Role of the triad N46, S106 and T107 and the surface charges in the determination of the acidic pH optimum of digestive lysozymes from Musca domestica

Structures of digestive lysozymes 1 and 2 from housefly (MdL1 and MdL2) show that S106-T107 delimit a polar pocket around E32 (catalytic acid/base) and N46 contributes to the positioning of 050 (catalytic nucleophile), whereas those residues are replaced by V109-A110 and D48 in the non-digestive lysozyme from hen egg-white (HEWL). Further analyses revealed that MdL1 and MdL2 surfaces are less positively charged than HEWL surface. To verify the relevance of these differences to the acidic pH optimum of digestive lysozymes it was determined that pKas of the catalytic residues of the triple mutant MdL2 (N46D-S106V-T107A) are similar to HEWL pKas and higher than those for MdL2. In agreement, triple mutant MdL2 and HEWL exhibits the same pH optimum upon methylumbelliferylchitotrioside. In addition to that, the introduction of six basic residues on MdL1 surface increased by 1 unit the pH optimum for the activity upon bacterial walls. Thus, the acidic pH optimum for MdL2 and MdL1 activities upon methylumbelliferylchitotrioside is determined by the presence of N46, S106 and T107 in the environment of their catalytic residues, which favors pKas reduction. Conversely, acidic pH optimum upon bacterial walls is determined by a low concentration of positive charges on the MdL2 and MdL1 surfaces. (C) 2010 Elsevier Inc. All rights reserved.

Short terms effects of air pollution from biomass burning in mucociliary clearance of Brazilian sugarcane cutters

Nasal mucociliary system is the first line of defense of the upper airways and may be affected acutely by exposure to particulate matter (PM) from biomass burning. Several epidemiologic studies have demonstrated a consistent association between levels of air pollution from biomass burning with increases in hospitalization for respiratory diseases and mortality. To determine the acute effects of exposure to particulate matter from biomass burning in nasal mucociliary transport by saccharin transit time (STT) test, we studied thirty-three non-smokers and twelve light smokers sugarcane cutters in two periods: pre-harvest season and 4 h after harvest at the first day after biomass burning. Lung function, exhaled carbon monoxide (CO), nasal symptoms questionnaire and mucociliary clearance (MC) were assessed. Exhaled CO was increased in smokers compared to non-smokers but did not change significantly after harvest. In contrast, SIT was similar between smokers and non-smokers and decreased significantly after harvest in both groups (p < 0.001). Exposure to PM from biomass burning did not influence nasal symptoms. Our results suggest that acute exposure to particulate matter from sugarcane burned affects mucociliary clearance in smokers and non-smokers workers in the absence of symptoms. (C) 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Characterization and Identification of Proteolytic Bacteria From the Gut of the Velvetbean Caterpillar (Lepidoptera: Noctuidae)

The characterization and identification of proteolytic bacteria from the gut of the velvetbean caterpillar (Anticarsia gemmatalis) were the objectives of this study. Twelve aerobic and anaerobic isolates of proteolytic bacteria were obtained from the caterpillar gut in calcium caseinate agar. The number of colony forming units (CFUs) of proteolytic bacteria was higher when the bacteria were extracted from caterpillars reared on artificial diet rather than on soybean leaves (1.73 +/- 0.35 X 10(3) and 0.55 +/- 0.22 X 10(3) CFU/mg gut, respectively). The isolated bacteria were divided into five distinct groups, according to their polymerase chain reaction restriction fragment-length polymorphism profiles. After molecular analysis, biochemical tests and fatty acid profile determination, the bacteria were identified as Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Enterococcus gallinarum, Enterococcus mundtii, and Staphylococcus xylosus. Bacterial proteolytic activity was assessed through in vitro colorimetric assays for (general) proteases, serine proteases, and cysteine proteases. The isolated bacteria were able of hydrolyzing all tested substrates, except Staphylococcus xylosus, which did not exhibit serine protease activity. This study provides support for the hypothesis that gut proteases from velvetbean caterpillar are not exclusively secreted by the insect cells but also by their symbiotic gut bacteria. The proteolytic activity from gut symbionts of the velvetbean caterpillar is suggestive of their potential role minimizing the potentially harmful consequences of protease inhibitors from some of this insect host plants, such as soybean, with implications for the management of this insect pest species.

Morfologia do cromossomo Y, função gonadal e extragonadal em touros de raças sintéticas com alterações na qualidade do sêmen

O motivo deste estudo foi o percentual elevado de descarte de touros por alterações reprodutivas, precisamente qualidade de sêmen, que se apresenta em determinados sistemas produtivos nos quais estão inseridas as raças sintéticas. Através de cinco experimentos foi permitido observar o comportamento da espermatogênese de touros de raças sintéticas do nível cromossômico ao funcional do epitélio seminífero. O experimento I, avaliou por seis meses as características seminais de 12 touros, seis de uma raça pura e seis de uma sintética, contendo em cada grupo touros aptos e inaptos a reprodução classificados por qualidade de sêmen. Os animais do grupo sintético não apresentaram recuperação das características seminais durante o período de avaliação, como os puros, indicando um quadro degenerativo permanente neste conjunto de indivíduos. O experimento II buscou identificar uma relação entre a morfologia do cromossomo Y e tipos de cruzamentos, com a qualidade seminal de touros de duas raças sintéticas, Braford e Brangus-Ibagé. A relação da morfologia do Y com a condição reprodutiva não foi comprovada, no entanto considerando os tipos de cruzamentos para obtenção de touros 3/8, os cruzamentos que utilizam fêmea ¼ com macho ½ sangue filho de Nelore proporcionam um maior percentual de animais considerados inaptos ao exame de sêmen. Este experimento sugere medidas práticas para evitar o cruzamento que traz maiores prejuízos econômicos. O experimento III foi proposto para a avaliar a intensidade de redução de células espermáticas anômalas ao longo do epidídimo em touros de uma raça sintética. A redução da freqüência de gota citoplasmática proximal foi distinta entre os grupos de touros classificados quanto a morfologia espermática e entre as regiões do epidídimo, sendo portanto um indicador sensível da qualidade espermática e classificação da fertilidade potencial de animais de raças híbridas. O experimento IV avaliou a freqüência dos túbulos seminíferos nos diferentes estádios do ciclo espermatogênico em touros de duas raças sintéticas. Nas fases iniciais do ciclo espermatogênico, todos os touros apresentam gametogênese semelhante. Nas fases em que ocorrem as divisões meióticas, os touros inaptos apresentaram maior freqüência e a na fase de maturação das espermátides os touros aptos apresentaram maior freqüência. Estes resultados indicam que nos touros inaptos ocorre um bloqueio na fase das meioses, diminuindo a freqüência dos estádios de maturação das espermátides. O experimento V identificou a expressão diferencial de um fator de crescimento (transforming growth factor alpha- TGFα) no epitélio seminífero de touros Braford e Brangus-Ibagé, aptos e inaptos à reprodução, e também avaliou a freqüência de células de Sertoli nestes animais, como um estudo inicial do controle parácrino da espermatogênese. A maior freqüência da expressão de TGFα foi observada nos estádios I e III, e também na raça Brangus-Ibagé. O número médio das células de Sertoli foi semelhante entre estádios e raças dos touros. Em todos experimentos em que as raças Braford e Brangus-Ibagé foram confrontadas, os resultados obtidos foram diferentes. As maiores freqüências de alterações na qualidade seminal não podem ser extrapoladas para todas as raças sintéticas, cabendo a prerrogativa para cada raça de um estudo específico e ajustado às suas condições de criação.

Colesteatomas adquiridos : análise comparativa da perimatriz entre pacientes pediátricos e adultos

Introdução: Os colesteatomas podem ocorrer tanto em crianças como em adultos, porém nas crianças pareceriam ter um crescimento mais agressivo e extenso. A atividade das colagenases poderia explicar este perfil. Objetivo: Comparar, histologicamente, a perimatriz de colesteatomas adquiridos de crianças com os de adultos. Métodos: Foram estudados 74 colesteatomas, 35 pediátricos, coletados em cirurgias otológicas, fixados em formol 10% e processados pelas técnicas histológicas habituais. Foram preparadas uma lâmina em Hematoxilina-Eosina (HE) e outra em Picrossírios, de cada amostra, e analisadas ao microscópio óptico. A leitura foi “cega”, efetuada por meio de imagens digitais, no software ImagePro Plus. A análise estatística foi realizada através dos coeficientes de correlação de Pearson e Spearman e dos testes t e χ2, sendo considerados como estatisticamente significativos os valores de P<0,05. Resultados: Dos 74 colesteatomas coletados, 17 - sete do grupo pediátrico e dez do adulto - foram excluídos por não terem presença de matriz e perimatriz nas lâminas processadas. A média±dp da idade, no grupo pediátrico, foi de 12,85±3,63; e no adulto, 33,69±13,10. Na análise histológica, o número médio de camadas de células epiteliais da matriz foi igual a oito, nos dois grupos, 60% das amostras apresentavam inflamação, de moderada a acentuada; quanto à fibrose, nas crianças, 71,4% e nos adultos, 62,1%; o granuloma apareceu em 10,7% e 13,8%, respectivamente; a presença de epitélio cubóide simples delimitando a perimatriz foi encontrada em 29% dos infantis e 14% dos adultos, entretanto, nenhuma dessas variáveis apresentou diferença estatisticamente significativas quando comparadas por faixa etária (P>0,05). Quanto à espessura da perimatriz, no grupo pediátrico, as medianas (intervalo interquartil) dos parâmetros foram: média=79 (41 a 259); mediana=77 (40 a 265); soma=1.588 (831 a 5.185); delta=82 (44 a 248); mínimo=53 (16 a 165) e máximo=127 (64 a 398); já no grupo de adultos foram: média=83 (26 a 174); mediana=68 (30 a 181); soma=1.801 (558 a 3.867); delta=92 (45 a 190); mínimo=27 (12 a 100) e máximo=136 (53 a 280). O coeficiente de Spearman mostrou correlação inversa, moderada, entre a espessura da perimatriz e a idade; também houve correlação, forte, entre a espessura da perimatriz e o número de camadas da matriz, porém não houve correlação entre essa com a idade. Conclusão: Histologicamente, a perimatriz de colesteatomas adquiridos, de crianças e adultos, vista à microscopia óptica, apresenta-se como um tecido conjuntivo denso de espessura variável (intra e interpacientes), que, por vezes, exibe infiltrado inflamatório linfoplasmocitário e/ou tecido de granulação e reação de corpo estranho; em alguns casos é delimitada em plano profundo por epitélio cubóide simples. Há correlação inversa, de fraca a moderada, entre o tamanho da perimatriz, medida em micrômetros e a idade do paciente na data da cirurgia. O grau de inflamação da perimatriz apresenta correlação, de moderada a forte, com a espessura da perimatriz. As espessuras da matriz e da perimatriz estão fortemente correlacionadas.

Utilização da Berberina na Identificação dos Mastócitos do Molusco Anomalocardia brasiliana

Berberine is an alkaloid used as a fluorochrome in the identification of heparin and DNA. Enerback, 1974, described the technique used until today to study granules rich in heparin of vertebrate mast cells. Santos et al., 2003, studied mast cells of the mollusk Anomalocardia brasiliana using biochemical and histological analysis. This work used the fluorescent dye berberine technique to improve characterization of these cells. Mollusk organs (ctenidium and mantle) were processed with routine histological techniques. Tissue sections were treated with berberine 0,02% in redistilled water acidified to pH 4, by the addition of citric acid for 20 minutes. The visualization was made through fluorescence microscopy with ultraviolet region emission. The mast cell fluorescence had a strong yellow color, where cell nuclei appeared more greenish. This result was very similar to the ones reported before. Mast cells are location at the epithelium surface is the same in both organs, mantle and ctenidium. The fluorescence was easily observed in the granules. Therefore, this technique showed to be good and sensitive to study mast cell of invertebrates

Isolamento de uma quitinase extraída do cefalotórax do camarão marinho Litopenaeus schmitti (BURKENROAD, 1936) : avaliação de suas atividades antimicrobiana e larvicida

Chitinases are enzymes involved in degradation of chitin and are present in a range of organisms, including those that do not contain chitin, such as bacteria, viruses, plants and animals, and play important physiological and ecological roles. Chitin is hydrolyzed by a chitinolytic system classified as: endo-chitinases, exo-chitinases and N-acetyl-b-D-glucosaminidases. In this study a Litochitinase1 extracted from the cephalotorax of the shrimp Litopenaeus Schmitt was purified 987.32 times using ionexchange chromatography DEAE-Biogel and molecular exclusion Sephacryl S-200. These enzyme presented a molecular mass of about 28.5 kDa. The results, after kinetic assay with the Litochitinase1 using as substrate p-nitrophenyl-N-acetyl-b-Dglucosaminideo, showed apparent Km of 0.51 mM, optimal activity at pH ranging from 5.0 to 6.0, optimum temperature at 55°C and stability when pre-incubated at temperatures of 25, 37, 45, 50 and 55°C. The enzyme showed a range of stability at pH 4.0 to 5.5. HgCl2 inhibited Litochitinase1 while MgCl2 enhances its activity. Antimicrobial tests showed that Litochitinase1 present activity against gram-negative bacterium Escherichia coli in the 800 μg/mL concentration. The larvicidal activity against Aedes aegypti was investigated using crude extracts, F-III (50-80%) and Litochitinase1 at 24 and 48 hours. The results showed larvicidal activity in all these samples with EC50 values of 6.59 mg/mL for crude extract, 5.36 mg/mL for F-III and 0.71 mg/mL for Litochitinase1 at 24 hours and 3.22 and 0.49 mg/mL for the F-III and Litochitinase1 at 48 hours, respectively. Other experiments confirmed the presence of chitin in the midgut of Aedes aegypti larvae, which may be suffering the action of Litochitinase1 killing the larvae, but also the absence of contaminating proteins as serine proteinase inhibitors and lectins in the crude extract, F-III and Litochitinase1, indicating that the death of the larvae is by action of the Litochitinase1. We also observed that the enzymes extracted from intestinal homogenate of the larvae no have activity on Litochitinase1. These results indicate that the enzyme can be used as an alternative to control of infections caused by Escherichia coli and reducing the infestation of the mosquito vector of dengue.

Vicilinas de sementes de leguminosas selvagens:purificação, caracterização, efeito de deletério e mecanismo de ação para bruquídeos e para fungos fitopatogêncios

Globulins fractions of legume seeds of Crotalaria pallida, Erytrina veluntina and Enterolobium contortisiliquum were isolated and submitted to assays against serine, cysteine and aspartic proteinases, as also amylase present in midgut of C. maculatus and Z. subfasciatus. Hemagglutination assays indicated presence of a lectin in E. veluntina globulin fractions. This lectin had affinity to human erythrocytes type A, B and O. Vicilins were purified by chromatography on Sephacryl S-300 followed of a chromatography on Sephacryl S-200, which was calibrated using protein markers. Vicilins from C. pallida (CpV) and E. veluntina (EvV) seeds had a molecular mass of 124.6 kDa and E. contortisiliquum a molecular mass of 151kDa. Eletrophoresis in presence of SDS showed that CpV was constituted by four subunities with apparent molecular mass of 66, 63, 57 and 45 kDa, EvV with three subunities with apparent molecular mass of 45kDa and EcV four subunities, two with 37.1 kDa and two with 25.8 kDa. Non denaturantig eletrophoresis displayed single bands with high homogeneity, where CpV had lower acidic behavior. All vicilins are glycoproteins with carbohydrate contents at 1 to1.5%. Bioassays were done to detect deleterious effects of vicilins against C. maculatus and Z. subfasciatus larvae. CpV, EvV and EcV exhibited a WD50 of 0.28, 0.19 and 1.03%; LD50 0.2, 0.26, and 1.11% respectively to C. maculatus. The dose responses of CpV, EvV and EcV to Z. subfasciatus were: WD50 of 0.12, 0.14, 0.65% and LD50 of 0.09, 0.1, and 0.43% respectively. The mechanism of action of these proteins to bruchids should be based on their properties of bind to chitin present in mid gut of larvae associated with the low digestibility of vicilin. In assays against phytopatogenous fungus, only EcV was capable of inhibit F. solani growth at concentrations of 10 and 20 µg and its action mechanism should be also based in the affinity of EcV to chitin present in the fungi wall

A microestrutura e o desenvolvimento dos órgãos genitais masculinos de preás (Galea spixii) criados em cativeiro

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Fases do desenvolvimento e diferenciação testicular em cutias (Dasyprocta aguti) criadas em cativeiros

A cutia (Dasyprocta aguti) é um roedor silvestre encontrado amplamente na região Nordeste do Brasil. É uma espécie muito utilizada pela população humana de baixa renda como fonte alternativa de proteína na alimentação. Foram utilizadas 31 cutias, machos, provenientes da Universidade Federal do Piauí (FUFPI), Estado do Piauí e da Escola Superior de Agricultura de Mossoró Estado do Rio Grande do Norte. Os animais foram divididos em grupos etários desde o nascimento até os 14 meses de idade. O diâmetro nuclear médio foi obtido pela medida de 10 núcleos do tipo celular estudado em cada testículo, no estágio 1 do ciclo do epitélio seminífero. Nos animais que não apresentaram o epitélio organizado em estágios bem definidos em virtude da idade, foram feitas medidas em secções transversais escolhidas somente pelo contorno circular. O início da assincronia do processo espermatogênico foi observado a partir dos seis meses de idade. A puberdade, na cutia Dasyprocta aguti, foi definitivamente estabelecida a partir dos nove meses de idade, pois estavam presentes todos os tipos celulares e espermatozóides liberados no lume tubular em grande parte do parênquima testicular.

Fissura placentária de gatas SRD, Felis catus - Linnaeus, 1758: aspectos macro e microscópicos

Nossa pesquisa consiste no estudo esquemático macroscópico na placenta de gatos e a sua caracterização como tipo, placenta zonária, que 62,5% dos casos apresenta uma fissura na área distal do funículo umbilical. Esse é formado por uma área justa fetal, área justa placentária e área média, encontrando achados histológicos de 2 artérias, uma veia, 2 pedículos vitelínicos e 2 pedículos alantoidianos. Na fissura, encontramos um epitélio alantoidiano cobrindo esta área em 10% dos casos e, em 90% dos achados foram encontrados um trofoblasto diminuído comparado com outras áreas placentárias fora da fissura. Portanto, a placenta felina, com sua relação materno fetal mostra uma placenta zonária incompleta, diferente do ocorrido nos outros carnívoros.

Quantificação de células dos túbulos seminíferos e rendimento da espermatogênese em cutias (Dasyprocta aguti) criadas em cativeiros

O presente estudo teve como objetivo avaliar o rendimento da espermatogênese de cutias criadas em cativeiro, por intermédio das razões encontradas entre tipos celulares do epitélio seminífero. Os resultados apontaram que o rendimento da espermatogênese da cutia dos nove aos quatorze meses de idade não chegou a um ponto de estabilização. O coeficiente de eficiência de mitoses espermatogoniais não aumentou com a idade. O rendimento meiótico, o rendimento geral da espermatogênese e o índice de células de Sertoli mostraram variações numéricas em função da idade, entretanto, não detectadas estatisticamente.

Caracterização morfológica e frequência dos estádios do ciclo do epitélio seminífero em preás (Galea spixii Wagler, 1831) criados em cativeiro

Estudos baseados nas características testiculares estão altamente relacionados com a eficiência reprodutiva de varias espécies. Assim, o projeto desenvolvido teve como objetivo identificar as células do epitélio seminífero, caracterizar histologicamente suas associações, que formam os estádios, e determinar a frequência destes. Os fragmentos de testículos, com 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 150 dias foram coletados no Centro de Multiplicação da Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), Mossoró/ RN. Passando pelos processos de fixação, lavagens em soluções de concentrações crescentes de álcoois (70-100%), desidratação em xilol, inclusão em Histosec®, preparação das lâminas histológicas, colorações em Hematoxilina e Eosina (HE) e suas fotomicrografias para a caracterização dos núcleos celulares do epitélio germinativo e a definição dos oitos estágios do ciclo do epitélio seminífero (CES) baseados no Método da Morfologia Tubular. Das faixas etárias analisadas todos os animais de 90-150 dias de idade apresentaram todos os estádios do CES. Os estádios I e III foram os que apresentaram maior e menor freqüência, respectivamente. Os animais caracterizados como pré-púberes (30 dias), púberes (45-90 dias de idade) e pós-púberes (105150 dias de idade) apresentaram os estádios I, VIII e IV com uma maior freqüência, respectivamente.

Prevalência da infecção por Chlamydia Trachomatis em mulheres atendidas no Programa de rastreamento do câncer de colo do útero

Genital infection with Chlamydia trachomatis is now recognized as one of the most prevalent sexually transmitted infections (STDs). Despite major advances in laboratory diagnosis techniques, primarily the character of asymptomatic chlamydial infection in both men and in women constitutes the basis for the formation of reservoirs that perpetuate transmission and acquisition of this and other STDs. The asymptomatic in women favors the rise of infection to the upper genital tract, causing injuries that can result in infertility. An examination of population screening for early detection and treatment of asymptomatic infections is the key step in combating this major public health problem. The present study aimed to evaluate the prevalence of infection by C. trachomatis in sexually active women attended the screening program for cervical cancer of the uterus in health facilities in municipalities in different regions of the State of Rio Grande do Norte, and identify factors that may contribute to the spread of this pathogen and its relationship with the lesions of the uterine cervix. It is a cross-sectional study aimed at detecting the presence of genital tract infection by C. trachomatis either in isolated form or in association with human papilloma virus (HPV) infection in asymptomatic women. Were included in this study, a total sample of 1,134 women aged 13-76, mean 34.4 years, from March 2008 to September 2012. Specimens containing exfoliated cells of the epithelium of the uterine cervix were analyzed by examining Pap cytology for the detection of possible injuries, and the polymerase chain reaction (PCR) for detection of plasmid DNA from C. trachomatis and HPV. Infection with C. trachomatis was detected with overall prevalence rate of 8.1% in the isolated form and 2.8% in co-infection with HPV. The infection was detected in 7.4% of women with normal cytology 11.5% of those with atypical cells of undetermined significance (ASC-US) and 16.7% of those with low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL). We observed an association between C. trachomatis and incidence of low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL). The genital tract infection by C. trachomatis alone was associated with education level, ethnicity and parity, revealing that women with higher education, those of non-white ethnicity and those who had three or more pregnancies were more likely to acquire infection. Levels very close to statistical significance were observed for chronological age, age at first sexual intercourse and first pregnancy. There was no association with marital status, number of sexual partners. Co-infection with C. trachomatis and HPV was detected in 2.3% of women with normal cytology, who had 5.1% in ASC-US and 10.4% in those with LSIL. No association was found between infection C. trachomatis and increased risk of HPV infection, but women with simultaneous infection by both pathogens showed greater risk for LSIL. Co-infection was more prevalent among single women, who had in the first sexual intercourse under 18 years and those who had two or more sexual partners over a lifetime

Spermathecae of the mangrove crab Ucides cordatus: a histological and histochemical view

Ucides cordatus is the most commercially, important mangrove crab in Brazil. In spite of its economic importance, there are few studies of its reproduction, in particular the female reproductive system. The present study describes the histology and histochemistry of the spermathecae of U. cordatus. Adult females were can lit monthly from July 2004 through June 2005, at Iguape, State of São Paulo. The crabs were anaesthetized, and their spermathecae removed and fixed in Davidson's fluid, following the histological routine for paraffin. The slides were stained with HE, xylidine Ponceau, PAS, alcian blue (pH 1.0 and 2.5), Sudan black B and picrosirius-haematoxylin. Histologically, the spermathecae possesses a capsule of conjunctive tissue, rich in collalgen fibres, which surrounds the secretory columnar epithelium. In the lumen, individual sperm packets are not observed; the spermatophores are intermixed with the seminal fluid and secretions of the spermathecae itself. A large proportion of the free spermatozoids and spermatophores are arranged in homogeneous masses in the proximal part of the spermathecae. The secretion produced by the columnar epithelium appears to promote the movement of the gametes to the fertilization chamber, in a ventral position, allowing fertilization of the oocytes. Histochemically, the secretion produced by the columnar epithelium was strongly positive for neutral polysaccharides, positive for acid polysaccharides, and weakly positive for proteins and lipids. Tills secretion forms a glycoprotein matrix which is associated with maintenance of the spermatophores, which can remain stored for long periods.