potranno confermare l'omologia tra lo sweeping in qualità di tocco affiliativo piacevole tra i primati non umani e la carezza tra gli uomini. Infine, il presente studio potrebbe essere un importante punto di partenza per esplorare il meccanismo evolutivo dietro la trasformazione dello sweeping tra primati non umani, azione utilitaria eseguita durante il grooming, a carezza, gesto puramente affiliativo tra gli uomini.

Valutazione della risposta immunitaria cellulare e fenotipizzazione linfocitaria nel suino in corso di infezione naturale da virus della PRRS (“Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome”) e dopo stimolazione di PBMC (“Peripheral Blood Mononuclear Cells”) in vitro con Peptide Killer (KP)

SUMMARY The Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) virus is one of the most spread pathogens in swine herds all over the world and responsible for a reproductive and respiratory syndrome that causes severe heath and economical problems. This virus emerged in late 1980’s but although about 30 years have passed by, the knowledge about some essential facets related to the features of the virus (pathogenesis, immune response, and epidemiology) seems to be still incomplete. Taking into account that the development of modern vaccines is based on how innate and acquire immunity react, a more and more thorough knowledge on the immune system is needed, in terms of molecular modulation/regulation of the inflammatory and immune response upon PRRSV infection. The present doctoral thesis, which is divided into 3 different studies, is aimed to increase the knowledge about the interaction between the immune system and the PRRS virus upon natural infection. The objective of the first study entitled “Coordinated immune response of memory and cytotoxic T cells together with IFN-γ secreting cells after porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) natural infection in conventional pigs” was to evaluate the activation and modulation of the immune response in pigs naturally infected by PRRSV compared to an uninfected control group. The course of viremia was evaluated by PCR, the antibody titres by ELISA, the number of IFN-γ secreting cells (IFN- SC) by an ELISPOT assay and the immunophenotyping of some lymphocyte subsets (cytotoxic cells, memory T lymphocytes and cytotoxic T lymphocytes) by flow cytometry. The results showed that the activation of the cell-mediated immune response against PRRSV is delayed upon infection and that however the levels of IFN-γ SC and lymphocyte subsets subsequently increase over time. Furthermore, it was observed that the course of the different immune cell subsets is time-associated with the levels of PRRSV-specific IFN-γ SC and this can be interpreted based on the functional role that such lymphocyte subsets could have in the specific production/secretion of the immunostimulatory cytokine IFN-γ. In addition, these data support the hypothesis that the age of the animals upon the onset of infection or the diverse immunobiological features of the field isolate, as typically hypothesized during PRRSV infection, are critical conditions able to influence the qualitative and quantitative course of the cell-mediated immune response during PRRSV natural infection. The second study entitled “Immune response to PCV2 vaccination in PRRSV viremic piglets” was aimed to evaluate whether PRRSV could interfere with the activation of the immune response to PCV2 vaccination in pigs. In this trial, 200 pigs were divided into 2 groups: PCV2-vaccinated (at 4 weeks of age) and PCV2-unvaccinated (control group). Some piglets of both groups got infected by PRRSV, as determined by PRRSV viremia detection, so that 4 groups were defined as follows: PCV2 vaccinated - PRRSV viremic PCV2 vaccinated - PRRSV non viremic PCV2 unvaccinated - PRRSV viremic PCV2 unvaccinated - PRRSV non viremic The following parameters were evaluated in the 4 groups: number of PCV2-specific IFN-γ secreting cells, antibody titres by ELISA and IPMA. Based on the immunological data analysis, it can be deduced that: 1) The low levels of antibodies against PCV2 in the PCV2-vaccinated – PRRSV-viremic group at vaccination (4 weeks of age) could be related to a reduced colostrum intake influenced by PRRSV viremia. 2) Independently of the viremia status, serological data of the PCV2-vaccinated group by ELISA and IPMA does not show statistically different differences. Consequently, it can be be stated that, under the conditions of the study, PRRSV does not interfere with the antibody response induced by the PCV2 vaccine. 3) The cell-mediated immune response in terms of number of PCV2-specific IFN-γ secreting cells in the PCV2-vaccinated – PRRSV-viremic group seems to be compromised, as demonstrated by the reduction of the number of IFN-γ secreting cells after PCV2 vaccination, compared to the PCV2-vaccinated – PRRSV-non-viremic group. The data highlight and further support the inhibitory role of PRRSV on the development and activation of the immune response and highlight how a natural infection at early age can negatively influence the immune response to other pathogens/antigens. The third study entitled “Phenotypic modulation of porcine CD14+ monocytes, natural killer/natural killer T cells and CD8αβ+ T cell subsets by an antibody-derived killer peptide (KP)” was aimed to determine whether and how the killer peptide (KP) could modulate the immune response in terms of activation of specific lymphocyte subsets. This is a preliminary approach also aimed to subsequently evaluate such KP with a potential antivural role or as adjuvant. In this work, pig peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were stimulated with three KP concentrations (10, 20 and 40 g/ml) for three time points (24, 48 and 72 hours). TIME POINTS (hours) KP CONCENTRATIONS (g/ml) 24 0-10-20-40 48 0-10-20-40 72 0-10-20-40 By using flow cytometry, the qualitative and quantitative modulation of the following immune subsets was evaluated upon KP stimulation: monocytes, natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and CD4+ and CD8α/β+ T lymphocyte subsets. Based on the data, it can be deduced that: 1) KP promotes a dose-dependent activation of monocytes, particularly after 24 hours of stimulation, by inducing a monocyte phenotypic and maturation shift mainly involved in sustaining the innate/inflammatory response. 2) KP induces a strong dose-dependent modulation of NK and NKT cells, characterized by an intense increase of the NKT cell fraction compared to NK cells, both subsets involved in the antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC). The increase is observed especially after 24 hours of stimulation. 3) KP promotes a significant activation of the cytotoxic T lymphocyte subset (CTL). 4) KP can modulate both the T helper and T cytotoxic phenotype, by inducing T helper cells to acquire the CD8α thus becoming doube positive cells (CD4+CD8+) and by inducing CTL (CD4-CD8+high) to acquire the double positive phenotype (CD4+CD8α+high). Therefore, KP may induce several effects on different immune cell subsets. For this reason, further research is needed aimed at characterizing each “effect” of KP and thus identifying the best use of the decapeptide for vaccination practice, therapeutic purposes or as vaccine adjuvant. RIASSUNTO Il virus della PRRS (Porcine Reproductive Respiratory Syndrome) è uno dei più diffusi agenti patogeni negli allevamenti suini di tutto il mondo, responsabile di una sindrome riproduttiva e respiratoria causa di gravi danni ad impatto sanitario ed economico. Questo virus è emerso attorno alla fine degli anni ’80 ma nonostante siano passati circa una trentina di anni, le conoscenze su alcuni punti essenziali che riguardano le caratteristiche del virus (patogenesi, risposta immunitaria, epidemiologia) appaiono ancora spesso incomplete. Considerando che lo sviluppo dei vaccini moderni è basato sui principi dell’immunità innata e acquisita è essenziale una sempre più completa conoscenza del sistema immunitario inteso come modulazione/regolazione molecolare della risposta infiammatoria e immunitaria in corso di tale infezione. Questo lavoro di tesi, suddiviso in tre diversi studi, ha l’intento di contribuire all’aumento delle informazioni riguardo l’interazione del sistema immunitario, con il virus della PRRS in condizioni di infezione naturale. L’obbiettivo del primo studio, intitolato “Associazione di cellule memoria, cellule citotossiche e cellule secernenti IFN- nella risposta immunitaria in corso di infezione naturale da Virus della Sindrome Riproduttiva e Respiratoria del Suino (PRRSV)” è stato di valutare l’attivazione e la modulazione della risposta immunitaria in suini naturalmente infetti da PRRSV rispetto ad un gruppo controllo non infetto. I parametri valutati sono stati la viremia mediante PCR, il titolo anticorpale mediante ELISA, il numero di cellule secernenti IFN- (IFN- SC) mediante tecnica ELISPOT e la fenotipizzazione di alcune sottopopolazioni linfocitarie (Cellule citotossiche, linfociti T memoria e linfociti T citotossici) mediante citofluorimetria a flusso. Dai risultati ottenuti è stato possibile osservare che l’attivazione della risposta immunitaria cellulo-mediata verso PRRSV appare ritardata durante l’infezione e che l’andamento, in termini di IFN- SC e dei cambiamenti delle sottopopolazioni linfocitarie, mostra comunque degli incrementi seppur successivi nel tempo. E’ stato inoltre osservato che gli andamenti delle diverse sottopopolazioni immunitarie cellulari appaiono temporalmente associati ai livelli di IFN- SC PRRSV-specifiche e ciò potrebbe essere interpretato sulla base del ruolo funzionale che tali sottopopolazioni linfocitarie potrebbero avere nella produzione/secrezione specifica della citochina immunoattivatrice IFN-. Questi dati inoltre supportano l’ipotesi che l’età degli animali alla comparsa dell’infezione o, come tipicamente ipotizzato nell’infezione da PRRSV, le differenti caratteristiche immunobiologiche dell’isolato di campo, sia condizioni critiche nell’ influenzare l’andamento qualitativo e quantitativo della risposta cellulo-mediata durante l’infezione naturale da PRRSV. Il secondo studio, dal titolo “Valutazione della risposta immunitaria nei confronti di una vaccinazione contro PCV2 in suini riscontrati PRRSV viremici e non viremici alla vaccinazione” ha avuto lo scopo di valutare se il virus della PRRS potesse andare ad interferire sull’attivazione della risposta immunitaria indotta da vaccinazione contro PCV2 nel suino. In questo lavoro sono stati arruolati 200 animali divisi in due gruppi, PCV2 Vaccinato (a 4 settimane di età) e PCV2 Non Vaccinato (controllo negativo). Alcuni suinetti di entrambi i gruppi, si sono naturalmente infettati con PRRSV, come determinato con l’analisi della viremia da PRRSV, per cui è stato possibile creare quattro sottogruppi, rispettivamente: PCV2 vaccinato - PRRSV viremico PCV2 vaccinato - PRRSV non viremico PCV2 non vaccinato - PRRSV viremico PCV2 non vaccinato - PRRSV non viremico Su questi quattro sottogruppi sono stati valutati i seguenti parametri: numero di cellule secernenti IFN- PCV2 specifiche, ed i titoli anticorpali mediante tecniche ELISA ed IPMA. Dall’analisi dei dati immunologici derivati dalle suddette tecniche è stato possibile dedurre che:  I bassi valori anticorpali nei confronti di PCV2 del gruppo Vaccinato PCV2-PRRSV viremico già al periodo della vaccinazione (4 settimane di età) potrebbero essere messi in relazione ad una ridotta assunzione di colostro legata allo stato di viremia da PRRSV  Indipendentemente dallo stato viremico, i dati sierologici del gruppo vaccinato PCV2 provenienti sia da ELISA sia da IPMA non mostrano differenze statisticamente significative. Di conseguenza è possibile affermare che in questo caso PRRSV non interferisce con la risposta anticorpale promossa dal vaccino PCV2.  La risposta immunitaria cellulo-mediata, intesa come numero di cellule secernenti IFN- PCV2 specifiche nel gruppo PCV2 vaccinato PRRS viremico sembra essere compromessa, come viene infatti dimostrato dalla diminuzione del numero di cellule secernenti IFN- dopo la vaccinazione contro PCV2, comparata con il gruppo PCV2 vaccinato- non viremico. I dati evidenziano ed ulteriormente sostengono il ruolo inibitorio del virus della PRRSV sullo sviluppo ed attivazione della risposta immunitaria e come un infezione naturale ad età precoci possa influenzare negativamente la risposta immunitaria ad altri patogeni/antigeni. Il terzo studio, intitolato “Modulazione fenotipica di: monociti CD14+, cellule natural killer (NK), T natural killer (NKT) e sottopopolazioni linfocitarie T CD4+ e CD8+ durante stimolazione con killer peptide (KP) nella specie suina” ha avuto come scopo quello di stabilire se e come il Peptide Killer (KP) potesse modulare la risposta immunitaria in termini di attivazione di specifiche sottopopolazioni linfocitarie. Si tratta di un approccio preliminare anche ai fini di successivamente valutare tale KP in un potenziale ruolo antivirale o come adiuvante. In questo lavoro, periferal blood mononuclear cells (PBMC) suine sono state stimolate con KP a tre diverse concentrazioni (10, 20 e 40 g/ml) per tre diversi tempi (24, 48 e 72 ore). TEMPI DI STIMOLAZIONE (ore) CONCENTRAZIONE DI KP (g/ml) 24 0-10-20-40 48 0-10-20-40 72 0-10-20-40 Mediante la citometria a flusso è stato dunque possibile analizzare il comportamento qualitativo e quantitativo di alcune sottopopolazioni linfocitarie sotto lo stimolo del KP, tra cui: monociti, cellule Natural Killer (NK), cellule T Natural Killer (NKT) e linfociti T CD4 e CD8+. Dai dati ottenuti è stato possibile dedurre che: 1) KP promuove un’attivazione dei monociti dose-dipendente in particolare dopo 24 ore di stimolazione, inducendo uno “shift” fenotipico e di maturazione monocitaria maggiormente coinvolto nel sostegno della risposta innata/infiammatoria. 2) KP induce una forte modulazione dose-dipendente di cellule NK e NKT con un forte aumento della frazione delle cellule NKT rispetto alle NK, sottopopolazioni entrambe coinvolte nella citotossicità cellulare mediata da anticorpi (ADCC). L’aumento è riscontrabile soprattutto dopo 24 ore di stimolazione. 3) KP promuove una significativa attivazione della sottopopolazione del linfociti T citotossici (CTL). 4) Per quanto riguarda la marcatura CD4+/CD8+ è stato dimostrato che KP ha la capacità di modulare sia il fenotipo T helper che T citotossico, inducendo le cellule T helper ad acquisire CD8 diventando quindi doppio positive (CD4+CD8+) ed inducendo il fenotipo CTL (CD4-CD8+high) ad acquisire il fenotipo doppio positivo (CD4+CD8α+high). Molti dunque potrebbero essere gli effetti che il decapeptide KP potrebbe esercitare sulle diverse sottopopolazioni del sistema immunitario, per questo motivo va evidenziata la necessità di impostare e attuare nuove ricerche che portino alla caratterizzazione di ciascuna “abilità” di KP e che conducano successivamente alla scoperta del migliore utilizzo che si possa fare del decapeptide sia dal punto di vista vaccinale, terapeutico oppure sotto forma di adiuvante vaccinale.

Modulação da diferenciação neural de células troco embrionárias por transientes de cálcio intracelulares: papéis dos receptores purinérgicos e de canais de cálcio voltagem-dependentes

Receptores purinérgicos e canais de cálcio voltagem-dependentes estão envolvidos em diversos processos biológicos como na gastrulação, durante o desenvolvimento embrionário, e na diferenciação neural. Quando ativados, canais de cálcio voltagem-dependentes e receptores purinérgicos do tipo P2, ativados por nucleotídeos, desencadeiam transientes de cálcio intracelulares controlando diversos processos biológicos. Neste trabalho, nós estudamos a participação de canais de cálcio voltagem-dependentes e receptores do tipo P2 na geração de transientes de cálcio espontâneos e sua regulação na expressão de fatores de transcrição relacionados com a neurogênese utilizando como modelo células tronco (CTE) induzidas à diferenciação em células tronco neurais (NSC) com ácido retinóico. Descrevemos que CTE indiferenciadas podem ter a proliferação acelerada pela ativação de receptores P2X7, enquanto que a expressão e a atividade desse receptor precisam ser inibidas para o progresso da diferenciação em neuroblasto. Além disso, ao longo da diferenciação neural, por análise em tempo real dos níveis de cálcio intracelular livre identificamos 3 padrões de oscilações espontâneas de cálcio (onda, pico e unique), e mostramos que ondas e picos tiveram a frequência e amplitude aumentadas conforme o andamento da diferenciação. Células tratadas com o inibidor do receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R), Xestospongin C, apresentaram picos mas não ondas, indicando que ondas dependem exclusivamente de cálcio oriundo do retículo endoplasmático pela ativação de IP3R. NSC de telencéfalo de embrião de camundongos transgênicos ou pré-diferenciadas de CTE tratadas com Bz-ATP, o agonista do receptor P2X7, e com 2SUTP, agonista de P2Y2 e P2Y4, aumentaram a frequência e a amplitude das oscilações espontâneas de cálcio do tipo pico. Dados, obtidos por microscopia de luminescência, da expressão em tempo real de gene repórter luciferase fusionado à Mash1 e Ngn2 revelou que a ativação dos receptores P2Y2/P2Y4 aumentou a expressão estável de Mash1 enquanto que ativação do receptor P2X7 levou ao aumento de Ngn2. Além disso, células na presença do quelante de cálcio extracelular (EGTA) ou do depletor dos estoques intracelulares de cálcio do retículo endoplasmático (thapsigargin) apresentaram redução na expressão de Mash1 e Ngn2, indicando que ambos são regulados pela sinalização de cálcio. A investigação dos canais de cálcio voltagem-dependentes demonstrou que o influxo de cálcio gerado por despolarização da membrana de NSC diferenciadas de CTE é decorrente da ativação de canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L. Além disso, esse influxo pode controlar o destino celular por estabilizar expressão de Mash1 e induzir a diferenciação neuronal por fosforilação e translocação do fator de transcrição CREB. Esses dados sugerem que os receptores P2X7, P2Y2, P2Y4 e canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L podem modular as oscilações espontâneas de cálcio durante a diferenciação neural e consequentemente alteram o padrão de expressão de Mash1 e Ngn2 favorecendo a decisão do destino celular neuronal.

Coherent electron dynamics in a two-dimensional random system with mobility edges

We study numerically the dynamics of a one-electron wavepacket in a two-dimensional random lattice with long-range correlated diagonal disorder in the presence of a uniform electric field. The time-dependent Schrodinger equation is used for this purpose. We find that the wavepacket displays Bloch-like oscillations associated with the appearance of a phase of delocalized states in the strong correlation regime. The amplitude of oscillations directly reflects the bandwidth of the phase and allows us to measure it. The oscillations reveal two main frequencies whose values are determined by the structure of the underlying potential in the vicinity of the wavepacket maximum.

Oxide Semiconductors For Organic Opto-electronic Devices

Development of transparent oxide semiconductors (TOS) from Earth-abundant materials is of great interest for cost-effective thin film device applications, such as solar cells, light emitting diodes (LEDs), touch-sensitive displays, electronic paper, and transparent thin film transistors. The need of inexpensive or high performance electrode might be even greater for organic photovoltaic (OPV), with the goal to harvest renewable energy with inexpensive, lightweight, and cost competitive materials. The natural abundance of zinc and the wide bandgap ($sim$3.3 eV) of its oxide make it an ideal candidate. In this dissertation, I have introduced various concepts on the modulations of various surface, interface and bulk opto-electronic properties of ZnO based semiconductor for charge transport, charge selectivity and optimal device performance. I have categorized transparent semiconductors into two sub groups depending upon their role in a device. Electrodes, usually 200 to 500 nm thick, optimized for good transparency and transporting the charges to the external circuit. Here, the electrical conductivity in parallel direction to thin film, i.e bulk conductivity is important. And contacts, usually 5 to 50 nm thick, are optimized in case of solar cells for providing charge selectivity and asymmetry to manipulate the built in field inside the device for charge separation and collection. Whereas in Organic LEDs (OLEDs), contacts provide optimum energy level alignment at organic oxide interface for improved charge injections. For an optimal solar cell performance, transparent electrodes are designed with maximum transparency in the region of interest to maximize the light to pass through to the absorber layer for photo-generation, plus they are designed for minimum sheet resistance for efficient charge collection and transport. As such there is need for material with high conductivity and transparency. Doping ZnO with some common elements such as B, Al, Ga, In, Ge, Si, and F result in n-type doping with increase in carriers resulting in high conductivity electrode, with better or comparable opto-electronic properties compared to current industry-standard indium tin oxide (ITO). Furthermore, improvement in mobility due to improvement on crystallographic structure also provide alternative path for high conductivity ZnO TCOs. Implementing these two aspects, various studies were done on gallium doped zinc oxide (GZO) transparent electrode, a very promising indium free electrode. The dynamics of the superimposed RF and DC power sputtering was utilized to improve the microstructure during the thin films growth, resulting in GZO electrode with conductivity greater than 4000 S/cm and transparency greater than 90 %. Similarly, various studies on research and development of Indium Zinc Tin Oxide and Indium Zinc Oxide thin films which can be applied to flexible substrates for next generation solar cells application is presented. In these new TCO systems, understanding the role of crystallographic structure ranging from poly-crystalline to amorphous phase and the influence on the charge transport and optical transparency as well as important surface passivation and surface charge transport properties. Implementation of these electrode based on ZnO on opto-electronics devices such as OLED and OPV is complicated due to chemical interaction over time with the organic layer or with ambient. The problem of inefficient charge collection/injection due to poor understanding of interface and/or bulk property of oxide electrode exists at several oxide-organic interfaces. The surface conductivity, the work function, the formation of dipoles and the band-bending at the interfacial sites can positively or negatively impact the device performance. Detailed characterization of the surface composition both before and after various chemicals treatment of various oxide electrode can therefore provide insight into optimization of device performance. Some of the work related to controlling the interfacial chemistry associated with charge transport of transparent electrodes are discussed. Thus, the role of various pre-treatment on poly-crystalline GZO electrode and amorphous indium zinc oxide (IZO) electrode is compared and contrasted. From the study, we have found that removal of defects and self passivating defects caused by accumulation of hydroxides in the surface of both poly-crystalline GZO and amorphous IZO, are critical for improving the surface conductivity and charge transport. Further insight on how these insulating and self-passivating defects cause charge accumulation and recombination in an device is discussed. With recent rapid development of bulk-heterojunction organic photovoltaics active materials, devices employing ZnO and ZnO based electrode provide air stable and cost-competitive alternatives to traditional inorganic photovoltaics. The organic light emitting diodes (OLEDs) have already been commercialized, thus to follow in the footsteps of this technology, OPV devices need further improvement in power conversion efficiency and stable materials resulting in long device lifetimes. Use of low work function metals such as Ca/Al in standard geometry do provide good electrode for electron collection, but serious problems using low work-function metal electrodes originates from the formation of non-conductive metal oxide due to oxidation resulting in rapid device failure. Hence, using low work-function, air stable, conductive metal oxides such as ZnO as electrons collecting electrode and high work-function, air stable metals such as silver for harvesting holes, has been on the rise. Devices with degenerately doped ZnO functioning as transparent conductive electrode, or as charge selective layer in a polymer/fullerene based heterojunction, present useful device structures for investigating the functional mechanisms within OPV devices and a possible pathway towards improved air-stable high efficiency devices. Furthermore, analysis of the physical properties of the ZnO layers with varying thickness, crystallographic structure, surface chemistry and grain size deposited via various techniques such as atomic layer deposition, sputtering and solution-processed ZnO with their respective OPV device performance is discussed. We find similarity and differences in electrode property for good charge injection in OLEDs and good charge collection in OPV devices very insightful in understanding physics behind device failures and successes. In general, self-passivating surface of amorphous TCOs IZO, ZTO and IZTO forms insulating layer that hinders the charge collection. Similarly, we find modulation of the carrier concentration and the mobility in electron transport layer, namely zinc oxide thin films, very important for optimizing device performance.

Impurity states in the quantum spin Hall phase in graphene

Two-dimensional insulators with time-reversal symmetry can have two topologically different phases, the quantum spin Hall and the normal phase. The former is revealed by the existence of conducting edge states that are topologically protected. Here we show that the reaction to impurity, in bulk, is radically different in the two phases and can be used as a marker for the topological phase. Within the context of the Kane-Mele model for graphene, we find that strictly normalizable in-gap impurity states only occur in the quantum spin Hall phase and carry a dissipationless current whose chirality is determined by the spin and pseudospin of the residing electron.

Atmospheric PM and volatile organic compounds released from Mediterranean shrubland wildfires

Wildfires produce a significant release of gases and particles affecting climate and air quality. In the Mediterranean region, shrublands significantly contribute to burned areas and may show specific emission profiles. Our objective was to depict and quantify the primary-derived aerosols and precursors of secondary particulate species released during shrubland experimental fires, in which fire-line intensity values were equivalent to those of moderate shrubland wildfires, by using a number of different methodologies for the characterization of organic and inorganic compounds in both gas-phase and particulate-phase. Emissions of PM mass, particle number concentrations and organic and inorganic PMx components during flaming and smouldering phases were characterized in a field shrubland fire experiment. Our results revealed a clear prevalence of K+ and SO42- as inorganic ions released during the flaming-smouldering processes, accounting for 68 to 80% of the inorganic soluble fraction. During the residual-smouldering phases, in addition to K+ and SO42-, Ca2+ was found in significant amounts probably due the predominance of re-suspension processes (ashes and soil dust) over other emission sources during this stage. Concerning organic markers, the chromatograms were dominated by phenols, n-alkanals and n-alkanones, as well as by alcohol biomarkers in all the PMx fractions investigated. Levoglucosan was the most abundant degradation compound with maximum emission factors between 182 and 261 mg kg-1 in PM2.5 and PM10 respectively. However, levoglucosan was also observed in significant amounts in the gas-phase. The most representative organic volatile constituents in the smoke samples were alcohols, carbonyls, acids, monocyclic and bicyclic arenes, isoprenoids and alkanes compounds. The emission factors obtained in this study may contribute to the validation and improvement of national and international emission inventories of this intricate and diffuse emission source.

Solubility, Density, Refractive Index, and Viscosity for the Polyhydric Alcohol + CsBr + H2O Ternary Systems at Different Temperatures

The solubility, density, refractive index, and viscosity data for the ethylene glycol + CsBr + H2O, 1,2-propanediol + CsBr + H2O, and glycerin + CsBr + H2O ternary systems have been determined at (288.15, 298.15, and 308.15) K. In all cases, the solubility of CsBr in aqueous solutions was decreased significantly due to the presence of polyhydric alcohol. The liquid–solid equilibrium experimental data were correlated using the NRTL (nonrandom two-liquid) activity coefficient model, considering nondissociation of the dissolved salt in the liquid phase, and new interaction parameters were estimated. The mean deviations between calculated and experimental compositions were low, showing the good descriptive quality and applicability of the NRTL model. The refractive indices, densities, and viscosities for the unsaturated solutions of the three ternary systems have also been measured at three temperatures. Values for all of the properties were correlated with the salt concentrations and proportions of polyhydric alcohol in the solutions.

Effect of Temperature, Atmosphere and Metals on the Thermal Degradation of Printed Circuit Boards

The permanent expansion of the market of electrical and electronic equipment (EEE) and the shorter innovation cycles, lead to a faster replacement of these appliances, making EEE a fast-growing source of waste (WEEE). As stated in Directive 2012/19/EU1 on waste electrical and electronic equipment, the content of hazardous components in EEE is a major concern during the waste management phase, and recycling of WEEE is not currently undertaken to a sufficient extent, resulting in a loss of valuable resources.

On the formation and evolution of the first Be star in a black hole binary MWC 656

We find that the formation of MWC 656 (the first Be binary containing a black hole) involves a common envelope phase and a supernova explosion. This result supports the idea that a rapidly rotating Be star can emerge out of a common envelope phase, which is very intriguing because this evolutionary stage is thought to be too fast to lead to significant accretion and spin up of the B star. We predict ∼10–100 of B-BH binaries to currently reside in the Galactic disc, among which around 1/3 contain a Be star, but there is only a small chance to observe a system with parameters resembling MWC 656. If MWC 656 is representative of intrinsic Galactic Be-BH binary population, it may indicate that standard evolutionary theory needs to be revised. This would pose another evolutionary problem in understanding black hole (BH) binaries, with BH X-ray novae formation issue being the prime example. Future evolution of MWC 656 with an ∼5 M⊙ BH and with an ∼13 M⊙ main-sequence companion on an ∼60 d orbit may lead to the formation of a coalescing BH–NS (neutron star) system. The estimated Advanced LIGO/Virgo detection rate of such systems is up to ∼0.2 yr−1. This empirical estimate is a lower limit as it is obtained with only one particular evolutionary scenario, the MWC 656 binary. This is only a third such estimate available (after Cyg X-1 and Cyg X-3), and it lends additional support to the existence of so far undetected BH–NS binaries.

Visions of the Spanish Revolution: identities and conflicts in post-welfare societies

This is a case study that analyzes photographic documents of the social protest in Spain between 2011 and 2013. The analysis is qualitative and considers the use of space, the visual expression of the messages and the orientation toward the causes or effects of political, economic and social changes. Visual sociology allows us to appreciate, in the case of the Spanish Revolution, a dynamic of “reflexivity” unrecognizable from other research approaches. Two successive waves of social mobilization in response to two different shocks can be appreciated. The first is given by political corruption, unemployment and the threat to consumer society. The second shock is caused by the savage cuts in the Welfare State. Social mobilization is expressed differently in each phase, and the forms taken by the protests show how the class structure in post industrial society shapes the reactions to the crisis of the Welfare State.

Noncollinear magnetic phases and edge states in graphene quantum Hall bars

Application of a perpendicular magnetic field to charge neutral graphene is expected to result in a variety of broken symmetry phases, including antiferromagnetic, canted, and ferromagnetic. All these phases open a gap in bulk but have very different edge states and noncollinear spin order, recently confirmed experimentally. Here we provide an integrated description of both edge and bulk for the various magnetic phases of graphene Hall bars making use of a noncollinear mean field Hubbard model. Our calculations show that, at the edges, the three types of magnetic order are either enhanced (zigzag) or suppressed (armchair). Interestingly, we find that preformed local moments in zigzag edges interact with the quantum spin Hall like edge states of the ferromagnetic phase and can induce backscattering.

National Minorities, Nationalizing States, and External National Homelands in the New Europe. Notes toward a Relational Analysis. Institute of Advanced Studies Political Science Series, 11 December 1993

Nationalism remains central to politics in and among the new nation-states. Far from »solving« the region's national question, the most recent reconfiguration of political space – the replacement of the Soviet Union, Yugoslavia, and Czechoslovakia by some twenty would-be nation-states – only recast it in a new form. It is this new phase and form of the national question that I explore in this paper. I begin by outlining a particular relational configuration – the triadic relational nexus between national minorities, nationalizing states, and external national homelands – that is central to the national question in post-Soviet Eurasia. In the second, and most substantial, section of the paper, I argue that each of the »elements« in this relational nexus – minority, nationalizing state, and homeland – should itself be understood in dynamic and relational terms, not as a fixed, given, or analytically irreducible entity but as a field of differentiated positions and an arena of struggles among competing »stances.« In a brief concluding section, I return to the relational nexus as a whole, underscoring the dynamically interactive quality of the triadic interplay.