The involvement of thaumatin-like proteins in plant food cross-reactivity: a multicenter study using a specific protein microarray

Cross-reactivity of plant foods is an important phenomenon in allergy, with geographical variations with respect to the number and prevalence of the allergens involved in this process, whose complexity requires detailed studies. We have addressed the role of thaumatin-like proteins (TLPs) in cross-reactivity between fruit and pollen allergies. A representative panel of 16 purified TLPs was printed onto an allergen microarray. The proteins selected belonged to the sources most frequently associated with peach allergy in representative regions of Spain. Sera from two groups of well characterized patients, one with allergy to Rosaceae fruit (FAG) and another against pollens but tolerant to food-plant allergens (PAG), were obtained from seven geographical areas with different environmental pollen profiles. Cross-reactivity between members of this family was demonstrated by inhibition assays. Only 6 out of 16 purified TLPs showed noticeable allergenic activity in the studied populations. Pru p 2.0201, the peach TLP (41%), chestnut TLP (24%) and plane pollen TLP (22%) proved to be allergens of probable relevance to fruit allergy, being mainly associated with pollen sensitization, and strongly linked to specific geographical areas such as Barcelona, Bilbao, the Canary Islands and Madrid. The patients exhibited >50% positive response to Pru p 2.0201 and to chestnut TLP in these specific areas. Therefore, their recognition patterns were associated with the geographical area, suggesting a role for pollen in the sensitization of these allergens. Finally, the co-sensitizations of patients considering pairs of TLP allergens were analyzed by using the co-sensitization graph associated with an allergen microarray immunoassay. Our data indicate that TLPs are significant allergens in plant food allergy and should be considered when diagnosing and treating pollen-food allergy.

Graph based study of allergen cross-reactivity of plant lipid transfer proteins (LTPs) using microarray in a multicenter study.

The study of cross-reactivity in allergy is key to both understanding. the allergic response of many patients and providing them with a rational treatment In the present study, protein microarrays and a co-sensitization graph approach were used in conjunction with an allergen microarray immunoassay. This enabled us to include a wide number of proteins and a large number of patients, and to study sensitization profiles among members of the LTP family. Fourteen LTPs from the most frequent plant food-induced allergies in the geographical area studied were printed into a microarray specifically designed for this research. 212 patients with fruit allergy and 117 food-tolerant pollen allergic subjects were recruited from seven regions of Spain with different pollen profiles, and their sera were tested with allergen microarray. This approach has proven itself to be a good tool to study cross-reactivity between members of LTP family, and could become a useful strategy to analyze other families of allergens.

Neural crest cell survival is dependent on Rho kinase and is required for development of the mid face in mouse embryos.

Neural crest cells (NCC) give rise to much of the tissue that forms the vertebrate head and face, including cartilage and bone, cranial ganglia and teeth. In this study we show that conditional expression of a dominant-negative (DN) form of Rho kinase (Rock) in mouse NCC results in severe hypoplasia of the frontonasal processes and first pharyngeal arch, ultimately resulting in reduction of the maxilla and nasal bones and severe craniofacial clefting affecting the nose, palate and lip. These defects resemble frontonasal dysplasia in humans. Disruption of the actin cytoskeleton, which leads to abnormalities in cell-matrix attachment, is seen in the RockDN;Wnt1-cre mutant embryos. This leads to elevated cell death, resulting in NCC deficiency and hypoplastic NCC-derived craniofacial structures. Rock is thus essential for survival of NCC that form the craniofacial region. We propose that reduced NCC numbers in the frontonasal processes and first pharyngeal arch, resulting from exacerbated cell death, may be the common mechanism underlying frontonasal dysplasia.

Unavailability of CD147 leads to selective erythrocyte trapping in the spleen.

Adhesive interactions with stromal cells and the extracellular matrix are essential for the differentiation and migration of hematopoietic progenitors. In the erythrocytic lineage, a number of adhesion molecules are expressed in the developing erythrocytes and are thought to play a role in the homing and maturation of erythrocytic progenitors. However, many of these molecules are lost during the final developmental stages leading to mature erythrocytes. One of the adhesion molecules that remains expressed in mature, circulating erythrocytes is CD147. This study shows that blockade of this molecule on the cell surface by treatment with F(ab')(2) fragments of anti-CD147 monoclonal antibody disrupts the circulation of erythrocytes, leading to their selective trapping in the spleen. Consequently, mice develop an anemia, and de novo, erythropoietin-mediated erythropoiesis in the spleen. In contrast, these changes were not seen in mice similarly treated with another antierythrocyte monoclonal antibody with a different specificity. These results suggest that the CD147 expressed on erythrocytes likely plays a critical role in the recirculation of mature erythrocytes from the spleen into the general circulation. (Blood. 2001;97:3984-3988)

Early diagnosis of congenital toxoplasmosis in newborn infants using IgG subclasses against two Toxoplasma gondii recombinant proteins

The aim of this work was to evaluate the utility of ELISA-based testing of total IgG (IgGt) antibodies and its subclasses (IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) against soluble (STAg) and recombinant (rSAG1 and rMIC3) antigens of Toxoplasma gondii for diagnosing congenital toxoplasmosis. Sera from 217 newborns initially testing positive for specific IgM in filter paper dried blood spots were tested for specific IgM and IgG by ELFA-VIDAS®. Congenital toxoplasmosis was confirmed in 175 and ruled out in 42 infants. The validity of the ELISA tests was determined using the persistence of IgG antibodies (ELFA-VIDAS® kit) at the end of 12 months, which is considered the reference test for the diagnosis of congenital toxoplasmosis. The frequency of positivity with IgGt against STAg, rSAG1 and rMIC3 was found in 97.2%, 96.3% and 80.2%, respectively, of the newborns with confirmed congenital toxoplasmosis. IgG1 reacted with all three antigens, while IgG3 and IgG4 reacted preferentially with rMIC3. Higher mean values of reactivity (sample optical density/cut-off) were found for all subclasses when using rMIC3. All of the antigens showed high sensitivity and low specificity in detecting anti-T. gondii IgGt and IgG1 and low sensitivity and high specificity in detecting IgG3 and IgG4. In conclusion, the combined detection of IgG antibody subclasses against recombinant toxoplasmic antigens may be useful for the early diagnosis of congenital toxoplasmosis.

In-depth analysis of hyaline fibromatosis syndrome frameshift mutations at the same site reveal the necessity of personalized therapy.

Hyaline fibromatosis syndrome is an autosomal recessive disease caused by mutations in ANTXR2, a gene involved in extracellular matrix homeostasis. Sixty percent of patients carry frameshift mutations at a mutational hotspot in exon 13. We show in patient cells that these mutations lead to low ANTXR2 mRNA and undetectable protein levels. Ectopic expression of the proteins encoded by the mutated genes reveals that a two base insertion leads to the synthesis of a protein that is rapidly targeted to the ER-associated degradation pathway due to the modified structure of the cytosolic tail, which instead of being hydrophilic and highly disordered as in wild type ANTXR2, is folded and exposes hydrophobic patches. In contrast, one base insertion leads to a truncated protein that properly localizes to the plasma membrane and retains partial function. We next show that targeting the nonsense mediated mRNA decay pathway in patient cells leads to a rescue of ANTXR2 protein in patients carrying one base insertion but not in those carrying two base insertions. This study highlights the importance of in-depth analysis of the molecular consequences of specific patient mutations, which even when they occur at the same site can have drastically different consequences.

Characterization of the immunological properties of " Plasmodium falciparum " and " Plasmodium berghei " circumsporozoite proteins : antibody responses and recognition by specific CD8+ T cells

SUMMARY Interest in developing intervention strategies against malaria by targeting the liver stage of the Plasmodium life cycle has been fueled by studies which show that sterile protective immunity can be achieved by immunization with radiation-attenuated sporozoites. Anti-malarial drugs and insecticides have been widely used to control the disease, but in the hope of developing a more cost-effective intervention strategy, vaccine development has taken centre stage in malaria research. There is currently no vaccine against malaria. Attenuated sporozoite-induced immunity is achieved by antibodies and T cells against malaria liver stage antigens, the most abundant being the circumsporozoite protein (CSP), and many vaccine formulations aim at mimicking this immunity. However, the mechanisms by which the antibody and T cell immune responses are generated after infection by sporozoites, or after immunization with different vaccine formulations are still not well understood. The first part of this work aimed at determining the ability of primary hepatocytes from BALB/c mice to process and present CSP-derived peptides after infection with P. berghei sporozoites. Both infected hepatocytes and those traversed by sporozoites during migration were found to be capable of processing and presenting the CSP to specific CD8+ T cells in vitro. The pathway of processing and presentation involved the proteasome, aspartic proteases and transport through a post-Endoplasmic Reticulum (ER) compartment. These results suggest that in vivo, infected hepatocytes contribute to the elicitation and expansion of a T cell response. In the second part, the antibody responses of CB6F1 mice to synthetic peptides corresponding to the N- and C-terminal domains of P. berghei and P. falciparum CS proteins were characterized. Mice were immunized with single peptides or a combination of N- and C-terminal peptides. The peptides were immunogenic in mice and the antisera generated could recognize the native CSP on the sporozoite surface. Antisera generated against the N-terminal peptides or against the combinations inhibited sporozoite invasion of hepatocytes in vitro. In vivo, more mice immunized with single P. berghei peptides were protected from infection upon a challenge with P. berghei sporozoites, than mice immunized with a combination of N- and C-terminal peptides. Furthermore, P. falciparum N-terminal peptides were recognized by serum samples from people living in malaria-endemic areas. Importantly, recognition of a peptide from the N-terminal fragment of the P. falciparum CSP by sera from children living in a malaria-endemic region was associated with protection from disease. These results underline the potential of using such peptides as malaria vaccine candidates. RESUME L'intérêt de développer des stratégies d'intervention contre la malaria ciblant le stade pré-erythrocytaire a été alimenté par des études qui montrent qu'il est possible d'obtenir une immunité par l'injection de sporozoites irradiés. Les médicaments et les insecticides anti-paludiques ont été largement utilisés pour contrôler la maladie, mais dans l'espoir de développer une stratégie d'intervention plus rentable, le développement de vaccins a été placé au centre des recherches actuelles contre la malaria. A l'heure actuelle, il n'existe aucun vaccin contre la malaria. L'immunité induite par les sporozoites irradiés est due à l'effet combiné d'anticorps et de cellules T qui agissent contre les antigènes du stade hépatique dont le plus abondant est la protéine circumsporozoite (CSP). Beaucoup de formulations de vaccin visent à imiter l'immunité induite par les sporozoites irradiés. Cependant, les mécanismes par lesquels les anticorps et les cellules T sont génerés après infection par les sporozoites ou après immunisation avec des formulations de vaccin ne sont pas bien compris. La première partie de ce travail a visé à déterminer la capacité de hépatocytes primaires provenant de souris BALB/c à "processer" et à présenter des peptides dérivés de la CSP, après infection par des sporozoites de Plasmodium berghei. Nous avons montré que in vitro, les hépatocytes infectés et ceux traversés par les sporozoites pendant leur migration étaient capables de "processer" et de présenter la CSP aux cellules T CD8+ spécifiques. La voie de présentation implique le protéasome, les protéases de type aspartique et le transport à travers un compartiment post-reticulum endoplasmique. Ces résultats suggèrent que in vivo, les hépatocytes infectés contribuent à l'induction et à l'expansion d'une réponse immunitaire spécifique aux cellules T. Dans la deuxième partie, nous avons caractérisé les réponses anticorps chez les souris de la souche CB6F1 face aux peptides N- et C-terminaux des protéines circumsporozoites de Plasmodium berghei et Plasmodium falciparum. Les souris ont été immunisées avec les peptides individuellement ou en combinaison. Les peptides utilisés étaient immunogéniques chez les souris, et les anticorps produits pouvaient reconnaître la protéine CSP native à la surface des sporozoites. In vitro, les sera contre les peptides N-teminaux et les combinaisons étaient capables d'inhiber l'invasion de hépatocytes par les sporozoites. In vivo, plus de souris immunisées avec les peptides individuels de la CSP de P. berghei étaient protégées contre la malaria que les souris immunisées avec une combinaison de peptides N- et C-terminaux. De plus, les peptides N-terminaux de la CSP de P. falciparum ont été reconnus par les sera de personnes vivant dans des régions endémiques pour la malaria. Il est intéressant de voir que la reconnaissance d'un peptide N-terminal de P. falciparum par des sera d'enfants habitant dans des régions endémiques était associé à la protection contre la maladie. Ces résultats soulignent le potentiel de ces peptides comme candidats-vaccin contre la malaria.

Extracellular matrix molecules enhance the neurotrophic effect of schwann cell-like differentiated adipose-derived stem cells and increase cell survival under stress conditions.

Since the first reports of induction of adipose-derived stem cells (ASC) into neuronal and glial cell phenotypes, expectations have increased regarding their use in tissue engineering applications for nerve repair. Cell adhesion to extracellular matrix (ECM) is a basic feature of survival, differentiation, and migration of Schwann cells (SC) during nerve regeneration, and fibronectin and laminin are two key molecules of this process. Interaction between ECM and SC-like differentiated ASC (dASC) could potentially improve the neurotrophic potential of the stem cells. We have investigated the effect of ECM molecules on SC-like dASC in terms of proliferation, adhesion, and cell viability. Fibronectin and laminin did not affect the proliferation of dASC when compared with cell adherent tissue culture plastic, but significantly improved viability and cell attachment when dASC were exposed to apoptotic conditions. To assess the influence of the ECM molecules on dASC neurotrophic activity, dASC were seeded onto ECM-coated culture inserts suspended above dorsal root ganglia (DRG) sensory neurons. Neurite outgrowth of DRG neurons was enhanced when dASC were seeded on fibronectin and laminin when compared with controls. When DRG neurons and dASC were in direct contact on the various surfaces there was significantly enhanced neurite outgrowth and coculture with laminin-conditioned dASC produced the longest neurites. Compared with primary SCs, dASC grown on laminin produced similar levels of neurite outgrowth in the culture insert experiments but neurite length was shorter in the direct contact groups. Anti β1 integrin blocking antibody could inhibit baseline and dASC evoked neurite elongation but had no effect on outgrowth mediated by laminin-conditioned dASC. ECM molecules had no effect on the levels of nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor secretion from dASC. The results of the study suggest that ECM molecules can significantly improve the potential of dASC for nerve regeneration.

Serologic follow-up of IgG responses against recombinant mycobacterial proteins ML0405, ML2331 and LID-1 in a leprosy hyperendemic area in Venezuela

Leprosy is a slowly evolving disease that occurs mainly in adults. In this study, the Mamaría Village, state of Portuguesa was selected because it had one of the highest prevalence rates (13.25%) of leprosy cases in 1997. Between 1998-2004, 20.2% of the 89 cases registered in this village were less than 15 years old and 61.8% were males. Pau-cibacillary (PB) lesions were the predominant clinical forms identified, although also multibacillary (MB) forms were found. Additionally, 76% of the patients were bacteriologically negative. At the time of diagnosis, 75% of the patients presented with grade 0 disabilities, 23% with grade 1 and 2% with grade 2. Serum samples were collected from 18 PB and 15 MB patients, in addition to 14 family contacts, at the beginning and end of treatment. All the groups were re-evaluated during a three-year period (2008-2011). The proteins used for evaluation were ML0405, ML2331 and LID-1. These mycobacterial proteins were highly specific for Mycobacterium leprae and the IgG responses decreased in both MB and PB patients during multidrug treatment. Our results suggest that these antigens could be used as markers for successful treatment of non-reactional lepromatous patients.

Molecular basis of interaction between Na,K-ATPase and FXYD proteins.

Résumé au large public Notre corps est constitué de différents types de cellules. La condition minimale ou primordiale pour la survie des cellules est d'avoir de l'énergie. Cette tâche est assumée en partie par une protéine qui se situe dans la membrane de chaque cellule. Nommé Na, K¬ATPase ou pompe à sodium, c'est une protéine pressente dans toutes les cellules chez les mammifères est composée de deux sous-unités, α et β. En transportant 3 ions de sodium hors de la cellule et 2 ions de potassium à l'intérieur de la cellule, elle transforme l'énergie chimique sous forme de l'ATP en énergie motrice, qui permet aux cellules par la suite d'échanger des matériaux entre l'espace intracellulaire et extracellulaire ainsi que d'ingérer des nutriments provenant de son environnement. Le manque de cette protéine chez la souris entraîne la mort de l'embryon. Des défauts fonctionnels de cette protéine sont responsables de plusieurs maladies humaines comme par exemple, un type de migraine. En dehors de sa fonction vitale, cette protéine est également engagée dans diverses activités physiologiques comme la contractilité musculaire, l'activité nerveuse et la régulation du volume sanguin. Vue l'importance de cette protéine, sa découverte par Jens C. Skou en 1957 a été honorée d'un Prix Noble de chimie quarante ans plus tard. Depuis lors, nous connaissons de mieux en mieux les mécanismes de fonctionnement de la Na, K-ATPase. Entre autre, sa régulation par une famille de protéines appelées protéines FXYD. Cette famille contient 7 membres (FXYD 1-7). L'un d'entre eux nommé FXYD 2 est lié à une maladie héréditaire connue sous le nom de hypomagnesemia. Nous disposons actuellement d'informations concernant les conséquences de la régulation par les protéines FXYD sur activité de la Na, K-ATPase, mais nous savons très peu sur le mode d'interaction entre les protéines FXYD et la Na, K-ATPase. Dans ce travail de thèse, nous avons réussi à localiser des zones d'interaction dans la sous- unité a de la Na, K-ATPase et dans FXYD 7. En même temps, nous avons déterminé un 3ème site de liaison spécifique au sodium de la Na, K-ATPase. Une partie de ce site se situe à l'intérieur d'un domaine protéique qui interagit avec les protéines FXYD. De plus, ce site a été démontré comme responsable d'un mécanisme de transport de la Na, K-ATPase caractérisé par un influx ionique. En conclusion, les résultats de ce travail de thèse fournissent de nouvelles preuves sur les régions d'interaction entre la Na, K-ATPase et les protéines FXYD. La détermination d'un 3ème site spécifique au sodium et sa relation avec un influx ionique offrent la possibilité 1) d'explorer les mécanismes avec lesquels les protéines FXYD régulent l'activité de la Na, ATPase et 2) de localiser un site à sodium qui est essentielle pour mieux comprendre l'organisation et le fonctionnement de la Na, K-ATPase. Résumé Les gradients de concentration de Na+ et de K+ à travers la membrane plasmatique des cellules animales sont cruciaux pour la survie et l'homéostasie de cellules. De plus, des fonctions cellulaires spécifiques telles que la reabsorption de Na dans le rein et le côlon, la contraction musculaire et l'excitabilité nerveuse dépendent de ces gradients. La Na, K¬ATPase ou pompe à sodium est une protéine membranaire ubiquitaire. Elle crée et maintient ces gradients en utilisant l'énergie obtenu par l'hydrolyse de l'adénosine triphosphate. L'unité fonctionnelle minimale de cette protéine se compose d'une sous-unité catalytique α et d'une sous-unité régulatrice β. Récemment, il a été montré que des membres de la famille FXYD, sont des régulateurs tissu-spécifiques de la Na, K-ATPase qui influencent ses propriétés de transport. Cependant, on connaît peu de chose au sujet de la nature moléculaire de l'interaction entre les protéines FXYD et la Na, K-ATPase. Dans cette étude, nous fournissons, pour la première fois, l'évidence directe que des résidus du domaine transmembranaire (TM) 9 de la sous-unité α de la Na, K-ATPase sont impliqués dans l'interaction fonctionnelle et structurale avec les protéines FXYD. De plus nous avons identifié des régions dans le domaine transmembranaire de FXYD 7 qui sont importantes pour l'association stable avec la Na, K-ATPase et une série de résidus responsables des régulations fonctionnelles. Nous avons aussi montré les contributions fonctionnelles du TM 9 de la Na, K-ATPase à la translocation de Na + en déterminant un 3ème site spécifique au Na+. Ce site se situe probablement dans un espace entre TM 9, TM 6 et TM 5 de la sous-unité α de la pompe à sodium. De plus, nous avons constaté que le 3ème site de Na + est fonctionnellement lié à un courant entrant de la pompe sensible à l'ouabaïne et activé par le pH acide. En conclusion, ce travail donne de nouvelles perspectives de l'interaction structurale et fonctionnelle entre les protéines FXYD et la Na, K-ATPase. En outre, les contributions fonctionnelles de TM 9 offrent de nouvelles possibilités pour explorer le mécanisme par lequel les protéines FXYD régulent les propriétés fonctionnelles de la Na, K-ATPase. La détermination du 3ème site au Na + fournit une compréhension avancée du site spécifique au Na + de la Na, K-ATPase et du mécanisme de transport de la Na, K-ATPase. Summary The Na+ and K+ gradients across the plasma membrane of animal cells are crucial for cell survival and homeostasis. Moreover, specific tissue functions such as Na+ reabsorption in kidney and colon, muscle contraction and nerve excitability depend on the maintenance of these gradients. Na, K-ATPase or sodium pump, an ubiquitous membrane protein, creates and maintains these gradients by using the energy from the hydrolysis of ATP. The minimal functional unit of this protein is composed of a catalytic α subunit and a regulatory β subunit. Recently, members of the FXYD family, have been reported to be tissue-specific regulators of Na, K-ATPase by influencing its transport properties. However, little is known about the molecular nature of the interaction between FXYD proteins and Na, K-ATPase. In this study, we provide, for the first time, direct evidence that residues from the transmembrane (TM) domain 9 of the α subunit of Na, K-ATPase are implicated in the functional and structural interaction with FXYD proteins. Moreover, we have identified regions in the TM domain of FXYD 7 important for the stable association with Na, K-ATPase and a stretch of residues responsible for the functional regulations. We have further revealed the functional contributions of TM 9 of the Na, K-ATPase α subunit to the Na+ translocation by determining a 3rd Na+-specific cation binding site. This site is likely in a space between TM 9, TM 6 and TM 5 of the a subunit of the sodium pump. Moreover, we have found that the 3rd Na+ binding site is functionally linked to an acidic pH- activated ouabain-sensitive inward pump current. In conclusion, this work gives new insights into the structural and functional interaction between FXYD proteins and Na, K-ATPase. Functional contributions of TM 9 offer new possibilities to explore the mechanism by which FXYD proteins regulate functional properties of Na, K-ATPase. The determination of the 3rd Na+ binding site provides an advanced understanding concerning the Na+ -specific binding site of Na, K-ATPase and the 3rd Na+ site related transport mechanism.

New human kallikrein 14: enzymatic characterization and inhibitors development.

RESUME DESTINE A UN LARGE PUBLIC En biologie, si une découverte permet de répondre à quelques questions, en général elle en engendre beaucoup d'autres. C'est ce qui s'est produit récemment dans le monde des kallicréines. De la famille des protéases, protéines ayant la faculté de couper plus ou moins spécifiquement d'autres protéines pour exercer un rôle biologique, la famille des kallicréines humaines n'était composée que de 3 membres lors du siècle dernier. Parmi eux, une kallicréine mondialement utilisée pour détecter le cancer de la prostate, le PSA. En 2000, un chercheur de l'hôpital universitaire Mont Sinaï à Toronto, le Professeur Eleftherios Diamandis, a découvert la présence de 12 nouveaux gènes appartenant à cette famille, situés sur le même chromosome que les 3 premières kallicréines. Cette découverte majeure a placé les spécialistes des kallicréines face à une montagne d'interrogations car les fonctions de ces nouvelles protéases étaient totalement inconnues. La kallicréine humaine 14 (hK14) présente un intérêt particulier, car elle se retrouve associée à différents cancers, notamment les carcinomes ovariens et mammaires. Cette association ne répond cependant pas à la fonction de cette protéase. L'objectif de ce travail de thèse était donc de découvrir, dans un premier temps, la spécificité de cette nouvelle kallicréine, c'est-à-dire le type de coupure qu'elle engendre au niveau des protéines qu'elle cible. Utilisant une technologie de pointe qui exploite la propriété des bactériophages à se répliquer dans les bactéries à l'infini, des dizaines de millions de combinaisons protéiques aléatoires ont été présentées à hK14, qui a pu sélectionner celles qui lui étaient favorables pour la coupure. Cette technique qualitative porte le nom de Phage Display Substrate. Une fois la sélection réalisée, il fallait transférer ces séquences coupées ou substrats dans un système permettant de donner une valeur quantitative à l'efficacité de coupure. Pour cela nous avons développé une technologie qui permet d'évaluer cette efficacité en utilisant des protéines fluorescentes de méduse, modifiées génétiquement, dont l'excitation de la première (CFP : cyan fluorescent protein) par la lumière à une certaine longue d'onde permet le transfert d'énergie à la seconde (YFP : yellow fluorescent protein), via un substrat qui les lie. Pour que ce transfert d'énergie se produise, il faut que les deux protéines fluorescentes soient proches, comme c'est le cas lorsqu'elles sont liées par un substrat. La coupure de ce lien provoque un changement de transfert d'énergie qui est quantifiable en utilisant un spectrofluoromètre. Cette technologie permet donc de suivre la réaction d'hydrolyse (coupure) des protéases. Afin de poursuivre certaines expériences permettant de mieux comprendre la fonction biologique d'hK14 ainsi que son éventuelle implication dans le cancer, nous avons développé des inhibiteurs spécifiques d'hK14. Les séquences qui on été le plus efficacement coupées par hK14 ont été utilisées pour transformer deux types d'inhibiteurs classiques, qui circulent dans notre sang, en inhibiteurs d'hK14 hautement efficaces et spécifiques. Selon les résultats obtenus in vitro, ils pourront être évalués in vivo en tant que traitement potentiel contre le cancer. RESUME Les protéases sont des enzymes impliquées dans des processus physiologiques mais aussi parfois pathologiques. La famille des kallicréines tissulaires humaines représente le plus grand groupe de protéases humaines, dont plusieurs pourraient participer au développement de certaines maladies. D'autre part, ces protéases sont apparues comme des marqueurs de pathogénicité potentiels, notamment dans les cas de cancers hormono-dépendants. La kallicréine humaine 14 a été récemment découverte et son implication dans quelques maladies, particulièrement dans le cas de tumeurs, semble probable. En effet, son expression génique est augmentée au niveau des tissus cancéreux de la prostate et du sein et son expression protéique s'est révélée plus élevée dans le sérum de patientes atteintes d'un cancer du sein ou des ovaires. Cependant, comme c'est le cas pour la plupart des kallicréines, sa fonction est encore inconnue. Afin de mieux connaître son rôle biologique et/ou pathologique, nous avons décidé de caractériser son activité enzymatique. Nous avons tout d'abord mis au point un système de substrats entièrement biologique permettant d'étudier in vitro l'activité des protéases. Ce système est basé sur le phénomène de FRET, à savoir le transfert d'énergie de résonance fluorescente qui intervient entre deux molécules fluorescentes voisines si le spectre d'émission de la protéine donneuse chevauche le spectre d'excitation de la protéine receveuse. Nous avons fusionné de manière covalente une protéine fluorescente bleue (CFP) et une jaune (YFP) en les liant avec diverses séquences. Par clivage de la séquence de liaison, une perte du transfert d'énergie peut être mesurée par un spectrofluoromètre. Cette technologie représente un moyen facile de suivre la réaction d'hydrolyse des protéases. Les conditions optimales de production de ces substrats CFP-YFP ont été déterminées, de même que les paramètres pouvant éventuellement influencer le FRET. Ce système possède une grande résistance à la protéolyse non spécifique et est applicable à un grand nombre de protéase. Contrairement aux substrats fluorogéniques, il permet d'étudier les acides aminés se trouvant des deux côtés du site de clivage. Ce système étant entièrement biologique, il est le reflet des interactions protéine-protéine et représente un outil biologique facile, bon marché et rapide pour caractériser les protéases. Dans un premier temps, hK14 a été mise en présence d' une banque de haute diversité de pentapeptides aléatoires présentée à la surface de phages afin d'identifier des substrats spécifiques. Ensuite, le système CFP-YFP a été employé pour trier les peptides sélectionnés afin d'identifier les séquences de substrats les plus sensibles et spécifiques pour hK14. Nous avons montré, qu'en plus de sa prévisible activité de type trypsine, hK14 possède aussi une très surprenante activité de type chymotrypsine. Les séquences les plus sensibles ont été choisies pour cribler la banque de donnée Swissprot, permettant ainsi l'identification de 6 substrats protéiques humains potentiels pour hK14. Trois d'entre eux, la laminine α-5, le collagène IV et la matriline-4, qui sont des composants de la matrice extracellulaire, ont démontré une grande susceptibilité à l'hydrolyse par hK14. De plus, la séparation éléctrophorétique a montré que la dégradation de la laminine α-5 et de la matriline-4 par hK14 devait se produire aux sites identifiés par la technologie du phage display. Pour terminer, nous avons transformé, par mutagenèse dirigée, deux serpines (inhibiteurs de protéases de type sérine) connues, AAT et ACT (alpha anti-trypsine et alpha anti-chymotrypsine), qui inhibent un vaste éventail d'enzymes humaines en inhibiteurs d'hK14 hautement efficaces et spécifiques. Ces inhibiteurs pourront être utilisés d'une part pour poursuivre certaines expériences permettant de mieux comprendre l'implication d'hK14 dans des voies physiologiques ou dans le cancer et d'autre part pour les évaluer in vivo en tant que traitement potentiel contre le cancer. SUMMARY Proteases consist of enzymes involved in physiological events, but also, in case of dysregulation, in pathogenicity. The human tissue kallikrein family represents the largest human protease cluster and includes several members that either could participate in the course of certain diseases or emerged as potential biological markers, especially in hormone dependent cancers. The human kallikrein 14 has been recently discovered and suggested implications in some disorders, particularly in tumors since its gene expression is up-regulated in prostate and breast cancer tissues and its protein expression increased in the serum of patients with breast and ovarian cancers. However, like most kallikreins, its function remains unknown. To better understand hK14 biological and/or pathological role, we decided to characterize its enzymatic activity. First of all, we developped a biological system suitable for in vitro study of protease activity. This system is based on the so-called FRET phenomenon, that is the Fluorescence Resonance Energy Transfer that occurs between two nearby fluorescent proteins if the emission spectrum of the donor overlaps the excitation spectrum of the acceptor. We fused covalently a cyan fluorescent protein (CFP) and a yellow fluorescent protein (YFP) with diverses sequences. Upon cleavage of the linker sequence by protease, the loss of energy transfer can be measured by a spectrofluorometer allowing an easy following of hydrolysis reaction. The optimal conditions to produce in bacterial system these CFP-YFP substrates were determined as well as the parameters that could eventually influence the FRET. This system demonstrated a high degree of resistance to non-specific proteolysis and applicability to various conditions corresponding to a great number of existing proteases. Other avantages are the possibility to study the amino acids located both sides of the cleavage site as well as the interest to work in a full biological system reflecting protein-protein interaction. A phage substrate library with exhaustive diversity was used prior to CFP-substrate-YFP system to isolate specific human kallikrein 14 substrates. After that the CFP-YFP system was used to sort peptides and identify highly sensitive and specific substrate sequences for hK14. We showed that besides its predictable trypsin-like activity, hK14 also possesses a surprising chymotrypsin-like activity. The screening of the Swissprot database was achieved with the most sensitive sequences and allowed the identification of 6 potential human protein substrates for hK14. Three of them, laminin α-5, collagen IV and matrilin-4, which are components of the extracellular matrix were incubated with hK14, by which they were efficiently hydrolyzed. Moreover, electrophoretic separation revealed that degradation of laminin α-5 and matrilin-4 by hK14 generated fragments with identical molecular size than the predicted N-terminal fragments that would result from hK14 specific cleavage, proving the value of phage display substrate to identify potential substrates. Finally, with site-directed mutagenesis, we transformed two well-known serpins (serine protease inhibitors), AAT and ACT (alpha anti-trypsin and alpha anti-chymotrypsin), which inhibit a vast spectrum of human enzymes into highly efficient and specific hK14 inhibitors. These inhibitors will be used to pursue experiments that could help understand hK14 implication in physiological pathways as well as in cancer biology and also to perform their in vivo evalution as potential cancer treatment.

Antigenic proteins involved in occupational rhinitis and asthma caused by obeche wood (Triplochiton scleroxylon).

BACKGROUND Obeche wood dust is a known cause of occupational asthma where an IgE-mediated mechanism has been demonstrated. OBJECTIVE To characterize the allergenic profile of obeche wood dust and evaluate the reactivity of the proteins by in vitro, ex vivo and in vivo assays in carpenters with confirmed rhinitis and/or asthma MATERIALS AND METHODS An in-house obeche extract was obtained, and two IgE binding bands were purified (24 and 12 kDa) and sequenced by N-terminal identity. Specific IgE and IgG, basophil activation tests and skin prick tests (SPTs) were performed with whole extract and purified proteins. CCD binding was analyzed by ELISA inhibition studies. RESULTS Sixty-two subjects participated: 12 with confirmed occupational asthma/rhinitis (ORA+), 40 asymptomatic exposed (ORA-), and 10 controls. Of the confirmed subjects, 83% had a positive SPT to obeche. There was a 100% recognition by ELISA in symptomatic subjects vs. 30% and 10% in asymptomatic exposed subjects and controls respectively (p<0.05). Two new proteins were purified, a 24 kDa protein identified as a putative thaumatin-like protein and a 12 kDa gamma-expansin. Both showed allergenic activity in vitro, with the putative thaumatin being the most active, with 92% recognition by ELISA and 100% by basophil activation test in ORA+ subjects. Cross-reactivity due to CCD was ruled out in 82% of cases. CONCLUSIONS Two proteins of obeche wood were identified and were recognized by a high percentage of symptomatic subjects and by a small proportion of asymptomatic exposed subjects. Further studies are required to evaluate cross reactivity with other plant allergens.

Sequence polymorphisms in Pvs48/45 and Pvs47 gametocyte and gamete surface proteins in Plasmodium vivax isolated in Korea

Nucleotide sequence analyses of the Pvs48/45 and Pvs47 genes were conducted in 46 malaria patients from the Republic of Korea (ROK) (n = 40) and returning travellers from India (n = 3) and Indonesia (n = 3). The domain structures, which were based on cysteine residue position and secondary protein structure, were similar between Plasmodium vivax (Pvs48/45 and Pvs47) and Plasmodium falciparum (Pfs48/45 and Pfs47). In comparison to the Sal-1 reference strain (Pvs48/45, PVX_083235 and Pvs47, PVX_083240), Korean isolates revealed seven polymorphisms (E35K, H211N, K250N, D335Y, A376T, I380T and K418R) in Pvs48/45. These isolates could be divided into five haplotypes with the two major types having frequencies of 47.5% and 20%, respectivelfy. In Pvs47, 10 polymorphisms (F22L, F24L, K27E, D31N, V230I, M233I, E240D, I262T, I273M and A373V) were found and they could be divided into four haplotypes with one major type having a frequency of 75%. The Pvs48/45 isolates from India showed a unique amino acid substitution site (K26R). Compared to the Sal-1 and ROK isolates, the Pvs47 isolates from travellers returning from India and Indonesia had amino acid substitutions (S57T and I262K). The current data may contribute to the development of the malaria transmission-blocking vaccine in future clinical trials.

Induction of protective T-helper 1 immune responses against Echinococcus granulosus in mice by a multi-T-cell epitope antigen based on five proteins

In this study, we designed an experiment to predict a potential immunodominant T-cell epitope and evaluate the protectivity of this antigen in immunised mice. The T-cell epitopes of the candidate proteins (EgGST, EgA31, Eg95, EgTrp and P14-3-3) were detected using available web-based databases. The synthesised DNA was subcloned into the pET41a+ vector and expressed in Escherichia coli as a fusion to glutathione-S-transferase protein (GST). The resulting chimeric protein was then purified by affinity chromatography. Twenty female C57BL/6 mice were immunised with the antigen emulsified in Freund's adjuvant. Mouse splenocytes were then cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium in the presence of the antigen. The production of interferon-γ was significantly higher in the immunised mice than in the control mice (> 1,300 pg/mL), but interleukin (IL)-10 and IL-4 production was not statistically different between the two groups. In a challenge study in which mice were infected with 500 live protoscolices, a high protectivity level (99.6%) was demonstrated in immunised BALB/C mice compared to the findings in the control groups [GST and adjuvant (Adj) ]. These results demonstrate the successful application of the predicted T-cell epitope in designing a vaccine against Echinococcus granulosus in a mouse model.