Investigação de mecanismos genéticos e epigenéticos em distúrbios do crescimento humano

Parcela considerável de pacientes com distúrbios de crescimento não têm a causa de seus quadros clínicos estabelecida, incluindo aproximadamente 50% dos pacientes com diagnóstico clínico de síndrome de Silver−Russell (SRS) e 10-20% dos pacientes com síndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS). O objetivo deste estudo foi investigar as causas genéticas e epigenéticas de distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida, numa contribuição para o entendimento de mecanismos que regulam o crescimento. O estudo compreendeu: (1) a investigação de microdesequilíbrios cromossômicos, por aCGH; (2) a análise do perfil de expressão alelo-específica de genes sujeitos a imprinting (IG), por pirossequenciamento (PSQ) ou sequenciamento de Sanger; (3) a investigação do padrão de metilação global em pacientes com restrição de crescimento, utilizando microarray de metilação. A casuística constituiu-se de 41 pacientes não aparentados, com distúrbios de crescimento, de etiologia desconhecida: (1) 25, com hipótese diagnóstica de SRS; (2) seis, com restrição de crescimento intrauterino e peso ao nascimento abaixo do 10º percentil, associados a outros sinais clínicos; (3) sete, com hipótese diagnóstica de BWS; e (4) três, com macrossomia pré-natal ou pós-natal, associada a outros sinais. A investigação de microdesequilíbrios cromossômicos foi realizada em 40 pacientes. Foram detectadas 58 variantes raras em 30/40 pacientes (75%): 40 foram consideradas provavelmente benignas (18 pacientes, 45%), 12, com efeito patogênico desconhecido (11 pacientes, 27,5%), duas, provavelmente patogênicas (um paciente, 2,5%) e quatro, patogênicas (três pacientes, 7,5%). Essas frequências são comparáveis àquelas descritas em estudos que investigaram CNV em grupos de pacientes com distúrbios de crescimento e outras alterações congênitas, incluindo SRS, e mostram a importância da investigação de microdesequilíbrios cromossômicos nesses pacientes. A diversidade dos microdesequilíbrios cromossômicos identificados é reflexo da heterogeneidade clínica das casuísticas. Neste estudo, muitos dos pacientes com hipótese diagnóstica de SRS e BWS apresentavam sinais clínicos atípicos, explicando a ausência neles das alterações (epi)genéticas que causam essas síndromes. A identificação de CNV características de outras síndromes reflete a sobreposição de sinais clínicos com BWS e SRS. A análise do perfil de expressão alelo-específica de IG foi realizada em um subgrupo de 18 pacientes com restrição de crescimento. Trinta IG com função em proliferação celular, crescimento fetal ou neurodesenvolvimento foram inicialmente selecionados. Após seleção de SNP transcritos com alta frequência na população, genotipagem de pacientes, genitores e indivíduos controle, determinação da expressão dos IG em sangue periférico e seu padrão de expressão (mono ou bialélico), 13 IG, expressos no sangue, tiveram a expressão alelo-específica avaliada, sete deles por PSQ e seis por sequenciamento de Sanger. Alterações no perfil de expressão de dois genes, de expressão normalmente paterna, foram detectadas em 4/18 pacientes (22%). Este estudo é o primeiro a utilizar pirossequenciamento e sequenciamento de Sanger na avaliação do perfil de expressão alelo-específica de IG, em pacientes com restrição de crescimento. Apesar de terem limitações, ambas as técnicas mostraram-se robustas e revelaram alterações de expressão alélica interessantes; entretanto, a relação dessas alterações com o quadro clínico dos pacientes permanece por esclarecer. A investigação da metilação global do DNA foi realizada em subgrupo de 21 pacientes com restrição de crescimento e em 24 indivíduos controle. Dois tipos de análise foram realizados: (1) análise diferencial de grupo e (2) análise diferencial individual. Na primeira análise, em que foi comparado o padrão de metilação do grupo de pacientes com quadro clínico sugestivo de SRS (n=16) com o do grupo controle (n=24), não houve indicação de hipo ou hipermetilação global no grupo SRS. Na segunda análise, foi comparado o padrão de metilação de cada um dos 21 pacientes com restrição de crescimento e dos 24 indivíduos controle, com o padrão de metilação do grupo controle. O número médio de CpG hipermetilados e de segmentos diferencialmente metilados (SDM) foi significativamente maior nos pacientes. Foram identificados 82 SDM hipermetilados, estando 57 associados a gene(s) (69,5%), em 16 pacientes, e 51 SDM hipometilados, 41 deles associados a gene(s) (80,4%), em 10 pacientes. A análise de ontologia genética dos 61 genes associados aos SDM hipo ou hipermetilados nos pacientes destacou genes que atuam no desenvolvimento e na morfogênese do sistema esquelético e de órgãos fetais, e na regulação da transcrição gênica e de processos metabólicos. Alterações de metilação em genes que atuam em processos de proliferação e diferenciação celulares e crescimento foram identificadas em 9/20 dos pacientes (45%), sugerindo implicação clínica. Não foi detectada alteração epigenética comum aos pacientes com diagnóstico clínico de SRS, explicável provavelmente pela heterogeneidade clínica. A investigação de metilação global, utilizando microarray, produziu novos dados que podem contribuir para a compreensão de mecanismos moleculares que influenciam o crescimento pré- e pós-natal. Na translocação aparentemente equilibrada - t(5;6)(q35.2;p22.3)dn, detectada em paciente com suspeita clínica de SRS, a interrupção de um gene, pela quebra no cromossomo 6, pode ser a causa do quadro clínico; alternativamente, a translocação pode ter impactado a regulação de genes de desenvolvimento localizados próximos aos pontos de quebra. A análise de expressão em sangue periférico mostrou que os níveis de cDNA do gene, interrompido pelo ponto de quebra da translocação, estavam reduzidos à metade. Além de sinais típicos da SRS, a paciente apresentava algumas características clínicas sugestivas de displasia cleidocraniana. Assim, a translocação t(5;6) pode ter alterado a interação de genes de desenvolvimento e seus elementos reguladores, levando à desregulação de sua expressão espaço-temporal, e resultando num fenótipo atípico, com características sobrepostas de mais de uma síndrome genética

Desenvolvimento e validação de métodos bioanalíticos para o monitoramento dos produtos das vias metabólicas do triptofano em linhagem celular de glioma humano

O metabolismo do triptofano (Trp) se dá pela via das quinureninas (QUIN), pela via serotoninérgica (SER) e pela via das aminas traço. A primeira gera QUIN e uma variedade de outros metabólitos secundários. Quando conduzida pela enzima indolamina 2,3 dioxigenase (IDO) contribui para os fenômenos de tolerância e imune escape de células tumorais; e quando conduzida pela triptofano 2,3 dioxigenase (TDO) no fígado, participa na síntese da niacina e NAD. A via SER leva à formação do neurotransmissor serotonina (SER), que pode gerar o hormônio melatonina (MEL), respectivamente e outros metabólitos biologicamente ativos. Outra via menos estudada, a via das aminas traço, produz produtos neuroativos. Dada a abrangência e importância das rotas metabólicas do Trp, nós desenvolvemos e validamos uma metodologia bioanalítica robusta, seletiva e sensível por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), acoplado espectrometria de massas (MS) para a determinação simultânea do Trp e seus 15 metabólitos. Para tanto, escolhemos para a avaliação das três vias, linhagens de glioma humano. A escolha por este tipo celular deveu-se ao grande interesse de estudos de metabolismo de Trp em células tumorais, no qual células de glioma tem sido modelo. Nos ensaios com as células de glioma acompanhamos os efeitos de um indutor e inibidores da primeira etapa de metabolização do Trp pela via das quinureninas, ou seja, IFN-γ (indutor da IDO), 1-metiltriptofano (1-MT; inibidor competitivo da IDO) e 680C91 (inibidor seletivo da TDO). Pudemos observar o impacto que a indução ou a inibição do primeiro passo teve sobre os metabólitos subsequentes e as diferenças no metabolismo das duas linhagens estudadas, A172 e T98G. A linhagem T98G só tem atividade de IDO, enquanto que a A172 tem tanto atividade IDO quanto TDO. A indução por IFN-γ mostrou que essa citocina não só atua na formação da via QUIN, mas possui um impacto modesto nas demais rotas. Observamos também que a inibição do 1-MT mostrou seu impacto nos metabólitos invdividualmente, do que a simples relação Trp-QUIN. Contudo, nosso resultados nos permitiu mostrar pela primeira vez a descrição completa dessas vias, em especial nessas linhagens celulares, podendo supor estratégias terapêuticas nessas rotas que estão relacionadas a progressão ou não tumoral.

Contribuição das células-tronco mesenquimais para as propriedades tumorigênicas de células de glioblastoma humano

Células-tronco mesenquimais (CTM) apresentam tropismo a tumores, sendo importantes componentes do estroma tumoral. No cérebro, o nicho perivascular é uma importante fonte de CTM, as quais podem contribuir direta e/ou indiretamente para o desenvolvimento de tumores, embora os mecanismos envolvidos sejam pouco conhecidos. No presente trabalho, investigou-se a influência de CTM sobre a proliferação, capacidade invasiva e tumorigenicidade de células de Glioblastoma (GBM) humano. Sabe-se que CTM produzem TGFB1, uma citocina multifuncional envolvida em imunomodulação, proliferação, migração e transição epitelial-mesenquimal de células tumorais. Experimentos in vitro, realizados com meios condicionados de CTM de cordão umbilical humano com silenciamento permanente do gene TGFB1, demonstraram que o TGFB1 secretado por CTM é capaz de aumentar significativamente a proliferação e viabilidade de células de GBM humano da linhagem U87FP635. Esses resultados revelam uma importante ação parácrina dessa citocina regulatória, quando produzida por outros tipos celulares contidos no microambiente tumoral. Entretanto, sob condições experimentais que melhor mimetizam o microambiente tumoral, detectou-se que CTM também afetam o comportamento de células tumorais por um mecanismo alternativo, dependente de contato celular, mas independente dos níveis de TGFB1 secretados pelas CTM. Sob condições de cocultivo celular, envolvendo contato físico entre CTM e células de GBM U87FP635, detectou-se um aumento significativo na quantidade de células tumorais viáveis. Quando cultivadas na forma de esferoides tumorais, o contato com CTM aumentou a capacidade invasiva das células U87FP635. Finalmente, em modelo in vivo ectópico de GBM, células U87FP635 geraram tumores mais desenvolvidos quando coinjetadas com CTM. Esses efeitos pró-tumorigênicos foram observados tanto em contato com CTM controles, quanto com CTM contendo o gene TGFB1 permanentemente silenciado. Assim, esses achados indicam que CTM podem exercer efeitos pró-tumorigênicos por dois mecanismos alternativos e independentes: ação parácrina de TGFB1 secretado por CTM e ação mediada por contato célula-célula. Nas condições experimentais testadas, o mecanismo dependente de contato célula-célula demonstrou ser predominante. O estudo proteômico do secretoma dessas células identificou 126 proteínas diferencialmente expressas além de 10 proteínas exclusivamente detectadas em meios condicionados de cocultivos de CTM com células de GBM U87FP635. Cerca de 80% dessas proteínas exclusivamente secretadas pelo contato célula-célula são componentes de exossomos e estão envolvidas em proliferação celular e desenvolvimento tecidual. Esses resultados apontam uma interação dinâmica de comunicação entre CTM e células tumorais, e revelam algumas proteínas interessantes potencialmente envolvidas em uma ação pró-tumorigênica de CTM mediada por contato celular

Gobernanza del agua en México 1984-2014: derecho humano al agua, relaciones intergubernamentales y la construcción de ciudadanía

El propósito de ésta disertación es contribuir a la literatura de ciencias sociales sobre gobierno y administración pública utilizando un caso de suministro de agua urbana como un modelo de entrega de servicios públicos y analizándolo desde varias perspectivas teóricas. Esto ilumina los procesos sociopolíticos que son de interés a teóricos y practicantes de la investigación en administración pública. El caso del agua y del suministro del vital líquido en contextos urbanos es extremadamente interesante y relevante para aquellos que estudian teorías de la política pública, ya que es fundamental como recurso natural al ayudar a la producción de bienes y servicios para el consumo de la sociedad. Al mismo tiempo, el agua es un recurso de interés público dada su escasez y la necesidad de una infraestructura robusta que se requiere para suministrarlo a poblaciones urbanas y rurales. Esto hace que el diseño de reglas, normas, leyes e instrumentos de política pública sea uno de los elementos fundamentales al decidir mecanismos de gobernanza sobre cómo se extrae el agua, se distribuye, se consume, se dispone, se trata y se recicla en un sistema urbano de ciclo cerrado. Además, el problema de la entrega del servicio público de agua presenta características que lo hacen ideal para ser analizado con herramientas analíticas de la literatura sobre políticas públicas, dado que para resolver éste complejo rompecabezas es necesario traer teorías de implementación de la política pública, teorías de construcción de la agenda, de toma de decisiones, etc. Si bien la gestión del agua en zonas agrícolas es absolutamente importante, en ésta tesis el análisis se enfoca primariamente en la gobernanza de agua urbana. Hay tres razones fundamentales para la utilización de este criterio de selección de casos. En primer lugar, el crecimiento exponencial de las ciudades ha conllevado un incremento substancial en la población que requiere suministro público de agua. En segundo lugar, aun cuando la producción agrícola y ganadera son los sectores industriales que consumen más agua en México, también son los sectores que están enviando más individuos en edad laboral a su relocalización a áreas urbanas...

Investigação da atividade apoptótica na abertura luminal dos ductos das glândulas salivares: análise comparativa entre modelo animal e humano

As glândulas salivares são estruturas essenciais para a manutenção da homeostase da cavidade oral pela síntese e secreção do fluido salivar. A disfunção ou perda permanente das glândulas salivares causadas por radioterapia, doenças inflamatórias ou desordens congênitas elevam principalmente o risco de infecções da mucosa oral e de estruturas dentárias, além de potencialmente prejudicar funções fisiológicas como fala, mastigação e paladar, diretamente interferindo na qualidade de vida dos indivíduos afetados. Os tratamentos atualmente disponíveis são apenas paliativos, ressaltando a necessidade de se compreender melhor os processos embriogênicos a fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas capazes de regenerar as glândulas salivares. O princípio da formação das glândulas salivares baseia-se na coordenação de diversos processos morfogenéticos, e este trabalho foca particularmente em investigar a formação do espaço luminal do sistema de ductos, uma vez que a adequada abertura dos lumens é um processo essencial para a secreção salivar. Relata-se que a remoção das células centrais dos cordões sólidos epiteliais por morte celular apoptótica é o principal mecanismo de abertura do espaço luminal dos futuros ductos glandulares em camundongos. Porém, pouco se sabe sobre o controle temporal da apoptose durante o desenvolvimento glandular e sobre seu comportamento em glândulas salivares humanas. Neste trabalho, o perfil de expressão de diversas proteínas envolvidas na cascata apoptótica em glândulas salivares fetais humanas foi analisado de acordo com cada estágio morfogenético por imunoistoquímica (Bax, Bak, Bad, Bid, Bcl-2, Bcl-x, Bcl-xL, caspase-3 clivada, caspases-6, -7 e -9, apaf-1, survivina e citocromo c). As análises semi-qualitativas resultaram em negatividade apenas para as proteínas Bcl-2, Bad, Bid e caspase-3 clivada em todas as fases de desenvolvimento. A expressão nuclear de Bax e Bak foi identificada em presumidos espaços luminais em estágios precoces, enquanto Bcl-xL foi o fator antiapoptótico da família Bcl-2 que exibiu expressão nuclear mais importante. Caspases-6, -7 e -9 foram positivas em todas as fases, e a ausência de caspase-3 clivada sugere caspase-7 como principal caspase efetora da apoptose em desenvolvimento de glândulas salivares humanas. Ambos os componentes do complexo apoptossomo foram positivos durante o desenvolvimento glandular, e o inibidor survivina demonstrou mais positividade nuclear em estágios mais avançados. Ao observar a expressão de reguladores apoptóticos durante o desenvolvimento glandular humano, foram realizados experimentos funcionais com culturas de tecido glandular de camundongos para avaliar o papel das caspases durante a formação desta estrutura. Inicialmente detectou-se a atividade apoptótica em glândulas salivares de camundongos albinos no centro dos cordões epiteliais primários a partir de estágios precoces de desenvolvimento através de TUNEL e caspase-3 clivada. A partir disso, foi realizada a inibição apoptótica funcional in vitro durante o mesmo período, que resultou em ductos significativamente mais amplos e em defeitos morfológicos importantes nas estruturas luminal e acinar. Este trabalho evidenciou portanto atividade apoptótica durante a formação de glândulas salivares humanas e de camundongo, expressando-se em fases mais precoces do que reportadas anteriormente. Além disso, a ausência de Bad e Bid indica que a via intrínseca está mais ativa que a extrínseca, e distintos perfis de expressão da maioria das moléculas sugere adicionais funções não-apoptóticas durante a morfogênese glandular.

Un desarrollo territorial sustentable. Una propuesta desde el desarrollo humano y las metodologías participativas. Revisión de los programas europeos

En la presente obra se aborda el Desarrollo Territorial desde los prismas de las teorizaciones que lo informan, las metodologías que lo hacen operativo y las políticas y prácticas que permiten su implementación. Dicho abordaje se realiza partiendo de una premisa, la de la Sustentabilidad, entendida como el prerrequisito ético que debe impulsar la acción humana que conduzca a la mejora de las condiciones de vida y trabajo de la humanidad, atendiendo sus necesidades básicas de forma equilibrada con el sistema ecológico en el que se sustenta nuestra existencia y sin comprometer la atención de esas necesidades para las generaciones futuras. La premisa de la Sustentabilidad opera por tanto como el marco referencial desde el que proceder a la aplicación de los análisis sobre el objeto de estudio, sirviendo de elemento de contraste de las teorías, metodologías y prácticas analizadas. La finalidad última de esta investigación es aportar una propuesta de modelo de Desarrollo Territorial Sustentable. Para ello se hace una revisión crítica de las principales teorizaciones que han abordado esta temática desde distintas disciplinas como la Economía, la Ecología, la Geografía y la Gestión Pública, teniendo a la Sociología como eje vertebrador del análisis. Esas teorizaciones se concentran en el ámbito de la Economía Regional, la Economía Ecológica y las teorías de las Necesidades Humanas, con aportaciones de la perspectiva Eco-feminista. Así mismo, se procede a la revisión de los programas europeos centrados en el desarrollo territorial y más en concreto se analiza la política regional de la Unión Europea, con el objetivo de extraer elementos operativos que resulten útiles para terminar de completar la propuesta de modelo de Desarrollo Territorial Autocentrado Sustentable, en orden a desplegar los elementos referenciales y operativos de la metodología de aplicación de dicho modelo. Para este último objetivo se procede también a la revisión de los diversos referentes teóricos y metodológicos que pueden informar una metodología participativa reflexivo dialógica para el Desarrollo Territorial Sustentable. Esta investigación incluye el estudio más pormenorizado de la aplicación de programas europeos de desarrollo en dos territorios. Uno respecto a programas de desarrollo rural desarrollados por la asociación “In Loco” en la Serra do Caldeirâo (Algarve portugués), y otro en el ámbito urbano, en el barrio de La Mina (Área metropolitana de Barcelona), liderado por Fundación CIREM. Como conclusión central de la investigación se mantiene que, desde el paradigma de la Sustentabilidad, es necesario que las teorizaciones sobre el desarrollo territorial y las metodologías y prácticas que lo implementan, se incrusten sistémicamente en un cambio axiológico histórico que propicie políticas para construir de forma reflexiva y dialógica un nuevo Contrato Social Sustentable para el conjunto de la Humanidad.

Reconstrucción de estrategias de explotación de recursos animales por el ser humano

Los criterios que actualmente encontramos para reconstruir determinadas actividades de subsistencia llevadas a cabo por los seres humanos sobre carcasas adquiridas en actividades cinegéticas no son suficientes para saber con la mayor certeza posible qué estaba ocurriendo en algunos yacimientos. El objetivo principal de este trabajo es dar respuesta a aquellas cuestiones difusas que hacen que no podamos ver más allá de lo que realmente está ocurriendo. Este estudio se centra en dos vertientes, por una lado la tafonómica, a través de la experimentación, con el objetivo de crear sólidos criterios que permitan distinguir a través de las marcas de corte halladas en las epífisis y metadiáfisis de los huesos largos (habitualmente son las partes óseas mejor conservadas), qué tipo de actividades, bien descarnado o desarticulado, eran realizadas por los seres humanos y de qué manera o qué herramientas resultaban más efectivas para dichas tareas. Hasta el momento, tan sólo dos estudios se han centrado en esta cuestión, Binford (1981) y Nilssen (2000). En el primero, los experimentos se realizaron sin ningún tipo de control y con cuchillos de metal, y en el caso del segundo, aunque se estableció un exhaustivo control en los experimentos, fue realizado en su totalidad con herramientas de metal. Estos motivos cuestionan su fiabilidad si queremos crear marcos referenciales que sean aplicados a contextos prehistóricos. Así, surge la necesidad de crear dichos marcos referenciales bajo rigor absoluto, cómo es la utilización de herramientas líticas que nos permitan establecer patrones con el objetivo de discernir las actividades de aprovechamiento de los recursos animales. Por otro lado, también se va a basar en un estudio osteométrico, con el objetivo de sexar individuos, debido a que sabemos que algunos carnívoros depredan sobre edades y sexos determinados en función de una presa u otra, por lo que el objetivo es conocer si el ser humano también muestra algún tipo de preferencia a la hora de acceder a los recursos cárnicos...

Mais além dos muros: o amor, a morte e os limites do humano em Rútilo nada, de Hilda Hilst

Esta dissertação procura analisar as configurações do humano e de seus limites no conto Rútilo nada, de Hilda Hilst. A questão das fronteiras do humano foi estudada a partir de uma análise da abordagem de Hilda Hilst aos temas da morte e do amor, bem como de uma interpretação das imagens de animalidade presentes no texto.